Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z dnia 30 maja 2008 r. ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)

Załącznik 2

W mocy

PRZYKŁADY WŁAŚCIWEJ REGENEROWANEJ WODY DO BADANIA

Woda do badania ISO (1)

Roztwory podstawowe (pojedyncza substancja)

W celu przygotowania zregenerowanej wody dodać następujące objętości roztworów podstawowych do 1 litra wody (*1)

Substancja

Ilość dodawana do 1 litra wody (*1)

Chlorek wapnia

CaCl2, 2H2O

11,76 g

25 ml

Siarczan magnezu

MgSO4, 7H2O

4,93 g

25 ml

Wodorowęglan sodu

NaHCO3

2,59 g

25 ml

Chlorek potasu

KC1

0,23 g

25 ml

Pożywki Elendta M7 i M4

Aklimatyzacja do pożywek Elendta M4 i M7

W niektórych laboratoriach napotkano trudności przy przenoszeniu rozwielitek do pożywek M4 i M7. Osiągnięto jednak pewne pomyślne wyniki, stosując aklimatyzację stopniową, tzn. przenosząc rozwielitki z własnej pożywki do 30 % roztworu, następnie do 60 %, a później 100 % roztworu Elendta. Konieczne może być stosowanie okresu aklimatyzacji nawet przez miesiąc.

Przygotowanie

Pierwiastki śladowe

Najpierw przygotowuje się osobne roztwory podstawowe (I) poszczególnych pierwiastków śladowych w wodzie o odpowiedniej czystości, np. dejonizowanej, destylowanej lub poddanej osmozie odwróconej. Z poszczególnych roztworów podstawowych (I) przygotowywany jest drugi, pojedynczy, roztwór podstawowy (II), który zawiera wszystkie elementy śladowe (roztwór łączony), tj.:

Roztwor podstawowy (pojedyncza substancja)

Ilość dodana do wody (mg/l)

Stężenie (odnoszące się do pożywki M4)

W celu przygotowania kombinowanego roztworu II dodaċ następujące ilości roztworu podstawowego I do wody (ml/1)

H3 BO3

57 190

20 000 -krotne

1,0

0,25

MnCl2.4H2O

7 210

20 000 -krotne

1,0

0,25

LiCl

6 120

20 000 -krotne

1,0

0,25

RbCl

1 420

20 000 -krotne

1,0

0,25

SrCl2.6H2O

3 040

20 000 -krotne

1,0

0,25

NaBr

320

20 000 -krotne

1,0

0,25

Na2MoO4.2H2O

1 230

20 000 -krotne

1,0

0,25

CuCl2.2H2O

335

20 000 -krotne

1,0

0,25

ZnCl2

260

20 000 -krotne

1,0

CoCl2.6H2O

200

20 000 -krotne

1,0

20 000 -krotne

1,0

Na2 SeO3

43,8

20 000 -krotne

1,0

NH4VO3

11,5

20 000 -krotne

1,0

Na2 EDTA.2H2O

5 000

2 000 -krotne

— —

FeS04.7H2O

1 991

2 000 -krotne

— —

Zarowno roztwor Na 2 EDTA jak i FeSO4 są przygotowywane oddzielnie, zlevane razem i niezwłocznie umieszczane w autoklawie.

Daje to:

roztwor 21 Fe-EDT

1 000 -krotne

20,0

5,0

Pożywki M4 i M7

Pożywki M4 i M7 są przygotowywane przy użyciu roztworu podstawowego II, makroskładników i witamin w następujący sposób:

Ilość dodana do wody (mg/l)

Stężenie (odnoszące się do pożywki M4)

Ilość roztworu p odstawowego II dodanego w celu otrzymania pożywkki (ml/1)

Roztwor podstawowy II (połączone pierwiastki śladowe)

20-krotne

Roztwory podstawowe makroskładników (pojedyncza substancja)

CaCl2 • 2H2O

293 800

1 000 -krotne

1,0

MgS04 • 7H2O

246 600

2 000 -krotne

0,5

KCl

58 000

10 000 -krotne

0,1

NaHCO3

64 800

1 000 -krotne

1,0

Na2 SiO3 • 9H2O

50 000

5 000 -krotne

0,2

NaNO3

2 740

10 000 -krotne

0,1

KH2PO4

1 430

10 000 -krotne

0,1

K2HPO4

1 840

10 000 -krotne

0,1

Łączony roztwór podstawowy witamin

— 10 000 -krotne

0,1

Łączony roztwor podstawowy witamin przygotowuje się przez dodanie 3 witamin do 1 litra wody, jak przedstawiono poniżej.

Hydrochlorek tiaminy

750

10 000 -krotne

Cyjanokobalami na (B12)

10 000 -krotne

Biotyna

7,5

10 000 -krotne

Roztwór podstawowy złożony z witamin jest przechowywany zamrożony w niewielkich alikwotach. Witaminy są dodawane do pożywki na krótko przed użyciem.

UWAGA

Aby uniknąć wytrącania się soli w czasie przygotowywania kompletnych pożywek, dodać alikwoty roztworów podstawowych do około 500–800 ml dejonizowanej wody, a następnie uzupełnić do 1 litra.

UWAGA

Informacje o pierwszej publikacji na temat pożywki M4 można znaleźć w pracy Elendt B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.

C.3. BADANIE INHIBICJI GLONÓW

1. METODA

1.1. WPROWADZENIE

Celem niniejszego badania jest oznaczenie wpływu substancji na wzrost gatunków jednokomórkowych glonów zielonych. Względnie szybkie (72 godziny) badania mogą oszacować wpływy na niektóre generacje. Niniejsza metoda może być zaadoptowana do użycia niektórych gatunków jednokomórkowych glonów, w przypadku których opis zastosowanej metody musi być przedstawiony w raporcie z badań.

Niniejsza metoda jest łatwo stosowana do substancji rozpuszczalnych w wodzie, które zgodnie z warunkami badania prawdopodobnie pozostaną w wodzie.

Metodę należy stosować dla substancji, które nie powodują bezpośredniego zakłócenia pomiaru wzrostu glonów.

Przed przystąpieniem do badania pożądane jest posiadanie, w możliwym zakresie, informacji na temat rozpuszczalności w wodzie, ciśnienia pary, stabilności chemicznej, stałych dysocjacji i rozkładu biologicznego substancji badanej.

Przy planowaniu i interpretacji wyników badania należy także wziąć pod uwagę dodatkowe informacje (np. wzór strukturalny, stopień czystości, charakter i zawartość procentowa istotnych zanieczyszczeń, obecność i ilość substancji pomocniczych oraz współczynnik podziału n-oktanol/woda).

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI

Gęstość komórek: liczba komórek na mililitr.

Wzrost: wzrost gęstości komórek w okresie czasu badania.

Szybkość wzrostu: wzrost gęstości komórek na jednostkę czasu.

EC50: w niniejszej metodzie, stężenie substancji badanej, które daje 50 % zmniejszenie albo wzrostu (EbC50), albo szybkości wzrostu (ErC50) względem kontroli.

NOEC (nieobserwowany wpływ stężenia): w niniejszej metodzie – najwyższe badane stężenie, przy którym nie obserwuje się znaczącej inhibicji wzrostu względem kontroli.

Wszystkie stężenia substancji badanej podano w wadze na objętość (miligramy na litr). Mogą być także wyrażone w wadze do wagi (mg/kg-1).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA

Można przeprowadzić badanie substancji odniesienia w celu wykazania, że reakcja badanych gatunków nie uległa istotnej zmianie w laboratoryjnych warunkach badania.

Jeżeli zastosowano substancję odniesienia, wyniki należy podać w sprawozdaniu z badania. Dichromian potasu może być użyty jako substancja odniesienia, lecz jego kolor wpływa na jakość oświetlenia i dopuszczalną intensywność dla komórek, a także na ewentualne oznaczenia spektrofotometryczne. Dichromian potasu stosowano w badaniu międzylaboratoryjnym (zob. poz. bibliograficzna (3) i dodatek 2).

1.4. ZASADA METODY BADANIA

Badanie graniczne przeprowadzane jest przy 100 mg na litr w celu zademonstrowania, że EC50 jest większe od stężenia.

Wykładniczo wzrastające kultury wybranych zielonych glonów są poddawane ekspozycji przy różnych stężeniach badanej substancji przez kilka generacji w pokreślonych warunkach.

Badane roztwory są inkubowane przez okres 72 godziny, w trakcie którego gęstość komórek w każdym z roztworów jest mierzona co najmniej co 24 godziny. Oznacza się inhibicję wzrostu w odniesieniu do kultury kontrolnej.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI

Do badania granicznego, jak również do pełnej metody badania należy zastosować kryteria jakościowe.

Gęstość komórek w kulturach kontrolnych musi wzrosnąć o współczynnik co najmniej 16 w ciągu okresu trzech dni.

Stężenia substancji badanej należy utrzymywać w obrębie 80 % stężeń początkowych poprzez czas odpowiadający czasowi trwania badania.

Dla substancji łatwo rozpuszczalnych w podłożu badanym, roztwory podatne na stabilność, to jest te które nie wykazują żadnego znacznego stopnia ulatniania, rozkładu, hydrolizy lub absorpcji, początkowe stężenie uważane jest za równoważne nominalnemu stężeniu. Należy przedstawić dowody, że utrzymano stężenia poprzez całe badanie i spełniono kryteria jakościowe.

Dla substancji, które są:

(i) słabo rozpuszczalne w podłożu badawczym; lub

(ii) zdolne do tworzenia stabilnych emulsji lub zawiesin; lub

(iii) niestabilne w roztworach wodnych,

początkowe stężenie musi być pobrane jako zmierzone stężenie w roztworze na początku badania. Stężenie należy oznaczyć po okresie równowagi.

Znany jest fakt, że znaczne ilości badanej substancji są włączane w biomasę glonów w czasie trwania okresu badania.

Zatem w celu zademonstrowania zgodności z powyższymi kryteriami jakości, zarówno ilość substancji badanej włączonej do biomasy glonów jak i substancji w roztworze (lub jeśli to niemożliwe ze względów technicznych, zmierzone w słupie wody) muszą być wzięte pod uwagę. Jednakże jeśli oznaczenie stężenia substancji w biomasie glonów napotyka na poważne trudności techniczne, odpowiedniość z kryteriami jakościowymi, można przedstawić poprzez włączenie do procesu zbiornika badawczego z najwyższym stężeniem substancji, lecz bez glonów i pomiary stężeń w roztworze (lub, jeśli niemożliwe to technicznie, w słupie wody) na początku i na końcu okresu czasu badania.

1.6. OPIS PROCEDURY BADANIA

1.6.1. Odczynniki

1.6.1.1. Roztwory substancji badanych

Przygotowuje się roztwory podstawowe o wymaganym stężeniu przez rozpuszczenie substancji w wodzie dejonizowanej lub w wodzie przygotowanej według opisu w 1.6.1.2.

Wybrane stężenia badane są przygotowywane przez dodawanie odpowiednich podwielokrotności do prekultur glonów (zob. dodatek 1).

Substancje zwykle należy badać tylko do granicy rozpuszczalności. Dla niektórych substancji (na przykład dla substancji posiadających niską rozpuszczalność w wodzie, lub o wysokim Pow lub tych tworzących raczej stabilne zawiesiny niż roztwory rzeczywiste w wodzie) jest dopuszczalne stężenie badania powyżej granicy rozpuszczalności celem zapewnienia, że uzyskano maksymalne stężenie rozpuszczenia/stabilności. Jest ważne jednakże, żeby to stężenie w żaden sposób nie zakłócało systemu badania (np. warstwa substancji na powierzchni wody zapobiegająca utlenianiu wody itp.).

Stosuje się ultradźwiękowe rozpraszanie, rozpuszczalniki organiczne, emulsyfikatory lub dyspergatory jako środki do przygotowania roztworów podstawowych substancji o niskiej rozpuszczalności lub w celu ułatwienia rozproszenia tych substancji w podłożu badawczym. Jeżeli stosuje się takie substancje pomocnicze, wszystkie badane stężenia muszą zawierać tę samą ilość substancji pomocniczej, oraz dodatkowa grupa kontrolna powinna być poddana ekspozycji przy tym samym stężeniu substancji pomocniczej, które użyto w badanych seriach. Stężenie takich substancji należy zminimalizować, lecz w żadnym przypadku nie może przekraczać 100 mg na litr w podłożu badawczym.

Badanie należy przeprowadzić bez regulacji pH. Jeżeli istnieją oznaki zaznaczonej zmiany pH, doradza się powtórzenie badania z odpowiednim dostosowaniem jego wartości i przedstawienie uzyskanych wtedy wyników. W takim przypadku wartość pH roztworu podstawowego należy doprowadzić do pH wody do rozcieńczenia, chyba że istnieją powody, z których nie należy tego robić. Najlepsze są HCl i NaOH w tym celu. Regulację pH należy przeprowadzić w taki sposób, aby nie zmienić w istotnym stopniu stężenia substancji badanej w roztworze podstawowym. W przypadku gdyby zaszła reakcja chemiczna lub doszło do fizycznego wytrącania się osadu badanego związku z powodu ustawiania pH, należy podać ten fakt.

1.6.1.2. Podłoże badania

Woda powinna być dobrej jakości wodą destylowaną lub wodą dejonizowaną o przewodności niższej od 5 uS.cm-1. Przyrząd do destylacji nie może zawierać żadnych części wykonanych z miedzi.

Zalecane jest następujące podłoże.

