Załącznik II

1. WPROWADZENIE

1.1. Środki ostrożności

Ponieważ na ogół rozmieszczenie mikotoksyn jest niejednorodne, próbki są przygotowywane i specjalnie homogenizowane, ze szczególną starannością.

W przypadku gdy homogenizacja dokonywana jest przez laboratorium, cała próbka otrzymana przez laboratorium jest homogenizowana.

W przypadku analizy aflatoksyn w trakcie wykonywania wszystkich czynności procedury należy, na ile jest to możliwe, unikać światła dziennego, ponieważ pod wpływem promieni ultrafioletowych aflatoksyny ulegają stopniowemu rozkładowi.

1.2. Obliczanie stosunku łupiny do jądra całych orzechów

Najwyższe dopuszczalne poziomy aflatoksyn, ustalone w rozporządzeniu (WE) nr 466/2001 mają zastosowanie do części jadalnej. Poziom aflatoksyn w części jadalnej może zostać oznaczony w następujący sposób:

— próbki orzechów „w łupinach” mogą zostać pozbawione łupin, a poziom aflatoksyn może zostać oznaczony w części jadalnej,

— orzechy „w łupinach” mogą zostać poddane procedurze przygotowywania próbki. Metoda pobierania próbek i analizy obejmuje oszacowanie masy jądra orzecha w próbce zbiorczej. Masa jądra orzecha w próbce zbiorczej jest szacowana po ustaleniu odpowiedniego współczynnika stosunku łupiny orzecha do jądra orzecha w całych orzechach. Wartość tego stosunku wykorzystywana jest do ustalenia masy jądra w próbce luzem, która została poddana procedurom przygotowywania i analizy próbki.

Około 100 orzechów całych pobieranych jest oddzielnie, losowo z partii lub odkładanych jest na bok z każdej próbki zbiorczej. W przypadku każdej próbki laboratoryjnej wartość tego stosunku może zostać określona poprzez zważenie orzechów całych, pozbawienie ich łupin i zważenie oddzielnie części składającej się z łupin i części składającej się z jąder.

Jednakże wartość stosunku łupiny do jądra może zostać ustalona przez laboratorium na podstawie szeregu próbek, a następnie przyjęta do celów dalszych prac analitycznych. W przypadku stwierdzenia, że dana próbka laboratoryjna przekracza dany poziom, wartość stosunku, o którym mowa zostaje ustalona dla tej próbki, przy wykorzystaniu około 100 orzechów, które zostały odłożone.

2. OBRÓBKA PRÓBKI OTRZYMANEJ PRZEZ LABORATORIUM

Każda próbka laboratoryjna jest drobno rozdrobniona i dokładnie mieszana w procesie, co do którego wykazano, że zapewnia uzyskanie pełnej homogenizacji.

W przypadku gdy najwyższy dopuszczalny poziom ma zastosowanie do suchej masy, zawartość produktu w suchej masie oznaczana jest na podstawie części próbki zhomogenizowanej, z zastosowaniem metody, co do której wykazano, że zapewnia dokładne oznaczenie zawartości w suchej masie.

3. KONTRPRÓBKI

Kontrpróbki do celów oznaczenia, handlu (obrona) i jako materiał odniesienia (arbitraż) pobiera się z materiału zhomogenizowanego, o ile nie jest to sprzeczne z przepisami państw członkowskich, dotyczącymi praw operatorów branży żywnościowej.

4. METODY ANALIZY, KTÓRE ZOBOWIĄZANE SĄ STOSOWAĆ LABORATORIA I WYMAGANIA WOBEC LABORATORIÓW KONTROLNYCH

4.1. Definicje

Poniżej przedstawione są najczęściej stosowane definicje, których stosowania należy wymagać od laboratoriów.

r

=

powtarzalność, wartość, której z określonym prawdopodobieństwem (zazwyczaj 95 %) nie powinna przekraczać różnica bezwzględna pomiędzy wynikami dwóch odrębnych oznaczeń, otrzymanymi w warunkach powtarzalności, tzn. tej samej próbki, tego samego wykonawcy, tej samej aparatury, tego samego laboratorium i krótkiego odstępu czasu r = 2,8 × sr.

sr

=

odchylenie standardowe, obliczone na podstawie wyników otrzymanych w warunkach powtarzalności.

RSDr

=

odchylenie standardowe względne, obliczone na podstawie wyników otrzymanych w warunkach powtarzalności [(sr / ) × 100].

R

=

odtwarzalność, wartość, której z określonym prawdopodobieństwem (zazwyczaj 95 %) nie powinna przekraczać różnica bezwzględna pomiędzy wynikami pojedynczego badania, otrzymanymi w warunkach odtwarzalności, tzn. z tego samego materiału, przez wykonawców w różnych laboratoriach, z zastosowaniem znormalizowanej metody oznaczania; R = 2.8 × sR.

sR

=

odchylenie standardowe, obliczone na podstawie wyników otrzymanych w warunkach odtwarzalności.

