Załącznik I

M = maksimum, m = minimum.

[1] [2] [3]

Uwaga:

Jakakolwiek oliwa jest odrzucona, jeśli jedna z właściwości znajduje się poza ustaloną granicą.

Typ | Kwasowość % | Liczba nadtlenkowa meq O2/kg | Chlorowcowe rozpuszczalniki mg/kg [1] | Woski mg/kg | Nasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2 triglicerydu % | Stigma stadieny [2] mg/kg | Erytrodiol + uvaol % | Trilinoleina % | Cholesterol % | Brassikasterol % | Kampesterol % | Stigmaterol % | Betasitosterol [3] % | Deka-7-stigmasterol % | Łącznie sterole mg/kg |

1.Oliwa ekstra z oliwek pierwszego tłoczenia | M 1,0 | M 20 | M 0,20 | M 250 | M 1,3 | M 0,15 | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

2.Oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia | M 2,0 | M 20 | M 0,20 | M 250 | M 1,3 | M 0,15 | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

3.Zwykła oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia | M 3,3 | M 20 | M 0,20 | M 250 | M 1,3 | M 0,15 | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

4.Oliwa z oliwek lampante pierwszego tłoczenia | m 3,3 | m 20 | m 0,20 | M 350 | M 1,3 | M 0,50 | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | — | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

5.Rafinowana oliwa z oliwek | M 0,5 | M 5 | M 0,20 | M 350 | M 1,5 | | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

6.Oliwa z oliwek | M 1,5 | M 15 | M 0,20 | M 350 | M 1,5 | | M 4,5 | M 0,5 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1000 |

7.Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek | m 2,0 | — | — | — | M 1,8 | | m 12 | M 0,7 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | — | m 93,0 | M 0,5 | m 2500 |

8.Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek | M 0,5 | M 5 | M 0,20 | — | M 2,0 | | m 12 | M 0,6 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1800 |

9.Oliwa z wytłoczyn oliwek | M 1,5 | M 15 | M 0,20 | > 350 | M 2,0 | | > 4,5 | M 0,6 | M 0,5 | M 0,1 | M 4,0 | < Kamp. | m 93,0 | M 0,5 | m 1600 |

M = maksimum, m = minimum.

Uwaga:

Oliwa jest odrzucona, jeżeli jakakolwiek właściwość leży poza ustanowioną granicą.

W celu ustalenia czystości, gdzie K270 przekracza granicę dla poszczególnych kategorii, powinno się oznaczyć ponownie po przejściu przez tlenek glinu.

Typ | Mieszanka kwasów | Suma izomerów transkwasuoleinowego | Suma izomerów trans kwasów linolowego i linolenowego % | K232 | K270 | K270 z tlenkiem glinowym | Delta-K | Tablica testów |

Mirystynowy % | Linolenowy % | Arachidowy % | Arachidynowy % | Behenowy % | Lignocerowy % |

1.Oliwa z oliwek ekstra pierwszego tłoczenia | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,05 | M 0,05 | M 2,50 | M 0,20 | M 0,10 | M 0,01 | m 6,5 |

2.Oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,05 | M 0,05 | M 2,60 | M 0,25 | M 0,10 | M 0,01 | m 5,5 |

3.Zwykła oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,05 | M 0,05 | M 2,60 | M 0,25 | M 0,10 | M 0,01 | m 3,5 |

4.Oliwa lampante z oliwek pierwszego tłoczenia | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,10 | M 0,10 | M 3,70 | M 0,25 | M 0,11 | — | < 3,5 |

5.Rafinowana oliwa z oliwek | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,20 | M 0,30 | M 3,40 | M 1,20 | — | M 0,16 | — |

6.Oliwa z oliwek | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,2 | M 0,2 | M 0,20 | M 0,30 | M 3,30 | M 1,00 | — | M 0,13 | — |

7.Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,3 | M 0,2 | M 0,20 | M 0,10 | — | — | — | — | — |

8.Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,3 | M 0,2 | M 0,42 | M 0,35 | M 5,50 | M 2,50 | — | M 0,25 | — |