Cztery roztwory podstawowe są przygotowywane zgodnie z następującą tabelą. Roztwory podstawowe są sterylizowane poprzez filtrowanie przez membranę i autoklawizowanie, i przechowywanie w ciemnym miejscu w 4 oC. Roztwór podstawowy nr 4 należy sterylizować tylko membranową filtracją. Te roztwory podstawowe rozcieńcza się do uzyskania końcowych stężeń składników pokarmowych w badanych roztworach.

Składnik pokarmowy

Stężenie w roztworze podstawowym

Końcowe stężenie w roztworze badanym

Roztwór podstawowy 1: makroskładniki

NH4Cl

1,5 g/l

15mg/l

MgCl2.6H2O

1,2 g/l

12mg/l

CaCl2.2H2O

1,8 g/l

18mg/l

MgSO4.7H2O

1,5 g/l

15mg/l

KH2PO4

0,16 g/l

1,6 mg/l

Roztwór podstawowy 2: Fe-EDTA

FeCl3.6H2

80 mg/l

0,08 mg/l

Na2EDTA.2H2O

100 mg/l

0,1 mg/l

Roztwór podstawowy 3: pierwiastki śladowe

H3BO3

185 mg/l

0,185 mg/l

MnCl2.4H2O

415 mg/l

0,415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

3 × 103 mg/l

CoCl2.6H2O

1,5 mg/l

1,5 × 103 mg/l

CuCl2.2H2O

0,01 mg/l

105 mg/l

Na2 MoO4.2H2O

7 mg/l

7 × 103 mg/l

Roztwór podstawowy 4: NaHCO3

NaHCO3

50 g/l

50 mg/l

Wartość pH podłoża po ustaleniu się równowagi z powietrzem wynosi około 8.

1.6.2. Przyrząd

— Zwykły sprzęt laboratoryjny.

— Kolby do badań o stosownej objętości (np. kolby stożkowe 250 ml są odpowiednie dla objętości badanego roztworu równej 100 ml). Wszystkie kolby do badań powinny być identyczne materiałowo i wymiarowo.

— Przyrząd do rozwoju kultur: szafka lub komora, w której temperatura wynosi 21–25 oC i jest utrzymywana z dokładnością ± 2 oC, o stałym, jednorodnym oświetleniu, dające zakres widma 400–700 nm. Jeżeli glony w kulturach kontrolnych osiągną zalecaną szybkość wzrostu, uznaje się, że warunki wzrostu, włączając intensywność oświetlenia, zostały spełnione.

Zalecane jest użycie dla średniego poziomu badanych roztworów oświetlenia o intensywności w zakresie 60–120 μE.m-2.s-1 (35–70 × 1018 fotonów m-2.s-1) przy pomiarze w zakresie długości fali światła 400–700 nm, stosując odpowiedni czujnik. Dla przyrządów mierzących światło, skalibrowanych w luksach, akceptowalnym równoważnym zakresem jest 6 000–10 000 luksów.

Intensywność światła może być uzyskana przez zastosowanie od czterech do siedmiu lamp fluorescencyjnych o mocy 30 W typu uniwersalnego białego (temperatura barwy około 4 300 K), w odległości 0,35 m od kultury glonów.

— Pomiary gęstości komórek powinny być wykonywane, używając bezpośredniej metody zliczania żywych komórek, np.za pomocą mikroskopu z komorą liczącą. Jednakże można zastosować inne procedury wystarczająco czułe i wystarczająco dobrze skorelowane z gęstością komórek (np. fotometria, turbidymetria).

1.6.3. Badane organizmy

Sugeruje się używanie takich gatunków glonów zielonych, które są gatunkami szybko wzrastającymi co jest wygodne dla kulturowania i badania. Najlepszymi gatunkami są:

— Selenastrum capricornutum, np. ATCC 22662 lub CCAP 278/4,

— Scenedesmus subspicatus, np. 86.81 SAG,

Uwaga:

ATCC

American Type Culture Collection (U.S.A.)

CCAP

Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)

SAG

Collection of algal culture (Gottingen, F.R.G.)

Jeżeli użyto innych gatunków, należy umieścić nazwę szczepu w sprawozdaniu.

1.6.4. Procedura badania

Zakres stężenia, w którym prawdopodobnie zajdzie wpływ, jest ustalany na podstawie wyników z badań znalezienia zakresu.

Dwa pomiary wzrostu (biomasy i szybkość wzrostu) mogą dać szeroko rozbieżne pomiary wzrostu inhibicji; obydwa należy użyć w badaniu znalezienia zakresu dla zapewnienia, że geometryczny ciąg stężeń umożliwi oszacowanie zarówno EbC50, jak i ErC50.

Początkowa gęstość komórek

Jest zalecane, aby początkowa gęstość komórek w badanych kulturach była około 104 komórek/ml dla Sehnastrum capricorn utum i Scenedesmus subspicatus. Jeśli stosuje się inne gatunki, biomasa musi być porównywalna.

Stężenia substancji badanej

Do badania przygotowuje się co najmniej pięć stężeń w seriach geometrycznych przy stosunku stężenia nieprzekraczającym 2,2. Najniższe badane stężenie powinno nie dawać obserwowalnego efektu wzrostu glonów. Najwyższe stężenie badane powinno hamować wzrost o co najmniej 50 % w stosunku do kontroli, i najkorzystniej całkowicie zatrzymać wzrost.

Repliki i kontrole

Projekt badania powinien zawierać trzy kopie badania przy każdym badanym stężeniu. Dołączane są trzy kontrole badania bez substancji badanej, oraz, jeśli stosowne, trzy kontrole zawierające substancję pomocniczą. O ile jest to uzasadnione, projekt może być zmieniony w celu zwiększenia liczby stężeń i zmniejszenia liczby replik na dane stężenie.

Przeprowadzenie badania

Badane kultury zawierające pożądane stężenia badanej substancji i pożądaną ilość inokulum glonowych są przygotowywane przez dodanie podwielokrotności roztworu podstawowego substancji badanej do odpowiednich ilości prekultur glonów (zob. dodatek 1).

Kolby z kulturami są wstrząsane i umieszczane w aparacie do hodowania kultur. Komórki glonów są utrzymywane w stanie zawiesiny poprzez wstrząsanie, wirowanie lub przepuszczaniem pęcherzyków powietrza w celu poprawy wymiany gazu z zmniejszenia zmian pH w badanych roztworach. Kultury powinny być utrzymywane w temperaturze w zakresie 21–25 oC, kontrolowanej w tolerancji ± 2 oC.

Gęstość komórkowa jest ustalana co najmniej w 24, 48 i 72 godziny po rozpoczęciu badania. Filtrowanie podłoża glonów zawierającego odpowiednie stężenia badanej substancji jest stosowane celem ustalenia tła, gdy prowadzone są pomiary gęstości komórek, inne od bezpośrednich metod zliczania.

Wartość pH jest mierzona na początku badania i w 72 godzinie.

Wartości pH w zbiornikach kontrolnych nie powinno zwykle odchylać się więcej niż 1,5 jednostki w czasie trwania badania.

Badanie substancji lotnych

Nie ma obecnie ogólnej uznanej drogi badania substancji lotnych. Jeżeli substancja jest znana z tendencji do parowania, używa się zamkniętych kolb badawczych ze zwiększoną przestrzenią głowicy. Zaproponowano zmiany do tej metody (zob. poz. bibliograficzna (4)).

Należy podjąć próby do ustalenia ilości substancji, która pozostaje w roztworze, i zwrócić ekstremalną uwagę przy interpretacji wyników badań z lotnymi związkami chemicznymi przy zastosowaniu systemów zamkniętych.

Badanie graniczne

Stosując procedury opisane w niniejszej metodzie badania, przeprowadza się badanie graniczne przy stężeniu 100 mg na litr w celu pokazania, że EC50 jest większy niż dla danego stężenia.

Jeżeli natura badanej substancji jest taka, że nie można uzyskać stężenia 100 mg na litr w badanej wodzie, badanie graniczne należy przeprowadzić w stężeniu równym rozpuszczalności substancji (lub w maksymalnym stężeniu tworzącym stabilną zawiesinę) w użytym podłożu (zob. także 1.6.1.1).

Badanie graniczne należy przeprowadzić w co najmniej potrojonej ilości, z taką samą ilością kontroli. Do badania granicznego należy wykonać dwa pomiary wzrostu (biomasy i szybkości wzrostu).

Jeżeli w badaniu granicznym znajduje się średni spadek o 25 % lub więcej biomasy albo szybkości wzrostu między badaniem granicznym i kontrolą, należy przeprowadzić pełne badanie.

2. DANE I OCENA

Zmierzone gęstości komórek w badanych kulturach i kontrolach ujmuje się w postaci stabelaryzowanej wraz ze stężeniami substancji badanej i czasami pomiarów. Wartość średnia gęstości komórek dla każdego stężenia substancji badanej oraz kontroli jest wykreślana w zależności od czasu (0–72 godz.) dla uzyskania krzywych wzrostu.

Dla ustalenia zależności stężenie/skutek należy zastosować dwa podejścia. Niektóre substancje mogą stymulować wzrost przy niskich stężeniach. Należy rozważyć tylko punkty danych wskazujących hamowanie między 0 i 100 %.

2.1. PORÓWNANIE POWIERZCHNI POD KRZYWYMI WZROSTU

Obszar między krzywymi wzrostu i poziomą linią N = N0 oblicza się zgodnie ze wzorem:

gdzie:

powierzchnia,

ilość komórek/ml w czasie t (początek badania), 0,

zmierzona liczba komórek/ml w czasie t1

zmierzona liczba komórek/ml w czasie t,

czas pierwszego pomiaru po rozpoczęciu badania,

czas n-tego pomiaru po rozpoczęciu badania,

liczba pomiarów zdjętych po rozpoczęciu badania.

Procentowe hamowanie wzrostu komórek przy każdym stężeniu substancji badanej (IA) jest obliczane zgodnie ze wzorem:

gdzie:

powierzchnia między krzywą wzrostu kontroli i linią poziomą N = N0.

powierzchnia między krzywą wzrostu przy stężeniu t i linia poziomą N = N0.

wartości są wykreślane na półlogarytmicznym papierze lub półlogarytmicznym probitowym papierze w relacji do odpowiadających stężeń. Jeżeli wykreśla się na papierze probitowym, punkty łączone są prostą linią albo wizualnie, albo regresją obliczeniową.

EC50 oszacowuje się z linii regresji przez odczyt stężenia równoważnego 50 % inhibicji (IA = 50 %). Do oznaczenia niniejszej wartości jednoznacznie w odniesieniu do tej metody obliczeniowej, proponuje się użycie symbolu EbC50. Jest podstawą, że EbC50 jest dzielone przez odpowiedni okres czasu ekspozycji, np. EbC50 (0–72 godz.).

2.2. PORÓWNANIE SZYBKOŚCI WZROSTU

Średnia właściwa szybkość wzrostu (u) dla wykładniczo rosnącej kultury może być obliczona jako:

gdzie t0 jest czasem początku badania.

Alternatywnie, średnia właściwa szybkość wzrostu może być wyprowadzona z nachylenia linii regresji z wykresu N w stosunku do czasu.

Procentowe hamowanie właściwej szybkości wzrostu przy każdym stężeniu substancji badanej (Iμt) jest obliczane zgodnie ze wzorem:

gdzie:

μc

średnia właściwa szybkość wzrostu dla kontroli,

μt

średnia właściwa szybkość wzrostu dla stężenie badania t.

Procentowe zmniejszenie średniej właściwej szybkości wzrostu przy każdym stężeniu substancji badanej porównane do wartości kontroli jest wykreślane w odniesieniu do logarytmu stężenia. EC50 odczytuje się z wynikowego wykresu. Dla jednoznacznego oznaczenia EC50 wyprowadzonego z niniejszej metody proponowane jest użycie symbolu ErC50. Czasy pomiaru muszą być wskazane, na przykład jeżeli wartość jest odniesiona do czasów 0 i 72 godziny, symbol staje się ErC50 (0–72 godz.).

Uwaga: właściwa szybkość wzrostu jest członem logarytmicznym, czyli mała zmiana w szybkości wzrostu prowadzi do wielkiej zmiany w biomasie. Wartości EbC i ErC są zatem porównywalne nienumerycznie.

2.3. OBLICZENIE NOEC

Stężenie bez obserwowanego działania toksycznego jest oznaczane odpowiednią procedurą statystyczną dla wielopróbkowego porównania (np. analizy wariancji i badaniem Dunnetta), stosując poszczególne replikowane wartości powierzchni spod krzywych wzrostu A (zob. 2.1) lub właściwych szybkości wzrostu μ (zob. 2.2).

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

— substancja badana: dane tożsamości chemicznej,

— badane organizmy: pochodzenie, kultura laboratoryjna, numer szczepu, metoda hodowli,

— warunki badania:

— data startu i zakończenia badania i jego czas trwania,

— temperatura,

— skład podłoża,

— przyrząd do hodowania kultur,

— pH roztworów na początku oraz na końcu badania (należy wyjaśnić jeżeli obserwowano odchylenia pH powyżej 1,5 jednostki),

— nośnik i metoda stosowana do rozpuszczenia substancji badanej i stężenie nośnika w roztworach badanych,

— jakość oraz intensywność oświetlenia,

— badane stężenia (zmierzone lub nominalne).

— wyniki:

— gęstość komórek dla każdej kolby w każdym punkcie pomiarowym oraz metoda pomiaru gęstości komórek,

— wartość średnia gęstości komórek,

— krzywe wzrostu,

— graficzne przedstawienie zależności wpływu stężenia,

— wartości EC i metody obliczenia,

— NOEC,

— inne obserwowane działania.

4. LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge Scenedesmus subspicatus”, in: Rudoiph/Boje: Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal wzrost inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S.Galassi and M.Vighi – Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123–1126.

Dodatek 1

Przykład procedury hodowli glonów

Uwagi ogólne

Celem hodowli glonów na podstawie niniejszej procedury jest uzyskanie kultur glonów dla badań toksyczności.

Należy użyć odpowiednich metod dla zapewnienia, że kultury glonów nie są zainfekowane bakteriami (ISO 4833). Podstawowe jest dla kultur glonów, by były wolne od pasożytów.

Wszystkie operacje powinny być prowadzone w warunkach sterylnych w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu bakteriami i innymi glonami. Zanieczyszczone kultury należy odrzucić.

Procedury uzyskania kultur glonów

Przygotowanie roztworów składników pokarmowych (podłoża):

Podłoże przygotowuje się przez rozcieńczenie stężonych roztworów podstawowych składników pokarmowych. Dla stałego podłoża dodaje 0,8 % agaru. Używane podłoże powinno być sterylne. Sterylizacja za pomocą autoklawów prowadzi do strat amoniaku.

Kultura podstawowa:

Kultury podstawowe są kulturami małych glonów, które są regularnie przenoszone do świeżego podłoża, działają jako materiał początkowy badania. Jeżeli kultury nie są regularnie używane, tworzą pasma na nachylonych kanalikach agaru. Kultury są przenoszone do świeżego podłoża co najmniej raz na dwa miesiące.

Kultury podstawowe wzrastają w stożkowych kolbach zawierających odpowiednie podłoże (obįętość około 100 ml). Gdy glony są inkubowane w 20 oC ze stałym oświetleniem, wymagane jest cotygodniowe przenoszenie.

W czasie trwania przenoszenia ilość starej kultury jest przenoszona za pomocą sterylnych pipet do kolby ze świeżym podłożem, tak że wraz z szybkim wzrostem gatunku początkowe stężenie jest około 100 razy mniejsze niż w starej kulturze.

Szybkość wzrostu gatunku może być określona przez krzywą wzrostu. Jest wiadome, że jest możliwe oszacowanie gęstości, przy której kulturę należy przenieść do nowego podłoża. Należy to wykonać, zanim kultura osiągnie fazę martwą.

Prekultura:

Przeznaczeniem prekultury jest danie odpowiedniej ilości glonów dla inokulacji badanych kultur. Prekultura jest inkubowana w warunkach badania i stosowana, gdy wciąż wykładniczo narasta, zwykle po czasie inkubacji około trzech dni. Jeżeli kultury glonów zawierają zdeformowane lub nienormalne komórki, należy je odrzucić.

Dodatek 2

ISO 8692 – Jakość wody – badanie zahamowania wzrostu glonów słodkowodnych Scenedesmus subspicatus i Selenastrum capricornutum przedstawia następujące wyniki badania międzylaboratoryįnego między 16 laboratoriami, przy badaniu dichromianu potasu:

Średnie (mg/l)

Zakres (mg/l)

ErC50 (0–72 godz.)

0,84

0,60 –1,03

EbC50 (0–72 godz)

0,53

0,20 –0,75

C.4. OZNACZENIE BIODEGRADOWALNOŚCI

CZĘŚĆ I. ROZWAŻANIA OGÓLNE

I.1. WPROWADZENIE

Opisano sześć metod pozwalających na sortowanie substancji chemicznych w celu biodegradowalności w aerobowych wodnych podłożach:

a) rozpuszczalny węgiel organiczny (DOC) metoda „Die-Away” (metoda C.4-A);

b) zmodyfikowane badanie przesiewowe OECD – DOC metoda „Die-Away” (metoda C.4-B);

c) wydzielanie ditlenku węgla (CO2) (Zmodyfikowane badanie Sturma) (metoda C.4-C);

d) respirometria manometryczna (metoda C.4-D);

e) zamkniętej butli (metoda C.4-E);

f) MITI (Ministerstwo Handlu Międzynarodowego i Przemysłu – Japonia) (Metoda C.4-F).

Zwykłe i ogólne rozważania do wszystkich sześciu badań podano w części I metody. Punkty specyficzne dla poszczególnych metod podano w częściach II–VII. Dodatki zawierają definicje, wzory i materiał wiodący.

Ćwiczenie porównawcze międzynarodowego laboratorium OECD, przeprowadzone w 1988 r., pokazały ze metody dają zgodne wyniki. Jednakże w zależności od fizycznych charakterystyk badanych substancji jedna lub inne metody są zalecane.

I.2. WYBÓR ODPOWIEDNIEJ METODY

W celu wybrania najbardziej odpowiedniej metody podstawowe jest posiadanie informacji na temat rozpuszczalności chemicznej, prężności pary i charakterystyk adsorpcji. Powinna być znana struktura chemiczna i wzór w celu obliczenia teoretycznych wartości i/lub sprawdzenia wartości pomierzonych parametrów, na przykład ThOD, ThCO2, DOC, TÓC, COD (zob. załącznik I i II).

Badania substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie w co najmniej 100 mg/l mogą być oszacowane wszystkimi metodami, pod warunkiem że są one nielotne i nieabsorbujące. Dla tych substancji chemicznych, które są słabo rozpuszczalne w wodzie, lotne lub adsorbujące, odpowiednie metody wskazano w tabeli 1. Sposób w który substancje chemiczne słabo rozpuszczalne w wodzie można przygotować opisano w załączniku III. Średnio lotne substancje chemiczne mogą być badane metodą DOC (metoda „Die-Away”), jeżeli jest wystarczająca przestrzeń na gaz w naczyniach pomiarowych (które powinny być odpowiednio zakorkowane). W tym przypadku należy ustawić kontrolę abiotyczną, by nie pozwolić na jakiekolwiek straty fizyczne.

Tabela 1

Stosowalność metod badania

Badanie

Metoda analityczna

Odpowiedniość dla substancji, które są:

Słabo rozpuszczalne

lotne

adsorbujące

DOC Die-Away

Rozpuszczalny węgiel organiczny

— —

+/-

Zmod. OECD Die-Away

Rozpuszczalny węgiel organiczny

— —

+/-

Wydzielanie CO2

Respirometria: wydzielanie CO2

— +

Respirometria manometryczna

Respirometria manometryczna: zużycie tlenu

+/-

Zamkniętej butla

Respirometria: rozpuszczony tlen

+/-

MITI

Respirometria: zużycie tlenu

+/-

Wymagane są informacje na temat czystości lub względnych stosunków głównych składników badanego materiału w celu interpretacji uzyskanych wyników, szczególnie gdy wyniki są niskie lub marginalne.

Informacje na temat toksyczności badanej substancji w stosunku do bakterii (załącznik IV) są bardzo użyteczne dla wyboru odpowiednich stężeń badania i mogą być podstawowe dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji.

I.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA

W celu sprawdzenia procedury chemiczne substancje odniesienia spełniające kryteria łatwej biodegradowalności są badane przez umieszczenie w odpowiedniej kolbie równolegle do zwykłego przebiegu badania.

Odpowiednimi substancjami chemicznymi są anilina (świeżo destylowana), octan sodu i benzoesan sodu. Te chemiczne substancje odniesienia całkowicie degradują się w tych metodach, nawet gdy nie dodano przezornie inokulum.

Zasugerowano, że należy szukać chemicznej substancji odniesienia, która by była łatwo biodegradowalna, lecz wymagałaby dodania inokulum. Zaproponowano wodoroftalan potasu lecz potrzeba uzyskać więcej dowodów dla tej substancji przed jej zaakceptowaniem jako substancji odniesienia.

W badaniach respirometrycznych, związki zawierające azot oddziaływują na pobieranie tlenu z powodu procesu nitryfikacji (zob. załączniki II i V).

I.4. ZASADA METOD BADAŃ

Roztwór lub zawiesinę substancji badanej na podłożu mineralnym jest zaszczepiany i inkubowany w warunkach aerobowych w ciemności lub rozproszonym świetle. Ilość DOC w roztworze badanym powinna być utrzymywana tak mała jak to możliwe w porównaniu z ilością DOC spodziewanej w substancji badanej. Wykonuje się poprawkę na aktywność endogeniczną inokulum przez prowadzenie równoległych badań ślepych z inokulum, ale bez substancji badanej, chociaż endogeniczna aktywność komórek w obecności substancji nie tak samo dokładnie odpowiada tej w kontroli endogenicznej. Substancja odniesienia jest równolegle badana w celu sprawdzenia operacji procedury.

Ogólnie biorąc, degradacja jest wykonywana przez oznaczanie parametrów takich jak DOC, tworzenie CO2 i pobrany tlen, wykonywane są pomiary w dostatecznie częstych odstępach czasu pozwalających na identyfikację początku i końca biodegradacji. Przy zastosowaniu automatycznych respirometrów pomiar staje się ciągły. DOC jest czasem mierzony dodatkowo do innych parametrów, lecz jest to zwykle wykonywane tylko na początku i końcu badania. Stosuje się także specyficzną analizę chemiczną do oceny pierwotnej degradacji substancji badanej i do oznaczenia stężenia wszystkich utworzonych substancji pośrednich (obligatoryjne w badaniu MITI).

Zwykle badanie biegnie przez 28 dni. Badanie jednakże można zakończyć przed upływem 28 dni, to jest wtedy kiedy krzywa biodegradacji osiąga plateau dla co najmniej 3 oznaczeń. Badania można także wydłużyć ponad 28 dni, jeżeli krzywa pokazuje, że biodegradacja rozpoczęła się natomiast nie osiągnięto plateau 28 dnia.

I.5. KRYTERIA JAKOŚCI

I.5.1. Odtwarzalność

Z powodu istoty biodegradacji oraz stosowania mieszanych populacji bakteryjnych oznaczenia przeprowadzać co najmniej zdublowane.

Ze zwykłego doświadczenia wynika, iż im większe jest stężenie drobnoustrojów wstępnie dodanych do podłoża badawczego, tym mniejsze będą zmiany między replikami. Badanie obrączkowe również pokazuje, że mogą występować duże zmiany między wynikami uzyskanymi przez rożne laboratoria, lecz zwykle uzyskuje się dobrą zgodność przy zastosowaniu łatwo degradowalnych związków.

I.5.2. Ważność badania

Badanie uznaje się za ważne, jeżeli różnica ekstremów wartości replikowanych zdjętych z plateau badanej substancji pod koniec badania lub pod koniec badania 10-dniowego „okiennego” jest na koniec badania, odpowiednio, mniejsza od 20 %, oraz jeżeli procentowa degradacja substancji odniesienia osiągnęła poziom łatwej biodegradacji przez 14 dni. Jeżeli jeden z tych warunków nie jest spełniony badanie należy powtórzyć. Z powodu ostrości tych metod niskie wartości niekoniecznie oznaczają, że substancja badana nie jest biodegradowalna w warunkach środowiskowych, lecz wskazuje, że konieczne jest więcej wysiłków do ustalenia biodegradowalności.

Jeżeli w badaniu toksyczności, zawierającym zarówno substancję badaną, jak i chemiczną substancję odniesienia, zachodzi mniej niż 35 % degradacji (w oparciu o DOC) lub mniej niż 25 % (w oparciu o ThOD lub ThCO2) w ciągu 14 dni, badaną substancję można ocenić jako inhibitor (zob. także załącznik IV). Należy powtórzyć serie badań, jeżeli możliwe jest użycie niższego stężenia badanej substancji i/lub wyższego stężenia inokulum, lecz nie większego niż 30 mg ciała stałego/litr.

I.6. PROCEDURY OGÓLNE I PRZYGOTOWANIA

Ogólne warunki stosowane w badaniach podsumowano w tabeli 2. Przyrząd oraz inne warunki eksperymentalne specyficznie właściwe dla poszczególnych badań opisano dalej, pod nagłówkami dla danego badania.

Tabela 2

Warunki badania

Badanie

DOC (metoda „Die-Away”)

CO2 wydzielanie

Respirometria manometryczna

Zmodyfikowane OECD badanie przesiewowe

Zamknięta butla

MITT (I)

Stężenie badanej substancji jako

mg/l

100 V

2–10

100

mg DOC/l

10–40

10–20

10–40

mg ThOD/1

50–100

5–10

Stężenie inokulum (komórek/l, przybliżone)

≤ 30 mg/1 SS

lub ≤ 100 ml wycieku/l

(107 – 108)

0,5 ml wtórny wyciek/1

(105) < 5 ml wycieku/1

(104 –106)

30 mg/1 SS

(107-108)

Stężenie pierwiastków w podłożu mineralnym (w mg/1)

116

11,6

1,3

0,13

1,3

8,6

17,2

122

12,2

36,5

2,2

6,6

9,9

29,7

0,05 -0,1 V

0,05 -0,1

0,15

7,4 ±0,2

korzystnie 7,0

Temperatura

22 ± 2 oC

25 ± I oC

DOC

rozpuszczony węgiel organiczny

ThOD

teoretyczne zapotrzebowanie tlenu

zawieszone ciała stałe

I.6.1. Woda rozcieńczająca

Stosuje się dejonizowaną lub destylowaną wodę, wolne od inhibujących stężeń substancji toksycznych (np. jonów Cu ++). Musi zawierać nie więcej niż 10 % zawartości węgla organicznego wprowadzanego w badanym materiale. Konieczna jest woda do badań o wysokiej czystości w celu eliminacji wysokich wartości dla śłepej próby. Zanieczyszczenia mogą pochodzić z naturalnych zanieczyszczeń wody, ale również z żywic jonowymiennych oraz lizowanych materiałów bakteryjnych i glonów. Dla każdej serii badań stosuje się tylko jedną partię wody, sprawdzoną uprzednio analizą DOC. Takie sprawdzenie nie jest konieczne dla badania „zamkniętej butli”, lecz zapotrzebowanie wody na tlen musi być niskie.