RSDR

=

odchylenie standardowe względne, obliczone na podstawie wyników otrzymanych w warunkach odtwtarzalności [(sR / ) × 100].

4.2.

Wymagania ogólne

Potwierdzające metody analizy stosowane do celów kontroli żywności muszą być zgodne z przepisami pkt 1 i 2 załącznika III do rozporządzenia (WE) nr 882/2004.

4.3.

Wymagania szczególne

4.3.1.

Wymagania szczególne dotyczące metod potwierdzających

4.3.1.1.

Kryteria skuteczności

Zaleca się, w miarę możliwości i dostępności, stosowanie w pełni zwalidowanych metod potwierdzających (tj. metod zwalidowanych w drodze badań międzylaboratoryjnych dla odpowiednich matryc). Dozwolone jest także stosowanie innych odpowiednich zwalidowanych metod potwierdzających (tj. metod zwalidowanych wewnętrznie na odpowiednich matrycach należących do danej grupy produktów), pod warunkiem że spełniają one kryteria skuteczności określone w poniższych tabelach.

W miarę możliwości walidacja metod zwalidowanych wewnętrznie obejmuje certyfikowany materiał odniesienia.

a) kryteria skuteczności dla aflatoksyn

Kryterium

Zakres stężenia

Wartość zalecana

Najwyższa dopuszczalna wartość

Próba ślepa

Cały

Pomijalnie mała

— Odzysk — aflatoksyna M1

0,01–0,05 μg/kg

60 do 120 %

> 0,05 μg/kg

70 do 110 %

Odzysk — aflatoksyny B1, B2, G1, G2

< 1,0 μg/kg

50 do 120 %

1–10 μg/kg

70 do 110 %

> 10 μg/kg

80 do 110 %

Odtwarzalność RSDR

Cały

Wynika z równania Horwitza (*) (**)

2 × wartość wynikająca z równania Horwitza (*) (**)

Powtarzalność RSDr można obliczyć jako 0,66 × odtwarzalność RSDR dla odpowiedniego stężenia.

Uwaga:

— wartości, które mają zastosowanie zarówno w odniesieniu do aflatoksyny B1, jak i sumy aflatoksyn B1 + B2 + G1 + G2

— jeżeli wymagane jest podanie sumy indywidualnych aflatoksyn B1 + B2 + G1 + G2a, odpowiedź każdej z nich w systemie analitycznym musi być znana albo równoważna;

b) kryteria skuteczności dla ochratoksyny A

Poziom

(w μg/kg)

Ochratoksyna A

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

< 1

≤ 40

≤ 60

50 do 120

≥ 1

≤ 20

≤ 30

70 do 110

c) kryteria skuteczności dla patuliny

Poziom

(w μg/kg)

Patulina

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

< 20

≤ 30

≤ 40

50 do 120

20–50

≤ 20

≤ 30

70 do 105

> 50

≤ 15

≤ 25

75 do 105

d) kryteria skuteczności dla deoksyniwalenolu

Poziom

(w μg/kg)

Deoksyniwalenol

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

> 100 — ≤ 500

≤ 20

≤ 40

60 do 110

> 500

≤ 20

≤ 40

70 do 120

e) kryteria skuteczności dla zearalenonu

Poziom

(w μg/kg)

Zearalenon

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

≤ 50

≤ 40

≤ 50

60 do 120

> 50

≤ 25

≤ 40

70 do 120

f) kryteria skuteczności osobno dla fumonizyny B1 i B2

Poziom

(w μg/kg)

Fumonizyna B1 i B2 osobno

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

≤ 500

≤ 30

≤ 60

60 do 120

> 500

≤ 20

≤ 30

70 do 110

g) kryteria skuteczności osobno dla toksyny T-2 i HT-2

Poziom

(w μg/kg)

Toksyna T-2 i HT-2 osobno

RSDr (w %)

RSDR (w %)

Odzysk (w %)

15–250

≤ 30

≤ 50

60 do 130

> 250

≤ 25

≤ 40

60 do 130

h) kryteria skuteczności dla cytryniny

Poziom

(w μg/kg)

Cytrynina

RSDr (w %)

Zalecane RSDR (w %)

Najwyższe dozwolone RSDR (w %)

Odzysk (w %)

Cały

0,66 × RSDR

Wynika z równania Horwitza (*) (**)

2 × wartość wynikająca z równania Horwitza (*) (**)

70 do 120

i) uwagi do kryteriów skuteczności dla mikotoksyn

— granica wykrywalności stosowanych metod nie jest podana jako wartość precyzji dla odpowiednich stężeń,

— wartość precyzji jest obliczana z równania Horwitza, w szczególności pierwotnego równania Horwitza (dla stężeń 1,2 × 10–7 ≤ C ≤ 0,138) (*) i zmodyfikowanego równania Horwitza (dla stężeń C < 1,2 × 10–7) (**).

