Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z dnia 30 maja 2008 r. ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)
Załącznik 3
W mocyUkłady buforowe
A. CLARK i LUBS:
Mieszaniny buforowe według CLARKA i LUBSA
(*10)
Skład
pH
0,2 N HC1 + 0,2 N KC1 przy 20 oC
47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
1,0
32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
1,2
20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
1,4
13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
1,6
8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
1,8
5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
2,0
3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml
2,2
0,1 M kwasny ftalan potasu +0,1 N HC1 przy 20 oC
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
2,2
39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
2,4
32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
2,6
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
2,8
20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
3,0
14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
3,2
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
3,4
5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
3,6
2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
3,8
0,1 M kwaśny ftalan potasu +0,1 N HCl przy 20 oC
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
4,0
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
4,2
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
4,4
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
4,6
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
4,8
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
5,0
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
5,2
35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
5,4
39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
5,6
43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
5,8
45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml
6,0
Mieszaniny buforowe według CLARKA i LUBSA (ciąg dalszy)
0,1 M fosforan monopotasu +0,1 N NaOH przy 20 oC
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 mll
6,0
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
6,2
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 m
6,4
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
6,6
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
6,8
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
7,0
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
7,2
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
7,4
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
7,6
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
7,8
46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml
8,0
0,1 M H3B03 w 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH przy 20 oC
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
7,8
3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
8,0
5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
8,2
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
8,4
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
8,6
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
8,8
21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
9,0
26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
9,2
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
9,4
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
9,6
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
9,8
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml
10,0
B. KOLTHOFF i VLEESCHHOUWER:
Bufory cytrynianowe według KOLTHOFFA i VLEESCHHOUWERA
Sklad
pH
0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HC1 przy 18 oC
(*11)
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml cytrynianu do 100 ml
2,2
43,4 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml
2,4
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml
2,6
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml
2,8
23,6 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml
3,0
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml
3,2
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml
3,4
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml
3,6
0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HCl przy 18 oC
(*11)
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
3,8
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
4,0
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
4,2
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
4,4
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
4,6
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
4,8
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
5,0
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
5,2
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
5,4
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
5,6
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
5,8
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml
6,0
C. SÖRENSEN:
Mieszaniny boranowe według SÓRENSENA
Skład
Sörensen
18 oC
Valbum, pH przy
ml boraksu
ml HCl/NaO H
10 oC
40 oC
70 oC
0,05 M boraksu +0,1 N HCl
5,25
4,75
7,62
7,64
7,55
7,47
5,50
4,50
7,94
7,98
7,86
7,76
5,75
4,25
8,14
8,17
8,06
7,95
6,00
4,00
8,29
8,32
8,19
8,08
6,50
3,50
8,51
8,54
8,40
8,28
7,00
3,00
8,08
8,72
8,56
8,40
7,50
2,50
8,80
8,84
8,67
8,50
8,00
2,00
8,91
8,96
8,77
8,59
8,50
1,50
9,01
9,06
8,86
8,67
9,00
1,00
9,09
9,14
8,94
8,74
9,50
0,50
9,17
9,22
9,01
8,80
10,00
0,00
9,24
9,30
9,08
8,86
0,05 M boraksu +0,1 N NaOH
10,0
0,0
9,24
9,30
9,08
8,86
9,0
1,0
9,36
9,42
9,18
8,94
8,0
2,0
9,50
9,57
9,30
9,02
7,0
3,0
9,68
9,76
9,44
9,12
6,0
4,0
9,97
10,06
9,67
9,28
Mieszaniny fosforanowe według SÖRENSENA
Skład
pH
0,0667 M fosforan monopotasu + 0,0667 M fosforan disodu przy 20 oC
99,2 ml KH2PO4+0,8 ml Na2HPO4
5,0
98,4 ml KH2PO4+1,6 ml Na2HPO4
5,2
97,3 ml KH2PO4+2,7 ml Na2HPO4
5,4
95,5 ml KH2PO4+4,5 ml Na2HPO4
5,6
92,8 ml KH2PO4+7,2 ml Na2HPO4
5,8
88,9 ml KH2PO4+11,1 ml Na2HPO4
6,0
83,0 ml KH2PO4+17,0 ml Na2HPO4
6,2
75,4 ml KH2PO4+24,6 ml Na2HPO4
6,4
65,3 ml KH2PO4+34,7 ml Na2HPO4
6,6
53,4 ml KH2PO4+46,6 ml Na2HPO4
6,8
41,3 ml KH2PO4+58,7 ml Na2HPO4
7,0
29,6 ml KH2PO4+70,4 ml Na2HPO4
7,2
19,7 ml KH2PO4+80,3 ml Na2HPO4
7,4
12,8 ml KH2PO4+87,2 ml Na2HPO4
7,6
7,4 ml KH2PO4+92,6 ml Na2HPO4
7,8
3,7 ml KH2PO4+96,3 ml Na2HPO4
8,0
C.8. TOKSYCZNOŚĆ DŻDŻOWNIC
BADANIE SZTUCZNEJ GLEBY
1. METODA
1.1. WSTĘP
W tym badaniu laboratoryjnym substancja testowa dodawana jest do sztucznej gleby, w której umieszcza się dżdżownice na okres 14 dni. Po zakończeniu tego okresu (i opcjonalnie po siedmiu dniach) badane są skutki śmiertelności dżdżownic wywołane przez substancję testową. Badanie dostarcza metody na względnie krótkoterminowe badanie skutków substancji chemicznej na dżdżownice pobieranej przez skórę i układ pokarmowy.