I.6.2. Roztwory podstawowe składników mineralnych

Do sporządzenia roztworów badanych sporządzane są roztwory podstawowe o odpowiednich stężeniach składników mineralnych. Następujące roztwory podstawowe są używane (o różnych współczynnikach rozcieńczenia) dla metod DOC „Die-Away” zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD, wydzielanie CO2, respirometrii manometrycznej i badania „zamkniętej butli”.

Współczynniki rozcieńczenia oraz, dla badania MITI, właściwie przygotowane podłoża mineralne podano pod nagłówkami właściwych badań.

Roztwory podstawowe:

Przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki czystości analitycznej.

a) Diwodoroortofosforan monopotasu, KH2PO4

8,50 g

Monowodoroortofosforan dipotasu, K2HPO4

21,75 g

Diwodny monowodoroortofosforan disodium Na2HPO4. 2 H2O

33,40 g

Chlorek amonu, NH4CI

0,50 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra. Wartość pH roztworu powinna być 7,4 .

b) Chlorek wapnia, bezwodny, CaCl2

27,50 g

lub chlorek wapnia diwodny, CaCl2, 2 H2O

36,40 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

c) Heptawodny siarczan magnezu, MgSO4. 7 H2O

22,50 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

d) Heksawodny chlorek żelaza (III), FeCl3. 6 H2O

0,25 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

Uwaga: aby nie przygotowywać niniejszego roztworu bezpośrednio przed użyciem, dodać kroplę stężonego kwasu solnego lub 0,4 grama soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na litr.

I.6.3. Roztwory podstawowe substancji chemicznych

Przykładowo rozpuścić 1–10 g odpowiednio badanej substancji chemicznej lub chemicznej substancji odniesienia w wodzie dejonizowanej i dopełnić do 1 litra, gdy rozpuszczalność przekracza 1 g/l. Z drugiej strony, przygotować roztwory podstawowe w podłożu mineralnym lub dodać substancje chemiczną bezpośrednio do podłoża mineralnego. Postępowanie ze słabo rozpuszczalnymi substancjami chemicznymi – zob. załącznik III, ale w badaniu MITI (metoda C.4-F) nie stosuje się ani rozpuszczalników, ani środków emulsyfikujących.

I.6.4. Materiał inokulacyjny

Inokulum może pochodzić z różnych źródeł: aktywowany osad, ścieki kanalizacyjne (niechlorowane), wody powierzchniowe i gleby lub ich mieszaniny. Dla badań DOC „Die-Away”, wydzielania CO2 i respirometrii manometrycznej, jeżeli stosowany jest aktywowany osad, powinien być pobrany z oczyszczalni ścieków i urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głównie ścieki domowe. Materiał inokulacyjny z innych źródeł, okazał się dawać bardziej rozproszone wyniki. Dla zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD i badania zamkniętej butli potrzebne jest bardziej rozcieńczone inokulum bez kłaczków osadu i zalecanym źródłem jest ściek drugiego stopnia oczyszczalnia ścieków domowych lub urządzeń skali laboratoryjnej. Dla badania MITI inokulum jest otrzymywane z mieszanych źródeł i opisane jest pod nagłówkiem tego specyficznego badania.

I.6.4.1. Inokulum z aktywowanych osadów

Zebrać świeżo pobraną próbkę aktywowanego osadu z komorą napowietrzania oczyszczalni ścieków lub urządzenia skali laboratoryjnej przerabiającego głównie ścieki domowe. Odrzucić duże cząstki, jeżeli konieczne poprzez filtracje przez siatkę o drobnym oczku i utrzymywać napowietrzanie.

Alternatywnie, zsedymentować lub odwirować (np. 1 100 rpm, 10 min) po usunięciu wszystkich dużych cząstek. Odrzucić nadsącz. Można przemyć osad w podłożu mineralnym. Zawiesić stężony osad w podłożu mineralnym dla uzyskania stężenia 3–5 g zawiesiny ciał stałych/l i napowietrzać do wymaganego momentu.

Osad powinien być pobrany z prawidłowo działającej konwencjonalnej oczyszczalni ścieków. Jeżeli pobrano osad z oczyszczalni o wysokiej szybkości oczyszczania lub podejrzewa się zawartość inhibitorów, należy go przemyć. Zsedymentować lub odwirować ponownie zawieszony osad po energicznym mieszaniu, odrzucić nadsącz i ponownie zawiesić umyty osad w dalszej objętości podłoża mineralnego. Powtarzać tę procedurę do czasu, gdy uzna się, iż jest wolny od nadmiaru substratów lub inhibitorów.

Po zakończeniu ponownego zawieszenia, lub niepoddany obróbce osad, odstawić ich próbkę do momentu jej użycia do ustalenia suchej masy ciał stałych w zawiesinie.

Dalszą alternatywą jest homogenizacja aktywowanego osadu (3–5 g zawiesiny ciał stałych/l). Rozdrobnić osad w mechanicznym rozdrabniaczu przy średniej szybkości przez 2 minuty. Zsedymentować rozdrobniony osad przez 30 minut lub dłużej, gdy trzeba, i zdekantować ciecz do użycia jako inokulum przy szybkości 10 ml/l podłoża mineralnego.

I.6.4.2. Inne źródła inokulum

Można je uzyskać ze ścieków drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głównie ścieki domowe. Zebrać świeżą próbkę i utrzymywać napowietrzaną w czasie transportu. Pozwolić osadzić się przez 1 godzinę lub przefiltrować przez grubą bibułę filtracyjną i zatrzymać zdekantowany wyciek lub jeśli wymagane przefiltrować z napowietrzaniem. Do 100 ml tego typu inokulum może być użyte na litr podłoża.

Następnym źródłem inokulum są wody powierzchniowe. W tym przypadku zebrać próbkę z odpowiedniej wody powierzchniowej, np. rzeki, jeziora i utrzymywać w napowietrzeniu przez wymagany czas. Jeżeli konieczne, zatężyć inokulum przez filtrację lub odwirowanie.

I.6.5. Wstępne sezonowanie inokulum

Materiał inokulacyjny może być wstępnie sezonowany do warunków eksperymentalnych, lecz niewstępnie adoptowany do badanej substancji. Wstępne sezonowanie składa się z napowietrzania aktywowanego osadu w podłożu mineralnym lub ścieku drugiego stopnia, przez 5–7 dni w temperaturze badania. Wstępne sezonowanie poprawia czasem precyzje metod badania przez zmniejszenie wartości dla ślepej próby. Uważane jest za niekonieczne wstępne sezonowanie inokulum dla metody MITI.

I.6.6. Kontrole abiotyczne

Gdy wymagane, sprawdzić możliwą abiotyczną degradację badanej substancji przez oznaczenie usuniętego DOC, pobieranie tlenu lub wydzielania ditlenku węgla w sterylnych kontrolach niezawierających inokulum. Sterylizować za pomocą filtracji przez membranę (0,2–0,45 mikrona) lub przez dodanie odpowiedniej toksycznej substancji o odpowiednim stężeniu. Jeżeli stosuje się filtracje membranową, pobrać próbki aseptycznie dla utrzymania sterylności. Chociaż absorpcję badanej substancji wykluczono z góry, badania, które mierzą biodegradację jako usuwanie DOC, szczególnie dla inokulum aktywowanego osadu, powinny zawierać kontrole abiotyczne, zaszczepione i intoksykowane.

I.6.7. Liczba kolb

Liczba kolb w typowym badaniu jest opisana pod nagłówkiem każdego badania.

Stosuje się następujące typy kolb:

— zawiesina badana: zawierających substancję badaną i inokulum,

— ślepa próba inokulum: zawierające tylko inokulum,

— kontrola procedury: zawierających substancje odniesienia i inokulum,

— kontrola sterylności abiotycznej: sterylne, zawierających substancję badaną (zob. I.6.6),

— kontrola adsorpcji: zawierających substancję badaną inokulum i środek sterylizujący,

— kontrola toksyczności: zawierających substancję badaną substancje odniesienia i inokulum.

Obowiązkowe jest, by oznaczenia w zawiesinie badanej i w ślepej próbie inokulum były wykonywane równolegle. Wskazane jest wykonywanie oznaczeń w innych kolbach również w oznaczeniach równoległych.

To jednakże nie zawsze jest możliwe. Upewnić się, że pobrano wystarczającą ilość próbek lub odczytów do oceny procentowego usunięcia DOC w 10-dniowym badaniu „okiennym”.

I.7. DANE I OCENA

W obliczeniu Dt zastosowano procent degradacji, średnie wartości zdublowanych pomiarów parametrów w obu badanych naczyniach i w ślepej próbie inokulum. Wzory są przedstawione w sekcjach poniżej właściwych badań. Przebieg degradacji jest zobrazowany graficznie i badanie 10-dniowe „okno” jest wskazane. Należy obliczyć i przedstawić w sprawozdaniu usunięcie procentowe uzyskane na koniec 10-dniowego „okna” i wartość w plateau, lub pod koniec badania, w zależności od tego, co jest odpowiednie.

W badaniach respirometrycznych związki zawierające azot mogą wpływać na pobieranie tlenu z powodu nitryfikacji (zob. załączniki II i V).

I.7.1. Degradacja zmierzona za pomocą oznaczenia DOC

Procentową degradację Dt przy każdym czasie pobierania próbki należy obliczyć oddzielnie dla kolb zawierających substancję badaną, stosując średnie wartości zdublowanych pomiarów DOC w celu oszacowania ważności badania (zob. I.5.2). Oblicza się to, stosując następujące równanie:

gdzie:

% degradacji w czasie t,

średnie początkowe stężenie DOC w zaszczepionym podłożu kultury zawierającym substancję badaną (mg DOC/l),

średnie stężenie DOC w zaszczepionym podłożu kultury zawierającym substancję badaną w czasie t (mg DOC/l),

Cbo

średnie początkowe stężenie DOC w zaszczepionym podłoże mineralnym ślepej próby (mg DOC/l),

Cbt

średnie stężenie DOC w zaszczepionym podłożu mineralnym ślepej próby w czasie t (mg DOC/l).

Wszystkie stężenia są mierzone eksperymentalnie.

I.7.2. Degradacja mierzona w pojęciu właściwej analizy

Gdy dostępne są dane z właściwej analizy, można obliczyć pierwotną biodegradację z:

gdzie:

% degradacji w czasie t, zwykle 28 dni,

ilość pozostałości substancji badanej w zaszczepionym podłożu na koniec badania (mg),

ilość pozostałości substancji badanej w badaniu ślepej próby woda/podłoże, do którego dodano tylko substancję badaną (mg).

I.7.3. Abiotyczna degradacja

Gdy stosuje się kontrolę sterylną abiotyczną, obliczyć procentową abiotyczną degradację stosując

gdzie:

Cs(o)

DOC stężenie w sterylnej kontroli w dniu 0,

Cs(t)

DOC stężenie w sterylnej kontroli w dniu t.

I.8. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

W miarę możliwości sprawozdanie z badań zawiera następujące elementy:

— badana i chemiczne substancje odniesienia, i ich czystość,

— warunki badania,

— inokulum: natura i miejsce próbkowania(-ń), stężenie i wszystkie operacje przygotowania wstępnego,

— proporcja i charakter odpadu przemysłowego obecnego w ścieku, jeśli znany,

— czas trwania badania i temperatura,

— w przypadku słabo rozpuszczalnych badanych substancji, zastosowane operacje,

— zastosowana metoda badania; dla każdej zmiany procedury należy podać przyczyny uzasadnione naukowo i uzasadnienie,

— arkusz danych,

— wszystkie obserwowane zjawiska inhibicji,

— wszystkie obserwowane abiotyczne degradacje,

— dane właściwej analizy chemicznej, jeśli dostępne,

— dane analityczne etapów pośrednich, jeśli dostępne,

— wykres procentowy degradacji w stosunku do czasu dla substancji badanych i odniesienia; fazy opóźnienia, fazy degradacji, 10-dniowe „okno” oraz nachylenie wykresu należy wyraźnie wskazać (załącznik I). Jeżeli badanie odpowiadało kryteriom ważności, można użyć do wykresu średni procent degradacji w kolbach zawierających substancje badaną,

— procentowe usunięcie po 10-dniowym „oknie” i w plateau lub na koniec badania.

CZĘŚĆ II. BADANIE DOC METODĄ „DIE-AWAY”(Metoda C.4-A)

II.1. ZASADA METODY

Zmierzoną objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie substancji badanej (10–40 mg DOC/l), jako pojedyncze nominalne źródło węgla organicznego napowietrza się w ciemności lub w rozproszonym świetle w 22 ± 2 oC.

Postępującą degradację określa się analizą DOC w częstych przedziałach czasowych przez 28 dni. Stopień biodegradacji jest obliczany przez wyrażenie stężenia usuniętego DOC (skorygowanego do tego ze ślepej próby inokulum w kontroli) jako procent stężenia obecnego początkowo. Stopień pierwotnej biodegradacji może być także obliczony z dodatkowych analiz chemicznych wykonanych na początku i pod koniec inkubacji.