— (*) Równanie Horwitza dla stężeń 1,2 × 10–7 ≤ C ≤ 0,138:

RSDR = 2(1-0.5logC)

(Zob. W. Horwitz, L.R. Kamps, K.W. Boyer, J.Assoc.Off.Analy.Chem.,1980, 63, 1344)

(**) Zmodyfikowane równanie Horwitza (*) dla stężeń C < 1,2 × 10–7:

RSDR = 22 %

(Zob. M. Thompson, Analyst, 2000, 125, s. 385–386)

gdzie:

— RSDR jest odchyleniem standardowym względnym, obliczonym na podstawie wyników otrzymanych w warunkach odtwarzalności [(sR/) × 100],

— C jest stężeniem wyrażonym jako stosunek (np. 1 = 100 g/100 g, 0,001 = 1 000 mg/kg).

Jest to wzór na precyzję uogólnioną, którego wynik nie zależy ani od analitu, ani od matrycy, ale w przypadku większości rutynowych metod analizy zależy wyłącznie od stężenia.

4.3.1.2.

Podejście oceny adekwatności

W przypadku metod zwalidowanych wewnętrznie alternatywnie można zastosować podejście oceny adekwatności (

20

), aby ocenić ich przydatność do celów kontroli urzędowej. Metody nadające się do zastosowania w ramach urzędowej kontroli muszą cechować się niepewnością standardową (u) niższą od maksymalnej niepewności standardowej obliczonej przy wykorzystaniu poniższego wzoru:

gdzie:

— Uf jest maksymalną niepewnością standardową (w μg/kg),

— LOD jest granicą wykrywalności metody (w μg/kg),

— α jest stałą wartością liczbową, którą należy stosować w zależności od wartości C. Poszczególne wartości, które należy stosować podane są w tabeli poniżej,

— C jest stężeniem (w μg/kg).

Jeżeli dana metoda analityczna umożliwia otrzymanie wyników z niepewnością pomiaru mniejszą niż maksymalna niepewność standardowa, taką metodę należy uznać za równie odpowiednią, co metoda spełniająca kryteria skuteczności określone w pkt 4.3.1.1.

Tabela

Wartości liczbowe, które należy stosować dla α jako stałej we wzorze przedstawionym w niniejszym punkcie, w zależności od stężenia

C (w μg/kg)

α

≤ 50

0,2

51–500

0,18

501–1 000

0,15

1 001–10 000

0,12

> 10 000

0,1

4.3.2.

Wymagania szczególne dotyczące półilościowych metod przesiewowych

4.3.2.1.

Zakres stosowania

Zakres stosowania odnosi się do metod bioanalitycznych opartych na rozpoznaniu immunologicznym lub wiązaniu z receptorem (np. test ELISA, testy paskowe, urządzenia „lateral flow”, immunoczujniki) i metod fizykochemicznych opartych na chromatografii lub bezpośredniego wykrywania metodą spektrometrii mas (np. spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym). Inne metody (np. chromatografia cienkowarstwowa) nie są wykluczone, pod warunkiem że generowane sygnały odnoszą się bezpośrednio do danych mikotoksyn i pozwalają na zastosowanie zasady opisanej poniżej.

Wymagania szczególne mają zastosowanie do metod, których wynikiem jest wartość numeryczna, np. (względna) odpowiedź z czytnika testu paskowego, sygnał z chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas itp., oraz przy zastosowaniu normalnych zasad statystycznych.

Wymagania te nie mają zastosowania do metod, które nie dają wartości numerycznych (np. jedynie linię, która jest obecna albo nie) i wymagają innego podejścia do walidacji. Wymagania szczególne dotyczące tych metod są określone w pkt 4.3.3.

Niniejszy dokument opisuje procedury walidacji metod przesiewowych za pomocą walidacji międzylaboratoryjnej, kontroli skuteczności metody zwalidowanej za pomocą procedury międzylaboratoryjnej oraz walidacji metod przesiewowych przez jedno laboratorium.

4.3.2.2.

Terminologia

Przesiewowe stężenie docelowe („screening target concentration” — STC): określone stężenie wykrycia mikotoksyn w próbce. Jeżeli celem jest zbadanie zgodności z przepisami, przesiewowe stężenie docelowe jest równe obowiązującemu najwyższemu dopuszczalnemu poziomowi. Do innych celów lub w przypadkach, gdy nie ustanowiono najwyższego dopuszczalnego poziomu, przesiewowe stężenie docelowe jest określane z góry przez laboratorium.

Metoda przesiewowa: oznacza metodę stosowaną do wyboru próbek o poziomach mikotoksyn z określoną pewnością przekraczających przesiewowe stężenie docelowe. Do celów badań przesiewowych mikotoksyn za adekwatną uznaje się pewność w wysokości 95 %. Wynik analizy przesiewowej jest „ujemny” lub „podejrzany”. Metody przesiewowe muszą pozwalać na oszczędną i wysoką przepustowość w zakresie badania próbek i zwiększać w ten sposób szansę wykrycia nowych incydentów o wysokim stopniu narażenia i ryzyku dla zdrowia konsumentów. Metody te opierają się na metodach bioanalitycznych, chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wyniki z próbek przekraczających wartość graniczną sprawdza się za pomocą pełnej ponownej analizy pierwotnej próbki z zastosowaniem metody potwierdzającej.