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKA
LC50: Stężenie substancji testowej ocenione jako powodujące śmierć u 50 % badanych zwierząt w okresie przeprowadzania badania.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Substancja odniesienia używana jest okresowo jako środek pozwalający określić, iż czułość systemu badawczego nie uległa znacznej zmianie.
Analityczny stopień chloroacetamidu zalecany jest jako substancja odniesienia.
1.4. ZASADA BADANIA
Ziemia stanowi zmienną pożywkę, dlatego też do tego badania wykorzystywana jest starannie określona sztuczna gleba. Dorosłe dżdżownice z gatunku Eisenia foetida (zob. uwaga w dodatku) utrzymywane są w ściśle określonej sztucznej glebie poddawanej działaniu różnych stężeń substancji testowej. Zawartość zbiorników rozłożona jest na tacach przez okres 14 dni (i opcjonalnie przez siedmiu dniach) po rozpoczęciu badania oraz zliczane są osobniki pozostałe przy życiu po ekspozycji na działanie każdej wielkości stężenia substancji testowej.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Badanie zaprojektowano w taki sposób, aby było jak najbardziej odtwarzalne w odniesieniu do badanego substrata i organizmu. Śmiertelność w grupach kontrolnych nie może przekraczać 10 % po zakończeniu badania, w przeciwnym razie badanie uważa się za nieważne.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Materiały
1.6.1.1. Substrat testowy
Zdefiniowana sztuczna gleba używana jest jako podstawowy substrat testowy.
a) Podstawowy substrat (procenty w przeliczeniu na suchą masę)
— 10 % torf sfagnowy (o możliwie jak najbardziej zbliżonym pH 5,5–6,0 bez widocznych pozostałości roślinnych i drobnomielony).
— 20 % gliny laolinitowej, najlepiej z ponad 50 % zawartością kaolinitu.
— Około 69 % przemysłowego piasku kwarcowego (przewaga piasku drobnoziarnistego z ponad 50 % zawartością cząsteczek o wielkości 0,05–0,2 mm). W przypadku gdy substancja nie rozrzedza się w wodzie w sposób wystarczający, 10 g badanego substrata należy zachować z danego zbiornika w celu późniejszego zmieszania z substancja testową.
— Dodaje się około 1 % węglanu wapnia (CaCO3), sproszkowanego, chemicznie czystego w celu uzyskania pH do 6,0
±0,5.
b) Substrat testowy
Substrat testowy zawiera substrat podstawowy, substancję testową i dejonizowaną wodę.
Zawartość wody wynosi około 25–42 % suchej masy substrata podstawowego. Zawartość wody w substracie, ustalana jest przez osuszanie próbki do stałej masy przy 105 oC. Kluczowym kryterium jest nawilżanie sztucznej gleby do takiego momentu, aby nie powstały wody stojące. Należy zachować ostrożność podczas mieszania w celu równomiernego rozłożenia substancji testowej i substrata. Sposób wprowadzenia substancji testowej do substrata należy opisać.
c) Substrat kontrolny
Substrat kontrolny zawiera substrat podstawowy i wodę. W przypadku wprowadzenia dodatkowego czynnika, dodatkowy substrat kontrolny powinien zawierać tę samą ilość dodatkowego czynnika.