9.Oliwa z wytłoczyn oliwek | M 0,05 | M 0,9 | M 0,6 | M 0,4 | M 0,3 | M 0,2 | M 0,20 | M 0,35 | M 5,30 | M 2,00 | — | M 0,20 | — |

"

3. Uwaga 5 do zał. VIII otrzymuje brzmienie:

"Uwaga 5:

W celu uzyskania wyraźnego oddzielenia piku trilinolanów od przylegających pików lub jakichkolwiek przeszkadzających substancji, oliwa lampante pierwszego tłoczenia lub surowa oliwa z wytłoczyn oliwek powinna zostać wpierw oczyszczona według następującej metody:

Zaabsorbować 200 μl nierozcieńczonej oliwy do kolumny krzemionkowej do ekstrakcji w układzie ciecz-ciało stałe (typ SEP PAC wypełnienie krzemionkowe Waters nr 51900).

Wymywać triglicerydy przy użyciu 20 ml bezwodnego heksanu do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) nie dłużej niż przez 20 sekund.

Wysuszyć wymyty produkt w strumieniu azotu i rozpuścić w alkoholu izopropylowym lub acetonie (5 ml). Wstrzyknąć 10 do 20 μl do wysokociśnieniowego chromatografu cieczowego. Skład kwasów tłuszczowych oliwy musi być sprawdzona w celu uzyskania pewności, że jest taki sam przed i po oczyszczeniu w zakresie dokładności przyjętej metody analizy."

;

4. Dodaje się zał. XVII w brzmieniu:

"

ZAŁĄCZNIK XVII:

METODA OZNACZANIA STIGMASTADIENÓW W OLEJACH ROŚLINNYCH

1. CEL

oznaczanie stigmastadienów w olejach roślinnych o niskim stężeniu tych węglowodorów, w szczególności w oliwie z oliwek pierwszego tłoczenia i surowej oliwie z wytłoczyn oliwek.

2. ZAKRES

norma może być stosowana do wszystkich olejów roślinnych, chociaż wyniki pomiarów są pewne tylko przy zawartości tych węglowodorów między 0.01 i 4.0 mg/kg. Metoda ta jest szczególnie przydatna do wykrywania obecności rafinowanych olejów roślinnych (z oliwek, wytłoczyn oliwek, słonecznika, palmy itd.) w oliwie z oliwek pierwszego tłoczenia, ponieważ oleje rafinowane zawierają stigmastadieny, a oliwy z pierwszego tłoczenia ich nie zawierają.

3. ZASADA

wyodrębnienie substancji niezmydlających się. Oddzielenie steroidowej frakcji węglowodorowej przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym i analiza przez kapilarną chromatografię gazową.

4. APARATURA

4.1. Kolby 250 ml nadające się do użycia z chłodnicą zwrotną.

4.2. Rozdzielacze o pojemności 200 ml.

4.3. 100 ml kolby okrągłodenne.

4.4. Wyparka obrotowa.

4.5. Szklana kolumna chromatograficzna (o średnicy wewnętrznej 1,5 do 2 cm na 50 cm długości) z teflonowym gwintownikiem oraz zatyczką z waty szklanej lub krążkiem ze spiekanego szkła na dnie. W celu przygotowania kolumny z żelu krzemionkowego wlać heksan do kolumny chromatograficznej na wysokość około 5 cm, a następnie wypełnić zawiesiną żelu krzemionkowego w heksanie (15 g w 40 ml) za pomocą heksanu podzielonego na części. Odstawić do opadnięcia i zakończyć osadzanie, stosując lekkie drgania. Dodać bezwodny siarczan sodowy do wysokości około 0,5 cm, na koniec wymyć nadmiar heksanu.

4.6. Chromatograf gazowy z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym, nastrzyk z dzieleniem strumienia lub zimny nakolumnowy wtryskiwacz i piec programowalny z dokładnością do ± 1 C.

4.7. Kolumna kapilarna ze stopionej krzemionki do chromatografii gazowej (o średnicy wewnętrznej 0,25 lub 0,32 mm na 25 cm długości pokryta 5 %-fenylometylosilikonową fazą, o grubości filmu 0,25 mm.