II.2. OPIS METODY

II.2.1. Przyrząd

a) Kolby stożkowe, np. 250 ml do 2 1, w zależności od objętości wymaganej dla analizy DOC.

b) Wytrząsarka do akomodacji kolb stożkowych – albo z automatyczną kontrolą temperatury, albo używaną w stałej temperaturze pokojowej, oraz wystarczająca moc dla utrzymania aerobowych warunków we wszystkich kolbach.

c) Przyrząd filtracyjny z odpowiednimi membranami.

d) Analizator DOC.

e) Przyrząd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.

f) Wirówka.

II.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.

Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 l wodą rozcieńczającą.

II.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum

Inokulum może być otrzymane z różnych źródeł: aktywowanego osadu, ścieków kanalizacyjnych, wód powierzchniowych, gleb lub z mieszaniny tu wymienionych.

Zob. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.

II.2.4. Przygotowanie kolb

Jako przykład wprowadzić porcje 800 ml podłoża mineralnego do 2 1 kolb stożkowych i dodać wystarczające objętości roztworów podstawowych substancji badanej i odniesienia do oddzielnych kolb dla uzyskania stężenia równoważnika chemicznego do 10–40 mg DOC/l. Sprawdzić wartość pH i ustawić, gdy konieczne, do 7,4. Przygotować materiał inokulacyjny w kolbach z aktywowanym osadem lub innym źródłem inokuli (zob. I.6.4) do uzyskania stężenia końcowego większego niż 30 mg zawiesiny ciał stałych/litr. Przygotować także kontrole inokulum w podłożu mineralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia.

Jeśli wymagane, użyć jedno naczynie dla sprawdzenia możliwych działań inhibicyjnych substancji badanej przez inokulację roztworu zawierającego w podłożu mineralnym, porównywalne stężenia substancji tak badanej, jak i chemicznej substancji odniesienia.

Także, jeżeli jest to wymagane, ustawić następną sterylną kolbę dla sprawdzenia, czy badana substancja degraduje się abiotycznie, używając niezaszczepiony roztwór substancji chemicznej (zob. I.6.6).

Dodatkowo, jeżeli podejrzewa się, że badana substancja zostanie zaabsorbowana znacząco w szkle, osadzie itp., wykonać wstępną ocenę prawdopodobnego wzrostu absorpcji, a zatem przydatności badania dla substancji chemicznej (zob. tabela 1). Nastawić kolby zawierające substancję badaną, inokulum i środek sterylizujący.

Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 11 podłożem mineralnym i po wymieszaniu pobrać próbkę z każdej kolby do oznaczenia początkowego stężenia DOC (zob. załącznik II.4). Przykryć otwory kolb np. aluminiową folią, w taki sposób by umożliwić swobodną wymianę powietrza między kolbą i otaczającą atmosferą. Następnie włożyć naczynia do wytrząsarki celem rozpoczęcia badania.

II.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu

Kolby 1 i 2: Zawiesina badana

Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum

Kolba 5: Kontrola procedury

Zalecane oraz gdy konieczne:

Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej

Kolba 7: Kontrola adsorpcji

Kolba 8: Kontrola toksyczności

Zob. także I.6.7.

II.2.6. Przeprowadzenie badania

Poprzez całe badanie oznaczać stężenia DOC w każdej kolbie duplikatu w znanych odstępach czasu, wystarczająco często, by można było oznaczyć 10-dniowe „okno” i usunięcie procentowe na koniec 10-dniowego „okna”. Pobrać tylko minimalną objętość zawiesiny badanej konieczną dla każdego oznaczenia.

Przed pobieraniem próbek zmniejszyć straty parowania z kolb przez dodanie wody rozcieńczającej (I.6.1) w wymaganej ilości, jeśli konieczne. Zamieszać energicznie podłoże kultury przed pobraniem próbki i upewnić się, że materiał przylegający do ścianek naczynia jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Przefiltrować przez filtr membranowy lub odwirować (zob. załącznik II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizować odfiltrowane lub odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechować w 2–4 oC przez maksimum 48 godzin, lub w niższej temperaturze - 18 oC przez czas dłuższy.

II.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

II.3.1. Obróbka wyników

Obliczyć procentową degradację w czasie t, jak podano w I.7.1 (oznaczanie DOC), i – do wyboru – według I.7.2 (właściwa analiza).

Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.

II.3.2. Ważność wyników

Zob. I.5.2.

II.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob. I.8.

II.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

BADANIE DOC METODĄ „DIE-AWAY”

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/l jako substancja chemiczna.

Początkowe stężenie w podłożu, t0: … mg/l jako substancja chemiczna.

4. INOKULUM

Źródło:

Poddano traktowaniu:

Wstępne sezonowanie, jeśli wykonano:

Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: … mg/l

5. OZNACZENIA WĘGLA

Analizator węgla:

Kolba nr

DOC po n dniach (mg/1)

Badana substancja chemiczna plus ino-kulum

a, średnia

Ca(t)

b, średnia

Cb(t)

Ślepa próba inoku-lum bez badanej substancji

c, średnia Cc(t)

d, średnia

Cd(t)

6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH

Kolba nr

% degradacja po n dniach

Srednia (*2)

Uwaga: podobne arkusze można użyć dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności.

7. KONTROLA ABIOTYCZNA (do wyboru)

Czas (dni)

DOC cone, (mg/l) kontrola sterylności

Cs(o)

Cs(t)

8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA (do wyboru)

ilość pozostałości badanej substancji na koniec badania (mg/l)

% pierwotnej degradacji

Kontrola sterylności

Zaszczepione podłoże badawcze

CZĘŚĆ III. ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD (Metoda C.4-B)

III. 1. ZASADA METODY

Zmierzoną objętość podłoża mineralnego zawierające znane stężenie substancji badanej (10–40 mg DOC/litr) jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, zaszczepiono za pomocą 0,5 ml wycieku na litr podłoża. Mieszaninę napowietrza się w ciemności lub w rozproszonym świetle w 22 ± 2 oC.

III.2. OPIS METODY

III.2.1. Przyrząd

a) Kolby stożkowe, np. 250 ml do 2 1, w zależności od objętości wymaganej dla analizy DOC.

c) Przyrząd filtracyjny z odpowiednimi membranami.

d) Analizator DOC.

e) Przyrząd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.

f) Wirówka.

III.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.

Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 80 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.

Niniejsza metoda wykorzystuje tylko 0,5 ml wycieku/litr jako inokulum i dlatego podłoże może wymagać wzmocnienia śladowymi pierwiastkami i czynnikami wzrostu. Wykonuje się to przez dodanie 1 ml każdego z następujących roztworów, na litr końcowego podłoża:

Roztwór pierwiastków śladowych:

Siarczan manganu tetrawodny MnSO4. 4 H2O

39,9 mg

Kwas borowy, H3BO3

57,2 mg

Siarczan cynku heptawodny ZnSO4. 7 H2O

42,8 mg

Heptamolibdenian amonu (NH4)6 Mo7O24

34,7 mg

Fe-chelata (FeCl3 kwasu etylenodiaminotetraoctowego)

100,0 mg

Rozpuścić w i dopełnić do 1 000 ml wodą rozcieńczającą

Roztwór witaminowy:

Ekstrakt drożdży

15,0 mg

Rozpuścić ekstrakt drożdży w 100 ml wody. Sterylizować przez przepuszczenie przez membranę 0,2 mikrona, lub przygotować na świeżo.

III.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum

Inokulum może być otrzymane ze ścieków drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głownie ścieki domowe (zob. I.6.4.2 i I.6.5).

Stosuje się 0,5 ml na litr podłoża mineralnego.

III.2.4. Przygotowanie kolb

Jako przykład wprowadzić porcje 800 ml podłoża mineralnego do 2-litrowych kolb stożkowych i dodać wystarczające objętości roztworów podstawowych substancji badanej i odniesienia do oddzielnych kolb dla uzyskania stężenia równoważnika chemicznego do 10–40 mg DOC/l. Sprawdzić wartość pH i ustawić, gdy konieczne, do 7,4. Zaszczepić kolby wyciekiem ściekowym 0,5 ml/litr (zob. I.6.4.2). Przygotować także kontrole inokulum w podłożu mineralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia.

Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 1 litra podłożem mineralnym i po wymieszaniu pobrać próbkę z każdej kolby do oznaczenia początkowego stężenia DOC (zob. załącznik II.4). Przykryć otwory kolb np. aluminiową folią, w taki sposób by umożliwić swobodną wymianę powietrza między kolbą i otaczającą atmosferą. Następnie włożyć naczynia do wytrząsarki celem rozpoczęcia badania.

III.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu

Kolby 1 i 2: Zawiesina badana

Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum

Kolba 5: Kontrola procedury

i zalecane oraz gdy konieczne:

Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej

Kolba 7: Kontrola adsorpcji

Kolba 8: Kontrola toksyczności

Zob. także I.6.7.

III.2.6. Przeprowadzenie badania

Przed pobieraniem próbek zmniejszyć straty parowania z kolb przez dodanie wody rozcieńczającej (I.6.1) w wymaganej ilości, jeśli konieczne. Zamieszać energicznie podłoże kultury przed pobraniem próbki i upewnić się że materiał przylegający do ścianek naczynia jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Przefiltrować przez filtr membranowy lub odwirować (zob. załącznik II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizować odfiltrowane lub odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechować w 2–4 oC przez maksimum 48 godzin, lub w niższej temperaturze - 18 oC przez czas dłuższy.

III.3. DANE AND SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

III.3.1. Obróbka wyników

Obliczyć procentową degradację w czasie t, jak podano w I.7.1 (oznaczanie DOC), i – do wyboru – pod I.7.2. (właściwa analiza).

Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.

III.3.2. Ważność wyników

Zob. I.5.2.

III.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob. I.8.

III.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr jako substancja chemiczna

Początkowe stężenie w podłożu, to: … mg/litr jako substancja chemiczna

4. INOKULUM

Źródło:

Poddano traktowaniu:

Wstępne sezonowanie, jeśli wykonano:

Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/l

5. OZNACZENIA WĘGLA

Analizator wegla:

Kolba nr

DOC po n dniach (mg/1)

Badana substancja chemiczna plus inokulum

a, średnia

Ca(t)

b, średnia

Cb(t)

Ślepa próba inokulum bez badanej substancji

c, średnia Cc(t)

d, średnia

Cd(t)

6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH

Kolba nr

% degradacja po n dniach

Srednia (*3)

Uwaga: podobne arkusze można stosować dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności.

7. KONTROLA ABIOTYCZNA (do wyboru)

Czas (dni)

DOC cone, (mg/l) kontrola sterylności

Cs(o)

Cs(t)

8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA (do wyboru)

ilość pozostałości badanej substancji na koniec badania (mg/1)

% pierwotnej degradacji

Kontrola sterylności

Zaszczepione podłoże badawcze

CZĘŚĆ IV. BADANIE WYDZIELANIA CO2 (Metoda C.4-C)

IV.1. ZASADA METODY

Zmierzona objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie badanej substancji (10–20 mg DOG lub TOC/l) jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, jest napowietrzana przez przepuszczanie powietrza wolnego od ditlenku węgla z kontrolowaną szybkością w ciemności lub rozproszonym świetle. Degradacja jest prowadzona przez 28 dni przez oznaczanie wytwarzanego ditlenku węgla, który jest pochłaniany w wodorotlenku sodowym lub barowym i mierzony za pomocą miareczkowania pozostałego wodorotlenku lub jako nieorganiczny węgiel. Ilość ditlenku węgla wydzielonego z badanej substancji (skorygowana dla tej uzyskanej ze ślepej próby inokulum) jest wyrażana jako procent ThCO2. Stopień biodegradacji można także obliczyć z dodatkowej analizy DOG wykonanej na początku i końcu inkubacji.

IV.2. OPIS METODY

IV.2.1. Przyrząd

a) Kolby, 2–5 litra, każda zaopatrzona w rurkę napowietrzającą sięgającą blisko dna naczynia i w wylot.

b) Mieszadła magnetyczne przy ocenie słabo rozpuszczalnych substancji chemicznych.

c) Butle absorpcji gazu.

d) Urządzenia do kontroli i pomiaru przepływu powietrza.

e) Przyrząd do przemywania ditlenku węgla, dla przygotowania powietrza wolnego od ditlenku węgla; alternatywnie mieszanina tlenu i azotu wolnych od ditlenku węgla z butli gazowych, używane w prawidłowej proporcji (20 % O2: 80 % N2).

f) Przyrząd do oznaczania ditlenku węgla – albo miareczkowaniem, albo jedną z postaci analizatora węgla nieorganicznego.

g) Urządzenie filtracji membranowej (do wyboru).

h) Analizator DOG (do wyboru).

IV.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. I.6.2.

Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 l wodą rozcieńczającą.

IV.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum

Inokulum można otrzymać z różnych źródeł: aktywowany osad; ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe; gleby lub z mieszaniny tu wymienionych.

Zob. I.6.4., I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.

IV.2.4. Przygotowanie kolb

Przykładowo wskazano następujące objętości i wagi dla 5-litrowych kolb zawierających 3 litry zawiesiny. Jeżeli używa się mniejszych objętości, należy je odpowiednio zmodyfikować, ale należy zapewnić że utworzony ditlenek węgla zostanie zmierzony dokładnie.

Do każdej 5-litrowej kolby dodać 2 400 ml podłoża mineralnego. Dodać odpowiednią objętość przygotowanego aktywowanego osadu (zob. I.6.4.1 i I.6.5) dla otrzymania stężenia zawiesiny ciał stałych niewiększego niż 30 mg/l w końcowej 3-litrowej zaszczepionej mieszaninie. Alternatywnie, rozcieńczyć wpierw przygotowany osad do uzyskania zawiesiny 500–1 000 mg/l w podłożu mineralnym przed dodaniem podwielokrotności do zawartości 5-litrowej kolby, dla uzyskania stężenia 30 mg/l; zapewnia to większą dokładność. Można użyć innych źródeł inokulum (zob. I.6.4.2).