„Próbka ujemna” oznacza, że zawartość mikotoksyn w danej próbce jest < STC przy pewności wynoszącej 95 % (tj. istnieje 5 % prawdopodobieństwa, że próbki będą niewłaściwie zgłaszane jako ujemne).

„Próbka fałszywie ujemna” oznacza, że zawartość mikotoksyn w danej próbce jest > STC, ale została ona zidentyfikowana jako ujemna.

„Próbka podejrzana” (przesiew dodatni) oznacza, że próbka przekracza poziom graniczny (zob. poniżej) i może zawierać wyższy poziom mikotoksyn niż STC. Każdy podejrzany wynik powoduje zastosowanie analizy potwierdzającej w celu jednoznacznej identyfikacji i oznaczenia ilościowego mikotoksyny.

„Próbka fałszywie podejrzana” jest próbką ujemną, która została zidentyfikowana jako podejrzana.

„Metody potwierdzające” oznaczają metody, które dają pełne lub uzupełniające informacje umożliwiające identyfikację i oznaczenie ilościowe mikotoksyn w sposób jednoznaczny na poziomie zainteresowania.

Poziom graniczny: odpowiedź, sygnał lub stężenie uzyskane przy pomocy metody przesiewowej, powyżej którego próbka jest klasyfikowana jako „podejrzana”. Poziom graniczny jest określany podczas walidacji i uwzględnia zmienność pomiarów.

Próba kontrolna ujemna (matrycy zerowej): próbka, o której wiadomo, że jest wolna (

21

) od mikotoksyny, której ma dotyczyć badanie przesiewowe, np. na podstawie uprzedniego oznaczania przy użyciu metody potwierdzającej o wystarczającej czułości. Jeśli nie można uzyskać ślepej próby, można wykorzystać materiał o najniższym możliwym do uzyskania poziomie, o ile poziom ten pozwala na wyciągnięcie wniosku, że dana metoda przesiewowa jest adekwatna.

Próba kontrolna dodatnia: próbka zawierająca mikotoksynę w przesiewowym stężeniu docelowym, np. certyfikowany materiał odniesienia, materiał o znanej zawartości (np. badany materiał badania biegłości) lub materiał w inny sposób w wystarczającym stopniu scharakteryzowany przy pomocy metody potwierdzającej. W razie braku takich materiałów można wykorzystać mieszaninę próbek o różnych poziomach zanieczyszczenia lub próbkę wzbogaconą przygotowaną w laboratorium i w wystarczającym stopniu scharakteryzowaną, pod warunkiem że można dowieść, że poziom zanieczyszczenia został sprawdzony.

4.3.2.3.

Procedura walidacji

Celem walidacji jest wykazanie zgodności z przeznaczeniem metody przesiewowej. Robi się to poprzez określenie wartości granicznej oraz określenie odsetka wyników fałszywie ujemnych i fałszywie podejrzanych. W tych dwóch parametrach uwzględnione są parametry skuteczności, takie jak czułość, selektywność i precyzja.

Metody przesiewowe mogą być walidowane za pomocą walidacji międzylaboratoryjnej lub walidacji przez jedno laboratorium. Jeżeli dla określonej kombinacji mikotoksyna/matryca/STC dostępne są już dane dotyczące walidacji międzylaboratoryjnej, wystarczające jest zweryfikowanie skuteczności tej metody w laboratorium ją stosującym.

4.3.2.3.1. Wstępna walidacja przez jedno laboratorium

Mikotoksyny:

Walidację przeprowadza się dla każdej indywidualnej mikotoksyny objętej zakresem. W przypadku metod bioanalitycznych, które dają łączną odpowiedź dla pewnej grupy mikotoksyn (np. aflatoksyn B1, B2, G1 i G2; fumonizyn B1 i B2), należy wykazać ich zastosowanie oraz wspomnieć o ograniczeniach badania w zakresie metody. Uznaje się, że niepożądana reakcja krzyżowa (np. DON-3-glikozyd, 3- lub 15-acetylo-DON przy metodach immunologicznych w odniesieniu do DON) nie zwiększa odsetka wyników fałszywie ujemnych dla docelowych mikotoksyn, ale może zwiększać odsetek wyników fałszywie podejrzanych. Ten niepożądany wzrost można zmniejszyć przy pomocy analizy potwierdzającej w celu jednoznacznej identyfikacji i oznaczania ilościowego mikotoksyn.

Matryce:

Wstępną walidację należy przeprowadzić dla każdego produktu lub, jeżeli o danej metodzie wiadomo, że ma zastosowanie do wielu produktów, dla każdej grupy produktów. W tym drugim przypadku z danej grupy wybiera się jeden reprezentatywny i odpowiedni produkt.