Uwaga 1:

Można użyć innych kolumn o podobnej lub niższej biegunowości.

4.8. Integrator-rejestrator z trybem integracji dolina-dolina.

4.9. 5-10 μl mikrostrzykawka do chromatografii gazowej z umocowaną na stałe igłą.

4.10. Elektryczny płaszcz grzejny lub gorące miejsce.

5. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być jakości analitycznej, chyba że określono inaczej. Używana woda musi być wodą destylowaną lub wodą o porównywalnym stopniu czystości.

5.1. Heksan lub mieszanina alkanów o przedziale temperatury wrzenia 65 do 70 °C, destylowana w kolumnie rektyfikacyjnej.

Uwaga 2:

Rozpuszczalnik musi być przedestylowany w celu usunięcia zanieczyszczeń.

5.2. 96 % (procent objętościowy) alkoholu etylowego.

5.3. Bezwodny siarczan sodu.

5.4. 10-procentowy alkoholowy roztwór wodorotlenku potasu. Dodać 10 ml wody do 50 g wodorotlenku potasu, wymieszać, a następnie rozpuścić mieszankę w etanolu do 500 ml.

Uwaga 3:

Alkoholowy potaż brązowieje przy przechowywaniu. Powinien być przygotowywany świeży każdego dnia i trzymany w dobrze zakorkowanych butelkach z ciemnego szkła.

5.5. Żel krzemionkowy 60 do chromatografii kolumnowej, siatka 70 do 230 (Merck, nr referencyjny 7734 lub podobny).

Uwaga 4:

Zazwyczaj można używać żelu krzemionkowego prosto z pojemnika bez żadnej obróbki. Jednakże niektóre partie żelu krzemionkowego mogą wykazywać niską aktywność, która daje w rezultacie złe wyniki oddzielania chromatograficznego. W takich okolicznościach należy postąpić w następujący sposób: Aktywować żel krzemionkowy podgrzewając go, przez co najmniej cztery godziny w temp. 550 C. Po podgrzaniu umieścić żel krzemionkowy w eksykatorze na czas stygnięcia, a potem przenieść go do zakorkowanej kolby. Dodać 2 % wody i potrząsać, dopóki wszystkie grudki nie zostaną rozbite, a proszek będzie swobodnie pływał.

Jeżeli któraś partia żelu krzemionkowego daje chromatogramy o interferujących pikach, należy z nim postąpić jak wyżej. Alternatywą może być użycie żelu krzemionkowego 60 o wyjątkowym stopniu czystości (Merck, nr 7754).

5.6. Roztwór podstawowy (200 części na milion, ang. ppm) cholesta-3,5-dienu (Sigma, czystość 99 %) w heksanie (10 mg w 50 ml).

5.7. Roztwór mianowany heksanu cholesta-3,5-dienu w stężeniu 20 części na milion (ppm), otrzymanym przez rozcieńczenie powyższego roztworu.

Uwaga 5:

Roztwory 5.6 i 5.7 są trwałe przez okres czterech miesięcy, jeżeli przechowuje się je w temperaturze niższej niż 4 ° C.

5.8. Roztwór n-nonakozanu w heksanie w stężeniu około 100 części na milion.

5.9. Gaz nośny do chromatografii: hel lub wodór o 99,9990 % czystości.

5.10. Gazy pomocnicze do detektora płomieniowo-jonizacyjnego: wodór o 99,9990 % czystości i oczyszczone powietrze.

6. PROCEDURA

6.1. Przygotowanie substancji niezmydlającej się

6.1.1. Odważyć 20 ± 0.1 g oliwy do 250-ml kolby (4.1), dodać 1 ml roztworu podstawowego cholesta-3,5-dienu (20 μg) i 75 ml 10-procentowego alkoholowego potażu, dopasować chłodnicę zwrotną, i podgrzewać do lekkiego wrzenia przez 30 minut. Zdjąć kolbę z próbką z ognia i odstawić, żeby nieco ostygła (nie wolno dopuścić do zupełnego ostygnięcia, ponieważ próbka zestali się). Dodać 100 ml wody i przenieść roztwór do rozdzielacza (4.2) przy pomocy 100 ml heksanu. Wstrząsać mieszaninę energicznie przez 30 sekund i odstawić do oddzielenia.