Napowietrzać te zaszczepione mieszaniny powietrzem wolnym od ditlenku węgla przez noc celem przepłukania systemu z ditlenku węgla.

Dodać badany materiał oraz substancje odniesienia oddzielnie, jako znaną objętość roztworów podstawowych, do replikowanych kolb dla uzyskania stężeń wnoszących udział przez dodane substancje chemiczne, 10 do 20 mg DOC lub TOC/l; pozostawić kilka kolb bez dodawania substancji chemicznych jako kontrole inokulum. Dodać badane słabo rozpuszczalne substancje bezpośrednio do kolb na podstawie masy lub objętości lub postępować jak opisano w załączniku III.

Jeżeli wymagane, użyć jedną kolbę do sprawdzenia możliwego działania inhibicyjnego badanej substancji przez dodanie zarówno badanej jak i substancji odniesienia, w tych samych stężeniach jak obecne w innych kolbach.

Także, jeżeli wymagane, użyć sterylnej kolby do sprawdzenia czy badana substancja jest degradowana abiotycznie przez użycie niezaszczepionego roztworu substancji chemicznej (zob. I.6.6). Sterylizować przez dodanie substancji toksycznej o odpowiednim stężeniu.

Dopełnić objętości zawiesin we wszystkich kolbach do 3l dodając podłoże mineralne uprzednio napowietrzone powietrzem wolnym od CO2. Alternatywnie, można pobrać próbki do analizy DOC (zob. załącznik II.4) i/lub właściwej analizy. Podłączyć butle absorpcyjne do wylotów powietrza kolb.

Jeżeli używany jest wodorotlenek baru, połączyć trzy butle absorpcyjne, każda zawierająca 100 ml 0,0125 M roztworu wodorotlenku baru, w seriach do kazdej 5-litrowej kolby. Roztwór musi być wolny od wytrąconych siarczanów oraz węglanów i jego stężenie musi być oznaczone bezpośrednio przed użyciem. Jeżeli używa się wodorotlenek sodu, podłączyć dwie pułapki, druga działa jako kontrola pokazania, że cały ditlenek węgla został zaabsorbowany w pierwszej. Butle absorpcyjne wyposażone w zamknięcia typu kroplówkowego są odpowiednie. Dodać 200 ml 0,05 M wodorotlenku sodu do każdej butli, która jest odpowiednia do zaabsorbowania całkowitej ilości ditlenku węgla wydzielonego po całkowitej degradacji badanej substancji. Roztwory wodorotlenku sodu, nawet świeżo przygotowane, mogą zawierać ślady węglanów; jest to korygowane przez odjęcie węglanów ze ślepej próby.

IV.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu

Kolby 1 i 2: Zawiesina badana

Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum

Kolba 5: Kontrola procedury

oraz zalecane i gdy konieczne:

Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej

Kolba 7: Kontrola toksyczności

Kolba 8: Kontrola toksyczności

Zob. także I.6.7.

IV.2.6. Przeprowadzenie badania

Rozpocząć badanie przez wpuszczenie pęcherzyków powietrza wolnego od ditlenku węgla przez zawiesiny z szybkością 30–100 ml/min. Pobierać próbki absorbenta ditlenku węgla okresowo do analiz na zawartość CO2. W trakcie pierwszych dziesięciu dni zalecane jest, by analizy były wykonywane co drugi lub trzeci dzień, a następnie co piąty, aż do 28 dnia, tak by okres 10-dniowego okna był zidentyfikowany.

W dniu 28 pobrać próbki (do wyboru) do analizy DOC i/lub właściwej analizy, pomierzyć pH zawiesin i dodać 1 ml stężonego kwasu solnego do każdej kolby; napowietrzać przez noc do wypędzenia ditlenku węgla obecnego w badanych zawiesinach. Dnia 29 wykonać analizę wydzielonego ditlenku węgla.

W dniu pomiaru CO2 rozłączyć absorber wodorotlenku baru najbliższy kolby i zmiareczkować roztwór wodorotlenku za pomocą HCl 0,05 M, stosując fenoloftaleinę jako wskaźnik. Przesunąć pozostałe absorbery o jedno miejsce bliżej kolby i umieścić nowy absorber zawierający 100 ml świeżego 0,0125 M wodorotlenku baru na dalszym końcu serii. Wykonać miareczkowania według potrzeby, na przykład gdy podstawowe strącenie jest widoczne w pierwszej pułapce i przed strąceniem w drugim, lub co najmniej co tydzień. Alternatywnie, z NaOH jako absorbentem, pobrać strzykawką małą próbkę (w zależności od charakterystyki stosowanego analizatora węgla) roztworu wodorotlenku sodu z absorbera najbliższego kolbie. Wstrzyknąć próbkę do części IC analizatora węgla do bezpośredniej analizy wydzielonego ditlenku węgla.

Analizować zawartość drugiej pułapki tylko na koniec badania dla skorygowania przenoszenia ditlenku węgla.

IV.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

IV.3.1. Obróbka wyników

Ilość CO2 zatrzymana w absorberze przy miareczkowaniu jest dana przez:

mgCO2 = (100 × CB

0,5 × V × CA) × 44

gdzie:

objętość HCl użytego do miareczkowania 100 ml w absorberze (ml),

stężenie roztworu wodorotlenku baru (M),

stężenie roztworu kwasu solnego (M),

jeśli CB wynosi 0,0125 M i CA jest 0,05 M, miareczkowanie 100 ml wodorotlenku baru daje 50 ml, a waga CO2 jest dana przez:

Zatem w tym przypadku dla przeliczenia objętości HCl miareczkującego na wytworzone miligramy CO2, współczynnik wynosi 1,1.

Obliczyć wagi wytworzonego CO2 z samego inokulum oraz z inokulum plus badana substancja używając odnośne wartości miareczkowania, a różnica jest wagą CO2 wytworzonego przez samą badaną substancję.

Przykładowo, jeżeli samo inokulum daje zmiareczkowane 48 ml oraz inokulum plus badana substancja daje 45 ml,

CO2 z inokulum = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg

CO2 z inokulum plus badana substancja = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg

Zatem waga CO2 wytworzonego z badanej substancji wynosi 3,3 mg.

Procentowa biodegradacja jest obliczana z:

lub,

3,67 istniejący współczynnik konwersji (44/12) węgla do ditlenku węgla.

Uzyskać procentową degradację po każdym przedziale czasu przez dodanie stosunków procentowych wartości ThCO2 obliczonych dla każdego z dni, do czasu w jakim zmierzono.

Dla absorberów z wodorotlenkiem sodu, obliczyć ilość wytworzonego ditlenku węgla, wyrażając jako IC (mg), przez pomnożenie stężenia IC w absorbencie przez objętość absorbenta.

Obliczyć procentową degradację z:

Obliczyć usunięcie DOC (do wyboru) jak opisano pod I.7. Zapisać te i wszystkie inne wyniki na przygotowanych arkuszach danych.

IV.3.2. Ważność wyników

Zawartość IC zawiesiny badanej substancja w podłożu mineralnym na początku badania musi być mniejsza niż 5 % wartości TC, a całkowite wydzielanie CO2 w ślepej próbie z inokulum na końcu badania nie powinna zwykle przekraczać 40 mg/l podłoża. Jeżeli uzyskuje się wartości wyższe niż 70 mg CO2/litr, dane i technika eksperymentalna muszą być krytycznie przebadane.

Zob. także I.5.2.

IV.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob. I.8.

IV.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

BADANIE WYDZIELANIA DITLENKU WĘGLA

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr jako substancja chemiczna

Wstępne stężenie. w podłożu: … mg/litr jako substancja chemiczna

Całkowity C dodany do kolby: … mg C

ThCO2: mg CO2

4. INOKULUM

Źródło:

Poddano traktowaniu:

Przygotowanie wstępne, o ile stosowano:

Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/litr

5. WYTWARZANIE DITLENKU WĘGLA I DEGRADOWALNOŚĆ

Metoda: Ba(OH)/NaOH/inne

Czas

(dzień)

CO2 utworzonego w badaniu

(mg) CO2 utworzonego w ślepej próbie

(mg) CO2 utworzony zbiorczo (mg)

(badanie minus średnia ślepej próby)

ThCO2

zbiorczo

średnia

Uwaga: podobne arkusze mogą być używane dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności

6. ANALIZA WĘGLA (do wyboru)

Analizator węgla:

Czas (dzień)

Ślepa próba mg/l

Badana substancja chemiczna mg/l

Cb(o)

28 (*4)

Cb(t)

7. DEGRADACJA ABIOTYCZNA (do wyboru)

CZĘŚĆ V. BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ (Metoda C.4-D)

V.1. ZASADA METODY

Zmierzona objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie badanej substancji (100 mg/litr substancji badanej, dająca co najmniej 50–100 mg ThOD/litr) jako nominalnego pojedynczego źródła węgla organicznego, jest mieszana w zamkniętej kolbie w stałej temperaturze (± 1o C lub bliżej) do 28 dnia włącznie. Zużycie tlenu jest oznaczane albo przez pomiary ilości tlenu (wytwarzanego elektrolitycznie) wymaganego do utrzymania stałej objętości gazu w kolbie respirometru, lub przez zmianę w objętości lub ciśnieniu (lub w kombinacji dwóch) w aparacie. Wydzielany ditlenek węgla jest absorbowany w roztworze wodorotlenku potasu lub w innym odpowiednim absorbencie. Ilość tlenu pobrana przez badaną substancję (skorygowana o pobór w ślepej próbie z inokulum, biegnącej równolegle) jest wyrażana jako stosunek procentowy ThOD lub COD. Alternatywnie, pierwotna biodegradacja może być także obliczona z dodatkowych właściwych analiz wykonanych na początku i końcu inkubacji, i ostatecznie przez analizę DOC.

V.2. OPIS METODY

V.2.1. Przyrząd

a) odpowiedni respirometr;

b) regulator temperatury, utrzymujący ± 1 oC lub lepszą;

c) urządzenie do filtracji membranowej (do wyboru);

d) analizator węgla (do wyboru).

V.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.

Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.

V.2.3. Przygotowanie i przygotowanie wstępne inokulum

Inokulum może być uzyskane z różnych źródeł: aktywowany osad; ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe i gleby lub mieszanina wymienionych.

Zob. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.

V.2.4. Przygotowanie kolb

Przygotować roztwory badane oraz chemicznej substancji odniesienia, w oddzielnych partiach, w podłożu mineralnym równoważnym stężeniu, zwykle 100 mg substancji chemicznej/litr (dający co najmniej 50–100 mg ThOD/litr), stosując roztwory podstawowe.

Obliczyć ThOD na podstawie tworzenia się soli amonowych, poza spodziewaną nitryfikacją, dla której należy oprzeć obliczenia na tworzeniu się azotanów (zob. załącznik II.2.)

Oznaczyć wartości pH i jeśli konieczne, ustawić na 7,4

±0,2.

Substancje słabo rozpuszczalne należy dodawać na dalszym etapie (zob. poniżej).

Jeżeli ma być ustalona toksyczność badanej substancji, przygotować dalszy roztwór z podłoża mineralnego zawierającego zarówno substancję badaną jak i chemiczną substancję odniesienia o tych samych stężeniach co w poszczególnych roztworach.

Jeżeli wymagany jest pomiar fizyko-chemicznego poboru tlenu, przygotować roztwór badanej substancji zwykle 100 mg ThOD/litr który został sterylizowany dodatkiem odpowiedniej toksycznej substancji (zob. I.6.6).

Wprowadzić konieczne objętości roztworów badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia, odpowiednio, w co najmniej zdublowanych kolbach. Dodać do następnych kolb tylko podłoże mineralne (dla kontroli inokulum) i, jeśli wymagane, zmieszane roztwory substancja badana/substancja odniesienia i roztwór sterylny.

Jeśli badana substancja chemiczna jest słabo rozpuszczalna, dodać ją bezpośrednio na niniejszym etapie na podstawie wagi lub objętości lub postępować jak opisano w dodatku III. Dodać wodorotlenek potasu, tabletki wapna sodowanego lub innego absorbenta do zbiorników absorbera CO2.

V.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu

Kolby 1 i 2: Zawiesina badana

Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum

Kolba 5: Kontrola procedury

Zalecane i gdy konieczne:

Kolba 6: Kontrola sterylna

Kolba 7: Kontrola toksyczności

Kolba 8: Kontrola toksyczności

Zob. także I.6.7.

V.2.6. Przeprowadzenie badania

Pozwolić na uzyskanie przez naczynia żądanej temperatury i zaszczepić odpowiednie naczynia przygotowanym aktywowanym osadem lub innym źródłem inokulum by otrzymać stężenie zawiesiny ciał stałych niewiększe niż 30 mg/litr. Zestawić wyposażenie, włączyć mieszanie i sprawdzić szczelność, rozpocząć pomiar pobierania tlenu. Zwykle niewymagana jest dalsza uwaga inna niż zbieranie koniecznych danych i wykonywanie codziennych sprawdzeń czy jest utrzymywane są właściwa temperatura i stosowne mieszanie.

Obliczyć pobieranie tlenu z odczytów zbieranych w regularnych i częstych przedziałach czasowych, stosując metody podane przez producenta wyposażenia. Pod koniec inkubacji, zwykle 28-dniowej, zmierzyć pH zawartości kolb, szczególnie jeśli pobieranie tlenu jest niższe lub większe niż ThODNH4 (dla związków zawierających azot).