1.6.1.2. Zbiorniki testowe
Szklane zbiorniki o pojemności około jednego litra (odpowiednio przykryte plastikowymi pokrywkami, naczynia lub folie z tworzywa sztucznego z otworami wentylacyjnymi) wypełnione pewną ilością nawilżonego lub kontrolnego substrata, równowartość 500 g suchej masy substrata.
1.6.2. Warunki badania
Zbiorniki należy przechowywać w klimatyzowanych komorach w temperaturze 20 ± 2 oC w stałym oświetleniu. Natężenie oświetlenia powinno wynosić 400–800 luksów.
Okres badania wynosi 14 dni, ale śmiertelność można fakultatywnie ocenić na siedem dni po rozpoczęciu badania.
1.6.3. Procedura badania
Stężenia substancji testowej
Stężenia substancji testowej wyrażone są jako waga substancji na suchą masę substrata podstawowego (mg/kg).
Test ustalania zakresu stężeń
Wielkość stężeń powodująca śmiertelność 0–100 % można ustalić przez test ustalania zakresu stężeń w celu przekazania informacji o zakresie stężeń wykorzystywanym w ostatecznym badaniu.
Substancję należy zbadać przy następujących wielkościach stężeń: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg substancji/kilogram badanego substrata (sucha masa).
W przypadku przeprowadzenia w pełni badania ostatecznego jedna grupa badana na daną wielkość stężenia i jedna grupa kontrolna niepoddana działaniu substancji, każda zawierająca 10 dżdżownic, powinna być wystarczająca w celu wykonania testu ustalania zakresu stężeń.
Badanie ostateczne
Wyniki testu ustalania zakresu stężeń wykorzystywane są w celu wybrania co najmniej pięciu wielkości stężeń uszeregowanych geometrycznie, obejmujących zakres 0–100 % śmiertelności i różniących się stałym czynnikiem nie przekraczającym 1,8.
Badania wykorzystujące te serie stężeń powinny umożliwić ustalenie wartości LC50 oraz jej granic pewności najdokładniej jak to możliwe.
W badaniu ostatecznym należy użyć co najmniej cztery grupy badane przy danej wielkości stężenia i cztery grupy kontrolne niepoddane działaniu substancji, każda zawierająca 10 dżdżownic. Wyniki takich replikujących grup podawane są jako średnia i odchylenie standardowe.
W przypadku gdy dwa równoległe stężenia o wielkości 1,8, powodują 0 % i 100 % śmiertelności, takie dwie wartości są wystarczające do oznaczenia zakresu, w którym obniża się LC50.
Mieszanina podstawowego substrata testowego i substancji testowej.
Badany substrat, jeżeli możliwe, nie powinien zawierać dodatkowych czynników innych niż woda. Bezpośrednio przed rozpoczęciem badania, zawiesina substancji testowej lub substancja testowa rozrzedzona w dejonizowanej wodzie lub innym rozpuszczalniku jest mieszana z podstawowym substratem testowym, lub równomiernie nad nim rozpylana za pomocą drobnego spryskiwacza chromatograficznego lub podobnego.
Jeżeli substancja testowa nie jest rozpuszczalna w wodzie, może być rozpuszczona w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w możliwie jak najmniejszej ilości (np. heksan, aceton lub chloroform).
Jedynie czynniki łatwo ulatniające się mogą być użyte w celu rozpuszczenia, rozrzedzenia lub zemulgowania substancji testowej. Badany substrat należy wietrzyć przed użyciem. Należy uzupełniać ilość wyparowanej wody. Grupa kontrolna powinna zawierać tę samą ilość każdego dodawanego czynnika.
Jeżeli substancja testowa jest nierozpuszczalna, nierozrzedzalna lub nie emulguje w rozpuszczalnikach organicznych, należy zmieszać 10 g drobnoziarnistego piasku kwarcowego oraz taką ilość substancji testowej, jaka wymagana jest przy 500 g suchej masy sztucznej gleby z 490 g suchej masy badanego substrata.