Zestaw próbek:

Minimalna liczba różnych próbek wymaganych do walidacji wynosi 20 jednorodnych prób kontrolnych ujemnych i 20 jednorodnych prób kontrolnych dodatnich, które zawierają mikotoksynę w stężeniu STC, poddanych w warunkach precyzji pośredniej (RSDRi) analizie rozłożonej na 5 różnych dni. Do zestawu walidacyjnego można dodać dodatkowe zestawy 20 prób zawierających mikotoksynę na innych poziomach, aby dowiedzieć się, do jakiego stopnia dana metoda umożliwia rozróżnienie między różnymi stężeniami mikotoksyn.

Stężenie:

Dla każdego STC, które ma być wykorzystane do rutynowego zastosowania, musi zostać przeprowadzona walidacja.

4.3.2.3.2. Wstępna walidacja w drodze badań międzylaboratoryjnych

Walidację w drodze badań międzylaboratoryjnych przeprowadza się zgodnie z uznanym na szczeblu międzynarodowym protokołem dotyczącym badań międzylaboratoryjnych (np. ISO 5725:1994 lub „IUPAC International Harmonised Protocol”), który wymaga włączenia ważnych danych z co najmniej ośmiu różnych laboratoriów. Poza tym jedyną różnicą w porównaniu do walidacji przez jedno laboratorium jest fakt, że ≥ 20 próbek na produkt/poziom musi zostać równomiernie rozdzielonych pomiędzy uczestniczące laboratoria, przy czym na jedno laboratorium przypadają przynajmniej dwie próbki.

4.3.2.4.

Określanie poziomu granicznego i odsetka wyników fałszywie podejrzanych próby ślepej

(Względne) odpowiedzi próby kontrolnej ujemnej i próby kontrolnej dodatniej przyjmuje się za podstawę obliczenia wymaganych parametrów.

Metody przesiewowe o odpowiedzi proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn

Do metod przesiewowych o odpowiedzi proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn zastosowanie ma, co następuje:

Wartość graniczna = RSTC — wartość t0,05 *SDSTC

RSTC =średnia odpowiedź próby kontrolnej dodatniej (przy STC)

wartość t:jednostronna wartość t dla odsetka wyników fałszywie ujemnych w wysokości 5 % (zob. tabela B)

SDSTC =odchylenie standardowe

Metody przesiewowe o odpowiedzi odwrotnie proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn

Podobnie dla metod przesiewowych o odpowiedzi odwrotnie proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn wartość graniczną określa się jako:

wartość graniczna = RSTC + wartość t0,05 *SDSTC

Przy stosowaniu tej szczególne wartości t do określenia wartości granicznej odsetek wyników fałszywie ujemnych jest domyślnie ustalony na poziomie 5 %.

Ocena adekwatności

Wyniki z próby kontrolnej ujemnej wykorzystuje się do oszacowania odpowiadającego odsetka wyników fałszywie podejrzanych. Wartość t oblicza się tak, by odpowiadała sytuacji, gdy wynik z próby kontrolnej ujemnej jest powyżej wartości granicznej, a zatem jest błędnie klasyfikowany jako podejrzany.

wartość t = (wartość graniczna — średniaślepa próba)/SDślepa próba

dla metod przesiewowych o odpowiedzi proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn

lub

wartość t = (średnia

ślepa próba — wartość graniczna)/SDślepa próba

dla metod przesiewowych o odpowiedzi odwrotnie proporcjonalnej do stężenia mikotoksyn

Z uzyskanej wartości t, na podstawie stopni swobody obliczonych z szeregu eksperymentów, prawdopodobieństwo próbek fałszywie podejrzanych przy jednostronnej dystrybucji może zostać obliczone (np. funkcja TDIST w arkuszu kalkulacyjnym) lub uzyskane z tabeli dystrybucji t.

Odpowiednia wartość jednostronnej dystrybucji t określa odsetek wyników fałszywie podejrzanych.

Koncepcja ta jest szczegółowo opisana wraz z przykładem w „Analytical and Bioanalytical Chemistry” DOI 10.1007/s00216 -013-6922-1.

4.3.2.5.

Rozszerzenie zakresu stosowania metody

4.3.2.5.1. Rozszerzenie zakresu na inne mikotoksyny:

Gdy do zakresu istniejącej metody przesiewowej dodaje się nowe mikotoksyny, wymagana jest pełna walidacja, aby wykazać przydatność danej metody.

4.3.2.5.2. Rozszerzenie na inne produkty:

Jeśli metoda przesiewowa ma — zgodnie z wiedzą lub oczekiwaniami — zastosowanie do innych produktów, należy zweryfikować jej trafność w odniesieniu do tych innych produktów. Jeśli nowy produkt należy do grupy produktów (zob. tabela A), dla których przeprowadzono już wstępną walidację, wystarczająca jest dodatkowa walidacja o ograniczonym zakresie. W tym celu poddaje się analizie w warunkach precyzji pośredniej co najmniej 10 jednorodnych prób kontrolnych ujemnych i 10 jednorodnych prób kontrolnych dodatnich (przy STC). Wszystkie próby kontrolne dodatnie muszą być powyżej wartości granicznej. Jeśli kryterium to nie zostało spełnione, wymagana jest pełna walidacja.