Jeżeli wymagane, pobrać próbki z kolb respiratora, początkowej i końcowej, do analizy DOC lub właściwej chemicznej (zob. załącznik II.4). Przy początkowym pobieraniu upewnić się, że objętość zawiesiny badanej pozostającej w kolbie jest znana. Gdy tlen zostanie pobrany przez substancję badaną zawierającą azot, oznaczyć wzrost stężenia azotynów oraz azotanów przez okres 28 dni i obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację (załącznik V).

V.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

V.3.1. Obróbka wyników

Podzielić pobór tlenu (mg) przez badaną substancję po danym czasie (skorygować o tę ze ślepej kontroli inokulum po tym samym czasie) przez wagę użytej badanej substancji. Da to BOD wyrażone jako mg tlenu/mg badanej substancji, czyli

= mg O2 na mg badanej substancji.

obliczyć procentową biodegradacje albo z:

lub postaci

Należy zauważyć że te dwie metody niekoniecznie muszą dawać te same wartości; korzystniejsze jest użycie pierwszej metody.

Dla badanych substancji zawierających azot stosuje się odpowiednie ThOD (NH4 lub N03) zgodnie z tym co jest znane lub oczekiwane o zajściu nitryfikacji (załącznik II.2). Jeżeli nitryfikacja zachodzi, lecz nie jest całkowita, obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację ze zmian w stężeniu azotynów i azotanów (załącznik V).

Gdy wykonano alternatywne oznaczenia węgla organicznego i/lub właściwej substancji chemicznej, obliczyć procentową degradację, jak opisano pod I.7.

Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.

V.3.2. Ważność wyników

Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20–30 mg O2/litr i powinno być niewiększe niż 60 mg/litr w ciągu 28 dni. Wartości wyższe od 60 mg/litr wymagają krytycznego sprawdzenia danych i technik eksperymentalnych. Jeżeli wartość pH jest poza zakresem 6–8,5, a zużycie tlenu przez badaną substancję jest mniejsze niż 60 %, należy powtórzyć badanie z niższym stężeniem badanej substancji.

Zob. także 1.5.2.

V.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob. 1.8.

V.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr

Początkowe stężenie w podłożu, C : … mg/litr

Objętość w kolbie do badań (V): ml

ThOD lub COD: mg O2/mg substancji badanej (NH4, N03)

4. INOKULUM

Źródło:

Poddano traktowaniu:

Wstępne sezonowanie, o ile wykonano:

Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: … mg/l

5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNOŚĆ

Czas (dni)

O2 pobór (mg) badana substancja

a, średnia

O2 pobór (mg)

b, średnia

skorygowane BOD (mg)

(a1- bm)

(a2- bm)

BOD na mg badanej substancji

% degradacja

D1 (a1)

D2 (a2)

średnia (*5)

V = objętość podłoża w kolbie do badań

Uwaga: Podobne arkusze używać można do chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności

6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI (zob. załącznik V)

Dzien

Roznica

(i) Steżenie azotanów (mg N/litr)

(N)

(ii) równoważnik tlenu (4,57 × N × V) (mg)

— —

(iii) Steżenie azotynów (mg N/litr)

(N)

(iv) równoważnik tlenu (3,43 × N × V) (mg)

— —

(ii + iv)

Całkowity równoważnik tlenu

— —

7. ANALIZA WĘGLA (alternatywna)

Analizator węgla:

Czas (dzień)

Ślepa proba mg/litr

Badana substancja chemiczna mg/litr

(Cblo)

(C0)

28 (*6)

(Cblt)

(Ct)

8. WŁASCIWA CHEMICZNA (alternatywna)

stężenie w fizyko-chemicznej (sterylnej) kontroli w 28 dniu

stężenie w zaszczepionej kolbie w 28 dniu

9. DEGRADACJA ABIOTYCZNA (alternatywna)

zużycie tlenu w sterylnej kolbie po 28 dniach, (mg)

(zob. sekcje 1 i 3)

CZĘŚĆ VI. BADANIE „ZAMKNIĘTEJ BUTLI”(Metoda C.4-E)

VI. 1. ZASADA METODY BADANIA

Roztwór badanej substancji w podłożu mineralnym, zwykle 2–5 mg/litr, jest zaszczepiany relatywnie małą liczbą drobnoustrojów ze zmieszanej populacji i trzymany w całkowicie pełnej, zamkniętej butli w ciemności w stałej temperaturze. Degradacja jest oznaczana przez analizę rozpuszczonego tlenu przez okres czasu 28 dni. Ilość tlenu pobrana przez badaną substancję, skorygowany o pobór w równoległej ślepej próbie z inokulum, jest wyrażona jako stosunek procentowy ThOD lub COD.

VI.2. OPIS METODY

VI.2.1. Przyrząd

a) Butle BOD, ze szklanymi korkami, np. 250–300 ml.

b) Łaźnia wodna lub inkubator, dla trzymania butli w stałej temperaturze (± 1 oC lub lepiej) przy wyłączonym świetle.

c) Duże szklane butle (2–5 litrów) dla przygotowania podłoża i napełniania butli BOD.

d) Elektroda tlenowa i miernik, lub wyposażenie oraz odczynniki dla miareczkowania Winklera.

VI.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. 1.6.2.

Zmieszać 1 (jeden) ml roztworu (a) z (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.

VI.2.3. Przygotowanie inokulum

Inokulum jest zwykle uzyskiwane ze ścieku drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzenia skali laboratoryjnej przyjmującego głównie ścieki domowe. Alternatywnym źródłem inokulum są wody powierzchniowe. Zwykle używa się od jednej kropli (0,05 ml) do 5 ml filtratu na litr podłoża; konieczne mogą być próby dla znalezienia optymalnej objętości danego wycieku (zob. I.6.4.2 i I.6.5).

VI.2.4. Przygotowanie kolb

Silnie napowietrzyć podłoże mineralne na co najmniej 20 min. Przeprowadzić każdą serię badań z podłożem mineralnym pochodzącym z tej samej partii. Ogólnie, podłoże jest gotowe do użycia po odstaniu 20 h, w temperaturze badania. Oznaczyć stężenie rozpuszczonego tlenu do celów kontrolnych; wartość powinna wynosić około 9 mg/litr w 20 oC. Prowadzić wszystkie przenoszenia i operacje napełniania nasyconym podłożem wolnym od pęcherzyków, na przykład poprzez użycie syfonów.

Przygotować równoległe grupy butli BOD dla oznaczeń badanej i chemicznej substancji odniesienia w równoczesnych seriach doświadczalnych. Zestawić wystarczającą liczbę butli BOD, włączając ślepe próby inokulum, wykonać co najmniej zdublowane pomiary zużycia tlenu w pożądanych odstępach badawczych, na przykład po 0, 7, 14, 21 i 28 dniach. Dla zapewnienia zdolności identyfikacji 10-dniowego okna wymagana jest większa ilość butli.

Dodać całkowicie napowietrzone podłoże mineralne do dużych butli, tak by były wypełnione w około jednej trzeciej. Następnie dodać wystarczającą ilość roztworu podstawowego badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia do oddzielnych dużych butli tak by końcowe stężenie substancji chemicznej zwykle było niewiększe niż 10 mg/litr. Nie dodawać substancji chemicznej do podłoża kontrolnego ślepej próby zawartego w następnej dużej butli.

W celu zapewnienia, że aktywność inokulum nie jest ograniczona, stężenie rozpuszczonego tlenu nie może być poniżej 0,5 mg/litr w butli BOD. To ogranicza stężenie badanej substancji do około 2 mg/litr. Jednakże dla słabo rozpuszczalnych związków i tych o niskim ThOD można użyć 5–10 mg/litr. W kilku przypadkach jest zalecane przeprowadzenie równoległych serii badań badanej substancji o dwu różnych stężeniach na przykład, 2 i 5 mg/litr. Zwykle oblicza się ThOD na podstawie tworzenia się soli amonowych, lecz jeżeli oczekiwana lub znana jest fakt, że może zajść nitryfikacja, oblicza się go na podstawie tworzenia azotanu (ThODNO3: zob. załącznik II.2). Jednakże jeśli nitryfikacja nie jest całkowita, ale zaszła, należy skorygować zmiany w stężeniu azotynu i azotanu, oznaczone analitycznie (zob. załącznik V).

Jeżeli jest do zbadania toksyczność badanej substancji (w przypadku, na przykład, gdy znaleziono wcześniejsze wartości niskiej biodegradowalności), jest konieczna inna seria butli.

Przygotować inna dużą butlę do pomieszczenia napowietrzonego podłoża mineralnego (do około jednej trzeciej jej objętości) plus badana substancja i chemiczna substancja odniesienia o końcowych stężeniach zwykle takich samych jak w tych z innych dużych butli.

Zaszczepić roztwory w dużych butlach ściekiem drugiego stopnia (jedną kroplą (0,05 ml), lub do 5 ml/litr)) lub z innego źródła, na przykład wody rzecznej (zob. I.6.4.2). Na koniec dopełnić roztwory do objętości napowietrzonym podłożem mineralnym stosując wąż wpuszczony na dno butli dla uzyskania odpowiedniego mieszania.

VI.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu

W typowym przebiegu stosuje się następujące butle:

— co najmniej 10 zawierających badaną substancję i inokulum (zawiesina badana),

— co najmniej 10 zawierających tylko inokulum (ślepa próba z inokulum),

— co najmniej 10 zawierających chemiczna substancja odniesienia i inokulum (procedura kontroli),

— i, gdy konieczne, 6 butli zawierających badaną substancję, chemiczną substancję odniesienia i inokulum (kontrola toksyczności). Jednakże dla zapewnienia zdolności identyfikacji 10-dniowego okna konieczna może być około dwukrotnie większa ilość butli.

VI.2.6. Przeprowadzenie badania

Rozdzielić przygotowany roztwór niezwłocznie do odpowiednich grup butli BOD za pomocą węża z dolnej ćwiartki (nie z dna) do odpowiednio dużych butli, tak aby wszystkie butle BOD zostały całkowicie napełnione. Postukać delikatnie, by usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Analizować butle o zerowym czasie niezwłocznie na zawartość rozpuszczonego tlenu metodą Winkler lub elektrodowo. Zawartość butli może być zabezpieczona dla późniejszej analizy metodą Winklera przez dodanie siarczanu manganu (II) i wodorotlenku sodu (pierwszy odczynnik Winklera). Przechowywać w starannie zamkniętych, zawierających związany tlen jako brązowy uwodniony tlenek manganu (III), w ciemności w temperaturze 10–20 oC przez nie dłużej niż 24 godziny przed wykonaniem pozostałych kroków metody Winklera. Zakorkować pozostałe replikowane butle, upewniając się, że nie zawierają pęcherzyków powietrza, i inkubować w 20 oC w ciemności. Każdej serii musi towarzyszyć całkowita seria równoległa z zaszczepionymi podłożami ślepej próby. Wyjąć co najmniej zdublowane butle wszystkich serii w celu analizy rozpuszczonego tlenu w odstępach czasu (co najmniej cotygodniowo) przez 28 dni inkubacji.

Cotygodniowe pobieranie próbek powinno umożliwić ocenę stosunku procentowego usunięcia w 14-dniowym oknie, przy czym pobieranie próbek co 3–4 dni powinno umożliwić identyfikację 10-dniowego okna, wymaganego około podwójnie co większość butli.

Dla substancji badanych zawierających azot należy wykonać korekty poboru tlenu przez każdą zachodzącą nitryfikację. By to wykonać, użyć metody O2-elektrody dla oznaczania stężenia rozpuszczonego tlenu i następnie pobrać próbkę z butli BOD do analizy na azotyny i azotany. Ze wzrostu stężenia azotynów i azotanów, obliczyć użyty tlen (zob. załącznik V).

VI. 3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

VI.3.1. Obróbka wyników

Wpierw obliczyć BOD użyte po każdym okresie czasu przez odejmowanie zubożenia tlenu (mg/litr) ślepej próby z inokulum od tej wykazanej przez badaną substancję. Podzielić to poprawione zubożenie przez stężenie(mg/litr) badanej substancji, aby uzyskać właściwe BOD jako mg tlenu na mg badanej substancji. Obliczyć procentową biodegradowalność przez podzielenie właściwego BOD przez właściwe ThOD (obliczonego zgodnie z załącznikiem II.2) lub COD (oznaczonego przez analizę, zob. załącznik II.3), zatem:

= mg O2/mg badana substancja

lub

Należy zauważyć, że te dwie metody niekoniecznie dają te same wartości; korzystne jest użycie pierwszej metody.

Dla badanych substancji zawierających azot użyć odpowiednie ThOD (NH4 lub N03) zgodnie z tym, co jest znane lub oczekiwane o występowaniu nitryfikacji (załącznik II.2). Jeżeli nitryfikacja zachodzi lecz nie jest całkowita, obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację ze zmiany w stężeniu azotynów i azotanów (załącznik V).

VI.3.2. Ważność wyników

Zubożenie tlenu w ślepej próbie z inokulum nie powinno przekraczać 1,5 mg rozpuszczonego tlenu/litr po 28 dniach. Wyższe wartości wymagają prześledzenia techniki eksperymentalnej. Resztkowe stężenie tlenu w badanych butlach nie powinno nigdy spaść poniżej 0,5 mg/litr. Takie niskie poziomy tlenu są ważne, gdy stosowana metoda oznaczania rozpuszczonego tlenu jest zdolna do dokładnego pomiaru takich poziomów.

Zob. także I.5.2.