W odniesieniu do każdej badanej grupy, należy umieścić ilość nawilżonego badanego substrata równą 500 g suchej masy w każdym szklanym zbiorniku wraz z 10 dżdżownicami, które przebywały przez okres 24 godzin w podobnych warunkach tj. w warunkach nawilżonego substrata podstawowego, a następnie zostały szybko umyte, a nadwyżka wody została wchłonięta w bibułę filtracyjną przed użyciem.
Zbiorniki przykrywa się perforowanymi plastikowymi pokrywkami, naczyniami lub folią w celu zapobieżenia wysychaniu substrata i utrzymuje się je w warunkach badania przez okres l4 dni.
Oszacowania należy dokonać 14 dni (opcjonalnie po siedmiu dniach) po rozpoczęciu badania. Substrat rozkładany jest na szklanej płytce lub płytce wykonanej ze stali nierdzewnej. Należy przeprowadzić badanie dżdżownic oraz ustalić liczbę osobników pozostałych przy życiu. Dżdżownice uważa się za martwe, jeżeli nie reagują na delikatne bodźce mechaniczne oddziałujące z przodu organizmu osobnika.
W przypadku gdy badanie przeprowadzane jest po siedmiu dniach, zbiornik ponownie napełniany jest substratem testowym, a osobniki pozostałe przy życiu są przenoszone na powierzchnię z tym samym substratem testowym.
1.6.4. Badane organizmy
Organizmy poddane badaniu powinny być osobnikami dorosłymi Eisenia foetida (zob. uwagi w Dodatku) (w wieku dwóch miesięcy życia z ukształtowanym siodełkiem) o wadze nawilżonego ciała 300–600 mg (metody uprawy, zob. dodatek).
2. DANE
2.1. OBRÓBKA I ANALIZA WYNIKÓW
Stężenia testowej substancji odnotowywane są w odniesieniu do procentowej ilości martwych dżdżownic.
Jeżeli dane są zadowalające, należy ustalić wartość LC50 oraz limity pewności (p = 0,05) wykorzystując standardowe metody (Litchfield i Wilcoxon, 1949, metoda równoważna). LC50 należy podać jako miligram substancji testowej na kilogram badanego substrata (sucha masa).
W przypadkach gdy nachylenie krzywej stężenia jest zbyt strome aby umożliwić obliczenie LC50, wystarczające jest graficzne oszacowanie tej wartości.
W przypadku gdy dwie kolejne wielkości stężenia o wskaźniku w wysokości 1,8 powodują jedynie śmiertelność 0 % i 100 %, te dwie wartości są wystarczające do oznaczenia granicy, przy której obniża się LC50.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
— stwierdzenie, że badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wyżej wymienionymi kryteriami jakości,
— przeprowadzone badanie (badanie zakresu wielkości stężeń i/lub badanie ostateczne),
— dokładny opis warunków badania lub stwierdzenie, że badanie zostało przeprowadzone zgodnie z metodą; wszelkie odstępstwa od procedury metody należy odnotować,
— dokładny opis procedury mieszania substancji testowej z podstawowym substratem testowym,
— informacja o badanych organizmach (gatunki, wiek, średnia oraz rozpiętość wagi, warunki hodowli i utrzymywania, dostawca),
— metoda używana w celu ustalenia LC50,
— wyniki badania łącznie ze wszelkimi wykorzystanymi danymi,
— opis obserwowanych objawów i zmian w zachowaniu badanych organizmów,
— śmiertelność w grupach kontrolnych.
— LC50 lub najwyższa wielkość stężenia testowego nie powodująca śmiertelności oraz najniższa wielkość stężenia powodująca 100 %, śmiertelności na 14 dni (oraz fakultatywnie siedem dni) po rozpoczęciu badania,
— wykreślanie krzywej/stężenia w odniesieniu do powodowanej reakcji,
— wyniki otrzymane po zastosowaniu substancji odniesienia, oraz czy zostały połączone z obecnym badaniem, czy na podstawie wcześniejszej kontroli jakości.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne Badania 201, ostateczna decyzja Rady C(81) 30.
(2) Edwards, C. A. i Lofty, J. R., 1977, Biologia Dżdżownic, Chapman i Hall, Londyn, str. 331.
(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systétmatique, Institut National de la Recherche Agronomique, str. 671.
(4) Litchfield, J. T. i Wilcoxon, F., Uproszczona metoda oceny badań skutków dawkowania. J. Pharm. Exp. Therap., tom 96, 1949, str. 99.