4.3.2.6.

Weryfikacja metod już zwalidowanych za pomocą badań międzylaboratoryjnych

W przypadku metod przesiewowych, które zostały już pomyślnie zwalidowane w drodze badań międzylaboratoryjnych, skuteczność metody musi zostać zweryfikowana. W tym celu poddaje się analizie w warunkach precyzji pośredniej co najmniej 6 prób kontrolnych ujemnych i 6 prób kontrolnych dodatnich (przy STC). Wszystkie próby kontrolne dodatnie muszą być powyżej wartości granicznej. Jeśli kryterium to nie zostało spełnione, laboratorium musi przeprowadzić analizę przyczyn w celu określenia, dlaczego nie może spełnić specyfikacji uzyskanej w ramach badania międzylaboratoryjnego. Dopiero po podjęciu działań naprawczych przeprowadza ono ponowną weryfikację skuteczności metody w laboratorium. Jeśli laboratorium nie jest w stanie zweryfikować wyników z badań międzylaboratoryjnych, będzie musiało ustalić własną wartość graniczną w ramach pełnej walidacji w jednym laboratorium.

4.3.2.7.

Ciągła weryfikacja metody/bieżąca walidacja metody

Po wstępnej walidacji uzyskuje się dodatkowe dane dotyczące walidacji poprzez włączenie przynajmniej dwóch prób kontrolnych dodatnich dla każdej partii próbek poddawanych badaniu przesiewowemu. Jedna próba kontrolna dodatnia jest próbą znaną (np. wykorzystaną podczas wstępnej walidacji), a druga jest innym produktem z tej samej grupy produktów (jeśli analizowany jest tylko jeden produkt, wykorzystuje się zamiast tego inną próbę tego produktu). Włączenie próby kontrolnej ujemnej jest fakultatywne. Wyniki uzyskane dla dwóch prób kontrolnych dodatnich dodaje się do istniejącego zestawu walidacyjnego.

Co najmniej raz do roku wartość graniczną ustala się od nowa a wiarygodność tej metody poddaje się ponownej ocenie. Ciągła weryfikacja metody ma kilka celów:

— kontrolę jakości partii próbek poddanej badaniu przesiewowemu,

— dostarczenie informacji na temat stabilności metody w warunkach laboratorium, które ją stosuje,

— uzasadnienie stosowania metody do różnych produktów,

— pozwolenie na dostosowanie wartości granicznych w przypadku stopniowych przesunięć wraz z upływem czasu.

4.3.2.8.

Sprawozdanie z walidacji

Sprawozdanie z walidacji zawiera:

— wskazanie STC,

— wskazanie uzyskanej wartości granicznej.

Uwaga: Wartość graniczna musi mieć tyle samo znaczących cyfr, co STC. Wartości liczbowe wykorzystane do obliczenia wartości granicznej muszą mieć co najmniej jedną znaczącą cyfrę więcej niż STC.

— wskazanie obliczonego odsetka wyników fałszywie podejrzanych,

— wskazanie, w jaki sposób obliczono odsetek wyników fałszywie podejrzanych.

Uwaga: Wskazanie obliczonego odsetka wyników fałszywie podejrzanych pokazuje, czy metoda jest adekwatna, ponieważ określa liczbę ślepych prób (lub prób o niskim poziomie zanieczyszczenia), które będą podlegały weryfikacji.

Tabela A

Grupy produktów do walidacji metod przesiewowych

Grupy produktów

Kategorie produktów

Typowe reprezentatywne produkty włączone do tej kategorii

Wysoka zawartość wody

Soki owocowe

Sok jabłkowy, sok winogronowy

Napoje alkoholowe

Wino, piwo, cydr

Warzywa korzeniowe i bulwiaste

Świeży imbir

Przeciery na bazie zbóż lub owoców

Przeciery przeznaczone dla niemowląt lub małych dzieci

Wysoka zawartość oleju

Orzechy z drzew orzechowych

Orzech włoski, orzech laskowy, kasztan jadalny

Nasiona oleiste i produkty z nich

Rzepak oleisty, słonecznik, nasiona bawełny, nasiona soi, orzechy ziemne, sezam itp.