Uwaga 6:

Jeśli powstanie zawiesina, która nie zniknie w szybkim czasie, dodać małe ilości alkoholu etylowego.

6.1.2. Przenieść fazę wodną do drugiego rozdzielacza i ponownie ekstrahować za pomocą 100 ml heksanu. Jeszcze raz zlać niższą fazę i wymyć ekstrakty heksanu (połączone w kolejnym rozdzielaczu) trzy razy używając 100 ml mieszaniny etanol-woda (1:1) za każdym razem, dopóki pH nie stanie się obojętne.

6.1.3. Przepuścić roztwór heksanu przez bezwodny siarczan sodowy (50 g), wymyć 20 mililitrami heksanu i odparowywać w wyparce obrotowej w temperaturze 30 ° C pod zmniejszonym ciśnieniem aż do suchości.

6.2. Oddzielenie sterydowej frakcji węglowodorowej

6.2.1. Zebrać pozostałość do kolumny frakcjonującej przy pomocy dwóch 1-ml porcji heksanu, wprowadzić próbkę na kolumnę pozwalając, żeby poziom roztworu obniżył się do górnej powierzchni siarczanu sodowego i rozpocząć wymywanie chromatograficzne heksanem przy prędkości przepływu około 1 ml/min. Odrzucić pierwszych 25-30 ml eluatu, potem zebrać następnych 40 ml frakcji. Po zebraniu przenieść tę frakcję do 100-ml kolb okrągłodennych.

Uwaga 7:

Pierwsza frakcja zawiera węglowodory nasycone (rys 1a), a druga frakcja steroidowe. Dalsze wymywanie daje skwalen i pokrewne związki. W celu uzyskania dobrego oddzielenia węglowodorów nasyconych od steroidowych, niezbędna jest optymalizacja objętości frakcji. W tym celu należy dostosować objętość pierwszej frakcji tak, żeby przy analizowaniu drugiej frakcji piki reprezentujące węglowodory nasycone były niskie (patrz rys. 1c); jeżeli nie pojawiają się one, ale natężenie wzorcowego piku jest niskie, objętość powinna zostać zmniejszona. Zresztą całkowite oddzielenie komponentów pierwszej frakcji od drugiej nie jest potrzebne, ponieważ w czasie analizy przez chromatografię gazową piki nie nakładają się na siebie, jeżeli warunki chromatografii gazowej są takie, jak wskazano w ppkt 6.1.3. Optymalizacja objętości drugiej frakcji nie jest generalnie potrzebna, jako że istnieje dobra separacja z dalszymi składnikami. Niemniej jednak wystąpienie dużego piku przy około 1,5 minuty krótszym czasie retencji niż normalny jest spowodowane przez skwalen i jest oznaką złej separacji.

6.2.2. Odparować drugą frakcję w wyparce obrotowej w temperaturze 30 ° C pod zmniejszonym ciśnieniem do suchości i natychmiast rozpuścić pozostałość w 0,2 ml heksanu. Przechowywać roztwór w lodówce do czasu analizy.

Uwaga 8:

Pozostałości ppkt 6.1.3 i 6.2.2 nie powinny być przechowywane na sucho i w temperaturze pokojowej. Zaraz po otrzymaniu należy dodać rozpuszczalnik, a roztwory przechowywać w lodówce

6.3. Chromatografia gazowa

6.3.1. Warunki pracy podzielonej iniekcji:

- temperatura iniektora: 300 °C,

- temperatura detektora: 320 °C,

- integrator-rejestrator: parametry integracji powinny być ustalone tak, żeby oszacowanie pól było właściwe. Zalecany jest tryb integracji dolina-dolina.