VI.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob. I.8.

VI.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

BADANIE METODĄ „ZAMKNIĘTEJ BUTLI”

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr

Początkowe stężenie w butli: … mg/litr

ThOD lub COD: … mg O2/mg substancji badanej

4. INOKULUM

Źródło:

Poddano traktowaniu:

Przygotowanie wstępne, o ile stosowano:

Stężenie w mieszaninie reakcyjnej: … mg/litr

5. OZNACZANIE DO

Metoda: Winklera/elektrodowa

Analizy kolb

Czas inkubacji (d)

DO mg/l)

Ślepa próba -(bez substancji chemicznej

Średnia

Badana substancja chemiczna

Średnia

Uwaga: Podobny arkusz może być stosowany dla substancji odniesienia i kontroli toksyczności.

6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI (zob. załącznik V)

Czas inkubacji (d)

(i) Stężenie azotanu (mg N/litr)

(ii) Zmiana w stężeniu azotanu (mg N/litr)

— (iii)

Równoważnik tlenu (mg/litr)

— (iv)

Stężenie azotynu (mg N/litr)

(v) Zmiana w stężeniu azotynu (mg N/litr)

— (vi)

Równoważnik tlenu (mg/litr)

— (iii + vi)

Całkowity równoważnik tlenu (mg/litr)

— 7. ZUBOŻENIE DO: % DEGRADACJA

Zubożenie po n dniach (mg/litr)

KOLBA 1: (mto- mtx) – (mbo – mbx)

KOLBA 2: (mto- mtx) – (mbo- mbx)

KOLBA 1:

KOLBA 2:

% D średnia (*7) =

mto

wartość w badanej kolbie w czasie 0

mtx

wartość w badanej kolbie w czasie x

mbo

średnia wartość ślepej próby w czasie 0

mbx

średnia wartość ślepej próby w czasie x

Zastosować także poprawkę dla nitryfikacji z (iii + vi) w sekcji 6.

8. ZUBOŻENIA DO W ŚLEPYCH PRÓBACH

Zużycie tlenu przez ślepą próbę: (mbo – mb28) mg/litr. Niniejsze zużycie jest istotne dla ważności naukowej badania. Powinno być mniejsze niż 1,5 mg/litr.

CZĘŚĆ VII. BADANIE M.I.T.I. (Metoda C.4-F)

VII.1. ZASADA METODY

Pobieranie tlenu trakcie mieszania roztworu lub zawiesiny badanej substancji w podłożu mineralnym, zaszczepionego specjalnie hodowanymi, nieadoptowanymi drobnoustrojami, jest mierzone automatycznie w ciągu okresu 28 dni w zaciemnionym, zamkniętym respirometrze w 25 ± 1 oC. Wydzielany ditlenek węgla jest absorbowany przez wapno sodowane. Biodegradowalność jest wyrażana jako procent pobieranego tlenu (skorygowany dla poboru w ślepej próbie) poboru teoretycznego (ThOD). Procent pierwotnej biodegradowalności jest również obliczany z dodatkowej właściwej analizy chemicznej wykonywanej na początku i pod koniec inkubacji oraz, alternatywnie, przez analizę DOC.

VII.2. OPIS METODY

VII.2.1. Przyrząd

a) Automatyczny elektrolityczny miernik BOD respirometr zwykle wyposażony w 6 butli, każda 300 ml i zaopatrzony w kubki na substancję absorbującą CO2.

b) Stała temperatura pokojowa i/lub łaźnia wodna 25 oC ± 1 oC lub lepszej.

c) Zespół filtracji membranowej (alternatywny).

d) Analizator węgla (alternatywny).

VII.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego

Przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki czystości analitycznej i wodę (I.6.1.):

a) Diwodoroortofosforan potasu, KH2P04

8,50 g

monowodoroortofosforan dipotasu, K2HP04

21,75 g

monowodoroortofosforan disodu, dodekawodny Na2HP04 12 H20

44,60 g

chlorek amonu, NH4Cl

1,70 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

Wartośc pH roztworu powinna wynosić 7,2 .

b) Siarczan magnezu, heptawodny MgSO4 7 H20

22,50 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

c) Chlorek wapnia bezwodny, CaCl2

27,50 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

d) Chlorek żelaza (III), heksawodny FeCl3 6 H20

27,50 g

Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.

Pobrać 3 ml każdego roztworu (a), (b), (c) i (d) i dopełnić do 1 litra.

VII.2.3. Przygotowanie inokulum

Zebrać świeże próbki z nie więcej niż dziesięciu miejsc, głównie z obszarów, gdzie stosowana i unieszkodliwiana jest duża rozmaitość substancji chemicznych. Z takich miejsc, jak oczyszczalnie ścieków, oczyszczalnie ścieków wodnych przemysłowych, rzek, jezior, mórz, zebrać 1 litrowe próbki osadu, gleby powierzchniowej, wody itp. i dokładnie wymieszać. Po usunięciu ciał znajdujących się na powierzchni i odstawieniu ustawić pH nadsączu na 7 ± 1 za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu fosforowego.

Użyć odpowiednią objętość odfiltrowanego nadsączu napełnienia zbiornika, służącego do napełniania i wylewania aktywowanego osadu, i napowietrzać roztwór około 23 1/2 godziny. Trzydzieści minut po wstrzymaniu napowietrzania odrzucić około jednej trzeciej całej objętości nadsączu i dodać równą objętość roztworu (pH 7) zawierającego po 0,1 % glukozy, peptonu i ortofosforanu potasu w celu zsedymentowania materiału i rozpocząć ponowne napowietrzanie. Powtarzać niniejszą procedurę raz dziennie. Zbiornik z osadem należy obsługiwać zgodnie z dobrą praktyką: ciecz musi być klarowna, temperaturę należy utrzymywać w 25 ± 2 oC, pH powinno wynosić 7 ± 1, osad należy prawidłowo osadzać, należy utrzymywać wystarczające napowietrzanie mieszaniny aerobowej przez cały czas, powinny być obecne pierwotniaki a aktywność osadu należy badać względem substancji odniesienia co najmniej raz na trzy miesiące. Nie używać osadu jako inokulum, przed upływem co najmniej miesiąca jego utrzymywania i po okresie dłuższym od czterech miesięcy. Następnie pobierać próbki z co najmniej 10 miejsc w regularnych odstępach czasu, raz na trzy miesiące.

W celu utrzymania świeżego i starego osadu w tej samej aktywności zmieszać odfiltrowany nadsącz aktywowanego bieżąco używanego osadu z równą objętością odfiltrowanego nadsączu z mieszaniny zebranej z dziesięciu źródeł i prowadzić kulturę połączonej cieczy, jak powyżej. Pobrać osad do użycia jako inokulum 18–24 godzin po zasileniu zbiornika.

VII.2.4. Przygotowanie kolb

Przygotować następujące sześć kolb:

Nr 1: badana substancja w wodzie rozcieńczającej w 100 mg/l

Nr 2, 3 i 4: badana substancja w podłożu mineralnym w 100 mg/l

Nr 5: chemiczna substancja odniesienia (np. anilina) w podłożu mineralnym w 100 mg/l

Nr 6: tylko podłoże mineralne

Dodać słabo rozpuszczalną badaną substancję bezpośrednio na podstawie wagi lub objętości lub postępować jak opisano w załączniku III, poza przypadkiem, gdy nie należy używać ani rozpuszczalników, ani środków emulsyfikujących. Dodać absorbent CO2 do wszystkich kolb w przygotowanych specjalnych kubkach. Ustawić pH w kolbach nr 2, 3 i 4 na 7,0.

VII.2.5. Przeprowadzenie badania

Zaszczepić kolby nr 2, 3 i 4 (zawiesina badana), nr 5 (kontrola aktywności) i nr 6 (inokulum ślepa próba) małą objętością inokulum, by uzyskać stężenie 30 mg/l zawiesiny ciał stałych. Niedodawane jest inokulum do kolby nr 1, która służy jako kontrola abiotyczna. Zestawić wyposażenie, sprawdzić szczelność, włączyć mieszadła, i rozpocząć pomiar pobierania tlenu w warunkach ciemności. Codziennie sprawdzać temperaturę, mieszadła i rejestrator kulometrycznego pobierania tlenu, notować wszystkie zmiany w kolorze zawartości kolb. Bezpośrednio odczytywać pobieranie tlenu w sześciu kolbach odpowiednią metodą, na przykład z sześciopunktowego rejestratora drukującego krzywe BOD. Na koniec inkubacji, zwykle 28 dni, zmierzyć pH zawartości kolb i oznaczyć stężenie pozostałości badanej substancji i wszystkich pośrednich, a w przypadku substancji rozpuszczalnych w wodzie, stężenie DOC (załącznik II.4). Zwrócić szczególną uwagę w przypadku lotnych substancji chemicznych. Jeżeli przewidywana jest nitryfikacja, oznaczyć jeżeli możliwe, stężenie azotynów i azotanów.

VII. 3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

VII.3.1. Obróbka wyników

Podzielić ilość pobranego tlenu (mg) przez badaną substancję po danym czasie (skorygować o wartość pobraną w ślepej próbie kontroli inokulum po tym samym czasie), przez wagę użytej badanej substancji. Daje to BOD wyrażone jako mg tlenu/mg badana substancja, czyli:

= mg 02/mg badana substancja.

Procentowa biodegradacja jest zatem otrzymywana z:

Dla mieszanin obliczyć ThOD z analizy składników jak dla pojedynczych związków. Użyć odpowiednie ThOD (ThODNH4 lub ThODN03) w zależności, czy nitryfikacja jest obecna czy ukończona (załącznik II.2). Jeżeli jednakże nitryfikacja zachodzi, ale nie jest całkowita, wykonać poprawkę dla tlenu zużytego w nitryfikacji, wyliczonego ze zmian stężeń azotynów i azotanów (załącznik V).

Obliczyć procentową pierwotna biodegradację ze straty właściwej macierzystej substancji chemicznej (zob. 1.7.2).

Jeżeli zaszła strata badanej substancji w kolbie nr 1 mierzącej fizyko-chemiczne usunięcie, zarejestrować to i użyć stężenia badanej substancji (Sb) po 28 dniach w tej kolbie dla obliczenia procentowej biodegradacji.

Jeżeli wykonano oznaczenia DOC (alternatywne), obliczyć ostateczną procentową biodegradację z:

jak opisano w pkt 1.7.1. Jeśli nie wystąpiła strata DOC w kolbie nr 1, mierzącej fizyko-chemiczne usunięcie, użyć stężenia DOC w niniejsze kolbie do obliczenia procentowej biodegradacji.

Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.

VII.3.2. Ważność wyników

Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20–30 mg O2/l i powinno być nie większe niż 60 mg/l w ciągu 28 dni. Wartości wyższe od 60 mg/l wymagają krytycznego sprawdzenia danych i technik eksperymentalnych. Jeżeli wartość pH jest poza zakresem 6–8,5, a zużycie tlenu przez badaną substancję jest mniejsze niż 60 %, należy powtórzyć badanie z niższym stężeniem badanej substancji.

Zob. także I.5.2.

Jeżeli procentowa degradacja aniliny obliczona ze zużycia tlenu nie przekracza 40 % po 7 dniach i 65 % po 14 dniach, badanie uważane jest za nieważne.

VII.3.3. Sporządzanie sprawozdania

Zob.: I.8.

VII.4. ARKUSZ DANYCH

Przykład arkusza danych podano poniżej.

BADANIE MITI (I)

1. LABORATORIUM

2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA

3. SUBSTANCJA BADANA

Nazwa:

Stężenie roztworu podstawowego: … mg/l jako substancja chemiczna

Początkowe stężenie w podłożu, CO: … mg/l jako substancja chemiczna

Objętość mieszaniny reakcyjnej, V: … ml

ThOD: … mg O2/l

4. INOKULUM

Miejsca pobierania osadu kanalizacyjnego:

1) …

6) …

2) …

7) …

3) …

8) …

4) …

9) …

5) …

10) …

Stężenie zawiesiny ciał stałych w aktywowanym osadzie po sezonowaniu z syntetycznym ściekiem = ... mg/l

Objętość aktywowanego osad na litr końcowego podłoża = ... ml

Stężenie osad końcowym podłożu = ... mg/l

5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNOŚĆ

Typ używanego respirometru:

Czas (dni)

O2 pobrany (mg) badana substancja

O2 pobrany (mg) ślepa proba

Poprawka pobranego O2 (mg)

(a1-b)

(a2-b)

(a3-b)

BOD na mg badanej substancji

Kolba 1

Kolba 2

Kolba 3

% degradacja

srednia (*8)

Uwaga: podobny arkusz można używać dla substancji odniesienia.

6. ANALIZA WĘGLA (alternatywna)

Analizator węgla:

Kolba

DOC

% DOC usunięte

Średnia

zmierzone

skorygowane

Woda + substancja badana

— —

Osad + substancja badana

b1-c

Osad + substancja badana

b2-c

Osad + substancja badana

b3-c

Ślepa próba kontrolna

— —

— 7. WŁAŚCIWE CHEMICZNE DANE ANALITYCZNE

Pozostałość badanej substancji na koniec badania

% degradacja

ślepa próba z wodą

zaszczepione podłoze

Sa1

Sa2

Sa3

Obliczyć % degradacji odpowiednio dla kolby al i a3

8. UWAGI

Należy dołączyć, gdy dostępna, krzywą BOD w zależności od czasu.

Tekst urzędowy w EUR-Lex. Lexeva pokazuje treść przepisu, nie udziela porad prawnych. Moc prawną ma wyłącznie tekst opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.