Owoce oleiste i produkty z nich

Oleje i pasty (np. masło orzechowe, tahina)

Wysoka zawartość skrobi lub białka i niska zawartość wody i tłuszczu

Ziarna zbóż i produkty z nich

Pszenica, żyto, jęczmień; kukurydza, ryż, owies Chleb pełnoziarnisty, chleb biały, krakersy, śniadaniowe przetwory zbożowe, makarony

Produkty dietetyczne

Suche proszki do przygotowywania żywności dla niemowląt i małych dzieci

Wysoka zawartość kwasu i wysoka zawartość wody (1)

Produkty z cytrusów

„Trudne lub szczególne produkty” (2)

Ziarna kakaowe i produkty z nich, kopra i produkty z niej,

kawa, herbata

Przyprawy, lukrecja

Wysoka zawartość cukru i niska zawartość wody

Owoce suszone

Figi, rodzynki, porzeczki, sułtanki

Mleko i przetwory mleczne

Mleko

Mleko krowie, kozie i bawole

Ser

Ser krowi i kozi

Produkty mleczarskie (np. mleko w proszku)

Jogurt, śmietana

(1) Jeżeli do stabilizacji zmian pH na etapie ekstrakcji stosowany jest bufor, ta grupa produktów może zostać połączona w jedną grupę produktów „Wysoka zawartość wody”.

(2) „Trudne lub szczególne produkty” powinny być w pełni walidowane, jedynie jeśli są często poddawane analizie. Jeśli są one jedynie okazjonalnie poddawane analizie, walidacja może zostać ograniczona do sprawdzenia poziomów zgłaszania z zastosowaniem ekstraktu ślepej próbki wzbogaconej.

Tabela B

Jednostronna wartość t dla odsetka wyników fałszywie ujemnych wynoszącego 5 %

Stopnie swobody

Liczba replikacji

Wartość t (5 %)

10

11

1,812

11

12

1,796

12

13

1,782

13

14

1,771

14

15

1,761

15

16

1,753

16

17

1,746

17

18

1,74

18

19

1,734

19

20

1,729

20

21

1,725

21

22

1,721

22

23

1,717

23

24

1,714

24

25

1,711

25

26

1,708

26

27

1,706

27

28

1,703

28

29

1,701

29

30

1,699

30

31

1,697

40

41

1,684

60

61

1,671

120

121

1,658

∞

∞

1,645

4.3.3.

Wymagania dotyczące jakościowych metod przesiewowych (metod, które nie dają wartości numerycznych)

Opracowanie wytycznych walidacyjnych dla metod testów binarnych jest obecnie przedmiotem prac różnych organów normalizacyjnych (np. AOAC, ISO). AOAC opracowało niedawno wytyczne w tej sprawie. Można uznać, że dokument ten przedstawia aktualny stan wiedzy w tej dziedzinie. Zatem metody, które dają binarne wyniki (np. oględziny testów paskowych), powinny być walidowane zgodnie z tymi wytycznymi.

http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_Docs/ISPAM/Qual_Chem_Guideline_Final_Approved_031412.pdf

4.4.

Szacowanie niepewności pomiaru, obliczanie odzysku i podawanie wyników (

22

)

4.4.1.

Metody potwierdzające

Wynik analityczny musi zostać podany w następujący sposób:

a) w postaci skorygowanej o wartość odzysku, przy czym poziom odzysku należy wskazać. Korekta o wartość odzysku nie jest konieczna, jeśli stopień odzysku wynosi 90–110 %;

b) jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %.

W przypadku żywności pochodzenia zwierzęcego niepewność pomiaru może zostać uwzględniona poprzez ustalenie decyzyjnej wartości granicznej (CCα), zgodnie z decyzją Komisji 2002/657/WE (

23

) (pkt 3.1.2.5 załącznika I — przypadek substancji, dla których ustalono dopuszczalną wartość graniczną).

Jeżeli wynik analizy jest jednak znacznie (o > 50 %) niższy niż najwyższy dopuszczalny poziom lub dużo wyższy niż najwyższy dopuszczalny poziom (tj. 5 razy wyższy niż najwyższy dopuszczalny poziom) oraz pod warunkiem że stosowane są odpowiednie procedury w zakresie jakości, a analiza wykonywana jest jedynie do celów sprawdzenia zgodności z przepisami prawa, wynik analizy można podać bez korekty na odzysk; w takim przypadku można pominąć podawanie stopnia odzysku i niepewności pomiaru.

Obowiązujące zasady interpretacji wyników analitycznych w świetle przyjęcia lub odrzucenia partii mają zastosowanie do wyników analitycznych otrzymanych na próbce do celów urzędowej kontroli. W przypadku analizy do celów obrony lub arbitrażu zastosowanie mają przepisy krajowe.

4.4.2.

Metody przesiewowe

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako zgodny lub podejrzewany o niezgodność.

„Podejrzewany o niezgodność” oznacza, że próbka przekracza poziom graniczny i może zawierać wyższy poziom mikotoksyn niż STC. Każdy podejrzany wynik powoduje zastosowanie analizy potwierdzającej w celu jednoznacznej identyfikacji i oznaczenia ilościowego mikotoksyny.

„Zgodny” oznacza, że zawartość mikotoksyn w próbce jest < STC przy pewności wynoszącej 95 % (tj. istnieje 5 % prawdopodobieństwa, że próbki będą niewłaściwie zgłaszane jako ujemne). Wynik analizy przedstawia się jako „< poziom STC” wraz z określeniem poziomu STC.