(5) Komisja Wspólnot Europejskich, Rozwój standardowej metody laboratoryjnej odnośnie oceny wpływu toksyczności substancji chemicznych na dżdżownice, Sprawozdanie 8714 EUR EN, 1983.
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in kunstlichem Boden”, in: Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
Dodatek
Hodowla i utrzymywanie dżdżownic przed rozpoczęciem badania
W celu założenia hodowli zwierząt należy umieścić 30–50 dorosłych dżdżownic w zbiorniku hodowlanym zawierającym świeży substrat i usunąć po okresie 14 dni. Zwierzęta te można wykorzystać do hodowli kolejnych grup. Dżdżownice wylężone z kokonów wykorzystuje się do badania po osiągnięciu dojrzałości (zgodnie z zalecanymi warunkami po okresie dwóch do trzech miesięcy).
Warunki utrzymywania i hodowli
Komora klimatyczna
:
temperatura 20 ± 2 oC najlepiej stałym oświetleniem ze (natężenie 400–800 luksów).
Zbiorniki hodowlane
:
odpowiednio płytkie zbiorniki o pojemności 10–20 1.
Substrat
:
Eisenia foetida może być hodowana w różnych ekskrementach zwierzęcych. Zaleca się użycie mieszaniny o składzie 50 % torfu i 50 % krowiego lub końskiego obornika jako pożywki hodowlanej. Pożywka powinna zawierać wartość pH w wysokości około 6–7 (regulowanej węglanem wapnia) oraz niską przewodność elektryczną (mniej niż 6 mmhos lub 0,5 % stężenia soli).
Substrat należy odpowiednio nawilżać, ale niezbyt obficie.
Oprócz wyżej wspomnianej metody, można zastosować inne odpowiednie procedury.
Uwaga: Eisenia foetida występuje w dwóch rasach, które niektórzy systematycy podzielili na dwa gatunki (Bouche, 1972). Gatunki te są podobne pod względem morfologicznym, ale jeden, Eisenia foetida foetida, posiada typowo poprzeczne paskowanie lub przedziały na segmentach, a drugi, Eisenia foetida andrei, takiego paskowania nie posiada, będąc jednocześnie różnobarwnego czerwonawego koloru. Jeżeli jest to możliwe, należy użyć Eisenia foetida andrei. Można użyć inne gatunki, jeżeli dostępna jest metodologia.
C.9. BIODEGRADACJA
BADANIE ZAHN-WELLENS
1. METODA
1.1. WSTĘP
Celem metody jest ocena wpływu całkowitej biodegradacji rozpuszczalnych w wodzie, nielotnych substancji organicznych w przypadku ich ekspozycji na stosunkowo wysokie stężenia drobnoustrojów w badaniu statycznym.
Może mieć miejsce fizyczna i chemiczna adsorpcja zawieszonych substancji stałych, co należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników (zob. 3.2).
Substancje przeznaczone do badania wykorzystuje się w stężeniach odpowiadających wartościom DOC w przedziale 50–400 mg/litr lub wartościom COD w przedziale 100–1 000 mg/litr (DOC = rozwiązany węgiel organiczny; COD = chemiczne zapotrzebowanie tlenu). Te względnie wysokie stężenia posiadają zaletę wiarygodności analitycznej. Związki o właściwościach toksycznych mogą opóźnić lub zahamować proces degradacji.
W niniejszej metodzie pomiar stężenia rozwiązanego węgla organicznego lub chemicznego zapotrzebowania tlenu wykorzystywany jest w celu określenia całkowitej biodegradacji substancji testowej.
Równoczesne użycie szczególnej metody analitycznej może umożliwić ocenę podstawowej biodegradacji substancji (zanik pierwotnej budowy chemicznej).
Metodę stosuje się jedynie w odniesieniu do tych organicznych substancji testowych, które przy wielkości stężenia używanego w badaniu:
— są rozpuszczalne w wodzie w warunkach badania,
— posiadają nieznaczne ciśnienie pary w warunkach badania,
— nie hamują bakterii,
— są absorbowane w badanym systemie jedynie do pewnego stopnia,
— nie są tracone w wyniku wytwarzania piany z roztworu testowego,
Informacje dotyczące względnych części składowych materiału testowego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, w szczególności w tych przypadkach, gdzie wyniki są słabe lub marginalne.