- czułość: około 16 razy większa od minimalnego tłumienia,

- ilość wprowadzonego roztworu: 1 μl,

- temperatury programowania pieca: na wstępie 235 °C przez sześć minut, potem zwiększanie o 2 °C na minutę do 285 °C,

- iniektor z rozdzielaczem przepływu 1:15,

- nośnik: hel lub wodór o ciśnieniu około 120 kPa.

Warunki te muszą być dostosowane do właściwości chromatografu i kolumny, tak, żeby chromatogramy spełniały następujące wymagania: wewnętrzny pik standardowy w ciągu około pięciu minut od czasu podanego w ppkt 6.3.2., wewnętrzny pik standardowy powinien być w co najmniej 80 % pełnej skali.

Układ chromatografii gazowej musi zostać sprawdzony przez wstrzyknięcie mieszanki podstawowego roztworu cholestadienu (5.6) i roztworu n-nonakozanu (5.8). Pik cholesta-3,5-dienu musi pojawić się przed pikiem n-nonakozanu (rys. 1c); jeżeli tak się nie dzieje, można podjąć dwa działania: zmniejszyć temperaturę pieca lub użyć mniej polarnej kolumny.

6.3.2. Identyfikacja piku

Wewnętrzny standardowy pik pojawia się w około 19 minucie, a 3,5-stigmastadien we względnym czasie retencji 1,29 (patrz rys. 1b). 3,5-stigmastadien pojawia się z małymi ilościami izomeru i zazwyczaj oba wymywają się razem jako pojedynczy pik chromatograficzny. Niemniej jednak, jeżeli kolumna jest zbyt polarna lub wykazuje dużą rozdzielczość, izomer może pojawić się jako mały pik przed pikiem stygmasta-3,5-dienu (rys. 2). Aby zagwarantować, że stigmastadieny będą eluowane jako jeden pik, należałoby kolumnę zastąpić kolumną albo mniej polarną albo kolumną o większej średnicy wewnętrznej.

Uwaga 9:

Stigmastadieny odniesienia mogą być otrzymane z analizy jakiegoś rafinowanego oliwy roślinnego przez użycie mniejszej ilości próbki (1 do 2 g). Stigmastadieny dają wystający i łatwo rozpoznawalny pik.

6.3.3. Analiza ilościowa

Zawartość stigmastadienów jest określana według wzoru:

mg/kg stigmastadienów =

A

× M

A

× M

gdzie: | Aspole piku stigmastadienów (jeżeli pik jest rozdzielony na dwa izomery, suma pól tych dwóch pików),Acpole wewnętrznego standardu (cholestadien),Mcmasa standardu dodanego, w mikrogramach,Momasa użytej oliwy, w gramach. |

Granica wykrycia: około 0,01 mg/kg.

"

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

Rysunek 1

Chromatogramy gazowe otrzymane z próbek oliwy z oliwek analizowanych na kapilarnej kolumnie ze stopionej krzemionki (o średnicy wewnętrznej 0.25 mm na 25 m długości) pokrytej 5 % fenylometylosilikonem, o grubości filmu 0,25 μm.

a) Pierwsza frakcja (30 ml) z oliwy pierwszego tłoczenia, oznaczona standardem.

b) Druga frakcja (40 ml) z oliwy z oliwek zawierającej 0,10 mg/kg stigmastadienów.

c) Druga frakcja (40 ml) zawierająca małą porcję pierwszej frakcji.

+++++ TIFF +++++

Chromatogram gazowy otrzymany z próbki rafinowanej oliwy z oliwek analizowanej w kolumnie DB-5, wykazujący obecność izomeru 3,5-stigmastadienu.

[1] Ogólna górna granica dla związków wykrywanych przez detektor wychwytu elektronów. Dla związków wychwyconych oddzielnie górna granicą jest 0,10 mg/kg.

[2] Suma izomerów, które mogą (lub nie) być rozdzielone w kolumnie kapilarnej.

[3] Delta 5–23-stigmastadienol + klerosterol + sitosterol + sitostanol + delta-5- avenosterol + delta-5- 24 stigmastadienol.

--------------------------------------------------