4.5. Laboratoryjne normy jakości

Laboratorium musi przestrzegać przepisów art. 12 rozporządzenia (WE) nr 882/2004 w sprawie kontroli urzędowych przeprowadzanych w celu sprawdzenia zgodności z prawem paszowym i żywnościowym oraz regułami dotyczącymi zdrowia zwierząt i dobrostanu zwierząt (

24

).

(

1

) Dz.U. L 165 z 30.4.2004, s. 1; sprostowanie w Dz.U. L 191 z 28.5.2004, s. 1.

(

2

) Dz.U. L 77 z 16.3.2001, s. 1. Rozporządzenie ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 199/2006 (Dz.U. L 32 z 4.2.2006, s. 34).

(

3

) Dz.U. L 201 z 17.7.1998, s. 93. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą 2004/43/WE (Dz.U. L 113 z 20.4.2004, s. 14).

(

4

) Dz.U. L 75 z 16.3.2002, s. 38. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą 2005/5/WE (Dz.U. L 27 z 29.1.2005, s. 38).

(

5

) Dz.U. L 203 z 12.8.2003, s. 40.

(

6

) Dz.U. L 143 z 7.6.2005, s. 18.

(

7

) Dz.U. L 143 z 7.6.2005, s. 3.

(

8

) Dokument zawierający wytyczne przeznaczone dla właściwych organów w sprawie kontroli zgodności z prawodawstwem UE w odniesieniu do aflatoksyn dostępny jest na stronie internetowej: http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/aflatoxin_guidance_en.pdf. Dokument ten zawiera dodatkowe informacje praktyczne, ale informacje w nim zawarte podlegają przepisom niniejszego rozporządzenia.

(

9

) Pobieranie próbek z takich partii przeprowadza się zgodnie z zasadami określonymi w części L. Wytyczne dotyczące pobierania próbek z dużych partii są określone w dokumencie dostępnym na stronie internetowej: http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/contaminants/guidance-sampling-final.pdf

Stosowanie zasad pobierania próbek zgodnie z normą ISO 24333:2009 lub zasadami pobierania próbek GAFTA 124 przez podmioty prowadzące przedsiębiorstwo spożywcze w celu zapewnienia zgodności z przepisami prawa jest równoważne z zasadami pobierania próbek określonymi w części L.

W odniesieniu do pobierania próbek toksyn Fusarium stosowanie zasad pobierania próbek zgodnie z normą ISO 24333:2009 lub zasadami pobierania próbek GAFTA 124 przez podmioty prowadzące przedsiębiorstwo spożywcze w celu zapewnienia zgodności z przepisami prawa jest równoważne z zasadami pobierania próbek określonymi w części B.

(

10

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że niemożliwe jest uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

11

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg nie jest możliwe, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

12

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że niemożliwe jest uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

13

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o masie 0,5 kg nie jest możliwe, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 0,5 kg.

(

14

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg nie jest możliwe, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

15

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że niemożliwe jest uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

16

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o objętości 1 litra nie jest możliwe, objętość próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 litr.

(

17

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg nie jest możliwe, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

18

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg nie jest możliwe, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

19

) W przypadku gdy część, z której należy pobrać próbki, jest tak mała, że niemożliwe jest uzyskanie próbki zbiorczej o masie 1 kg, masa próbki zbiorczej może być mniejsza niż 1 kg.

(

20

) Zob. M. Thompson and R. Wood, Accred. Qual. Assur., 2006, 10, s. 471-478.

(

21

) Próbki uznaje się za wolne od analitu, jeśli ilość obecna w próbce nie przekracza 1/5 STC. Jeżeli poziom może zostać oznaczony ilościowo przy zastosowaniu metody potwierdzającej, poziom ten musi zostać uwzględniony przy ocenie walidacji.

(

22

) Więcej informacji na temat szacowania niepewności pomiaru oraz procedur oceny odzysku można znaleźć w sprawozdaniu pod tytułem „Report on the relationship between analytical results, measurement uncertainty, recovery factors and the provisions of EU food and feed legislation” („Raport na temat relacji między wynikami analiz, niepewnością pomiaru, współczynnikami odzysku a przepisami prawodawstwa UE dotyczącego żywności i paszy”) — http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/contaminants/report-sampling_analysis_2004_en.pdf

(

23

) Decyzja Komisji 2002/657/WE z dnia 14 sierpnia 2002 r. wykonująca dyrektywę Rady 96/23/WE dotyczącą wyników metod analitycznych i ich interpretacji (Dz.U. L 221 z 17.8.2002, s. 8).

(

24

) Patrz również: środki przejściowe określone w art. 18 rozporządzenia Komisji (WE) nr 2076/2005 z dnia 5 grudnia 2005 r. ustanawiającego środki przejściowe do celów wdrożenia rozporządzeń (WE) nr 853/2004, nr 854/2004 i nr 882/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady oraz zmieniające rozporządzenia (WE) nr 853/2004 i (WE) nr 854/2004 (Dz.U. L 338 z 22.12.2005, s. 83).