Pożądane są informacje dotyczące wpływu toksyczności substancji na drobnoustroje w celu dokonania interpretacji słabych wyników oraz wyboru właściwych wielkości stężeń.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Wielkość degradacji osiągniętej na końcu badania odnotowywana jest jako „Biodegradacja w badaniu Zahn-Wellens”:
gdzie:
DT
=
( %) biodegradacji w czasie T,
CA
=
wartości DOC (lub COD) w mieszaninie testowej zmierzone trzy godziny po rozpoczęciu badania (mg/l) (DOC = rozwiązany węgiel organiczny, COD = chemiczne zapotrzebowanie tlenu),
CT
=
wartości DOC lub COD w mieszaninie testowej w chwili pobierania próbek (mg/l),
CB
=
wartość DOC lub COD próbki ślepej w chwili pobierania próbek (mg/l),
CBA
=
wartość DOC lub COD próbki ślepej, mierzona trzy godziny po rozpoczęciu testu (mg/l).
Stopień degradacji jest zaokrąglany do najbliższej pełnej wartości procentowej.
Procentową degradację stwierdza się jako procent ubytku DOC (lub COD) z substancji testowej.
Różnica między mierzoną wartością po trzech godzinach i obliczoną, lub najlepiej zmierzoną wartością początkową, może dostarczyć użytecznych informacji dotyczących wydzielania substancji (zob. 3.2, Interpretacja wyników).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
W niektórych przypadkach, w przypadku badania nowych substancji użyteczne mogą okazać się substancje odniesienia; jednakże nie można jeszcze zalecić szczególnych substancji odniesienia.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Aktywny szlam, pożywki mineralne i materiał testowy jako jedyne źródło węgla w roztworach wodnych umieszczane są razem w jednym z czterolitrowych szklanych zbiorników wyposażonych w mieszadło i napowietrzacz. Mieszanina jest mieszana i napowietrzana przy temperaturze 20–25 oC przy rozproszonym oświetleniu lub w ciemnym pomieszczeniu przez okres 28 dni. Proces degradacji jest kontrolowany przez oznaczanie wartości DOC (lub COD) w filtrowanym roztworze codziennie lub w innych właściwych, regularnych odstępach czasu. Stosunek wydzielonego DOC (lub COD) po każdym przedziale czasu do wartości, trzy godziny po rozpoczęciu, wyrażany jest jako procent biodegradacji i służy jako pomiar stopnia degradacji w danym czasie. Wynik nanoszony jest na wykres względem czasu, w celu uzyskania krzywej biodegradacji.
W przypadku użycia szczególnej metody analitycznej można dokonać pomiaru zmian w stężeniu pierwotnej molekuły w wyniku biodegradacji (podstawowa biodegradacja).
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Odtwarzalność niniejszego badania została pozytywnie potwierdzona w próbie pierścieniowej.
Czułość metody jest przeważnie ustalana przez zmienność próbki ślepej i, w mniejszym stopniu, przez precyzyjne oznaczenie rozwiązanego węgla organicznego i poziomu badanego związku w roztworze.
1.6. OPIS PROCEDURY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowania
1.6.1.1. Odczynniki
Woda testowa: woda pitna o zawartości węgla organicznego < 5 mg/litr. Łączne stężenie jonów wapnia i magnezu nie może przekraczać 2,7 mola/litr; w przeciwnym razie wymagane jest odpowiednie rozcieńczenie wodą dejonizowaną lub destylowaną.
Kwas siarkowy, analityczny odczynnik (A.R.):
50 g/l
Roztwór wodorotlenku sodu czysty analitycznie:
40 g/l
Mineralna pożywka: rozpuszczona w jednym litrze dejonizowanej wody:
chlorek amonowy, NH4Cl, czysty analitycznie:
38,5 g,
fosforan monosodowy diwodny, NaH2PO4.2H2O, czysty analitycznie:
33,4 g,
fosforan monopotasowy, KH2PO4, czysty analitycznie:
8,5 g,
fosforan dipotasowy, K2HPO4, czysty analitycznie:
21,75 g.
Mieszanina służy zarówno jako pożywka, a także jako system buforowy.
1.6.1.2. Urządzenia
Szklane zbiorniki o pojemności czterμech litrów (np. zbiorniki cylindryczne).
Mieszadło ze szklanym lub metalowym mieszakiem na odpowiednim trzonku (mieszak powinien obracać się około 5–10 cm ponad dnem zbiornika). W zamian można użyć magnetycznego mieszaka o długości trzonka 7–10 cm.
Szklana probówka o średnicy wewnętrznej 2–4 mm w celu doprowadzenia powietrza. Otwór probówki powinien być umieszczony około 1 cm ponad dnem zbiornika.
Wirówka (około 3 550 g).
Miernik pH.
Miernik rozpuszczonego tlenu.
Papierowe filtry.
Urządzenie do filtracji membrany.
Filtry membranowe, wielkość poru 0,45 μm. Filtry membranowe są odpowiednie w przypadku gdy potwierdzone jest, że nie przepuszczają węgla, ani nie wchłaniają substancji w fazie filtracji.
Sprzęt analityczny do określania składu węgla organicznego i chemicznego zapotrzebowania tlenu.
1.6.1.3. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
Aktywny szlam pochodzący z biologicznej oczyszczalni ścieków jest oczyszczany przez (wielokrotnie) odwirowywanie lub klarowanie wodą testową (powyżej).
Aktywny szlam musi być we właściwym stanie. Taki szlam uzyskać można z właściwie pracującej oczyszczalni ścieków. W celu uzyskania różnorodnych gatunków lub szczepów bakterii można zmieszać inokulat pochodzący z różnych źródeł (np. różnych oczyszczalni ścieków, ekstraktów gleby, wód rzecznych itd.). Mieszaninę należy oczyszczać w sposób opisany powyżej.
W celu dokonania kontroli aktywnych szlamów, zob. „Kontrola funkcjonalna, poniżej”.
1.6.1.4. Przygotowanie roztworów testowych
Do zbiornika używanego w badaniu należy dodać 500 ml wody testowej, 2,5 ml/litr mineralnej pożywki i aktywny szlam w ilości odpowiadającej 0,2–1,0 g/litr suchej masy w ostatecznej mieszaninie. Dodać wystarczającą ilość roztworu podstawowego substancji przeznaczonej do badania, tak aby stężenie DOC w wysokości 50–400 mg/litr dało mieszaninę końcową. Odpowiednie wartości COD wynoszą 100–1 000 mg/litr. Przygotować wodę testową o ogólnej objętości jednego do czterech litrów. Wybór całkowitej ilości wody zależy od liczby próbek, mających być pobrane do określenia DOC lub COD oraz ilości koniecznej do przeprowadzenia procedury analitycznej.
Zazwyczaj ilość dwóch litrów uważana jest za wystarczającą. Zakłada się co najmniej jeden kontrolny zbiornik próbki ślepej w celu przeprowadzania badania równoległego z każdą serią; taki zbiornik zawiera jedynie aktywowany szlam i mineralną pożywkę składającą się z wody testowej o takiej samej ilości całkowitej, jak w zbiornikach używanych do badania.
1.6.2. Przeprowadzenie badania
Naczynia testowe są wytrząsane przy użyciu mieszadeł magnetycznych lub tradycyjnych (śmigłowych) w warunkach rozproszonego oświetlenia bądź w ciemności, w temperaturze 20–25 oC. Napowietrzanie jest dokonywane powietrzem pod ciśnieniem, czyszczonym za pomocą bawełnianego filtra oraz tryskawki, jeżeli konieczne. Nie należy dopuścić do osiadania szlamu, a stężenie tlenu nie może obniżyć się poniżej 2 mg/litr.
Wartość pH należy kontrolować w regularnych odstępach czasu (np. codziennie) i dostosować do poziomu pH 7–8 w razie konieczności.
Straty spowodowane parowaniem są uzupełniane tuż przed każdorazowym pobieraniem próbek wodą dejonizowaną lub destylowaną, w wymaganej ilości. Należy zaznaczyć poziom płynu na zbiorniku przed rozpoczęciem badania. Nowe znaki nanosi się po każdorazowym pobieraniu próbek (bez napowietrzania i mieszania). Pierwsze próbki zawsze pobierane są na trzy godziny po rozpoczęciu badania w celu wykrycia absorpcji materiału testowego przez aktywny szlam.
Eliminacja materiału testowego następuje po określeniu DOC lub COD dokonywanym raz dziennie lub w innych regularnych odstępach czasu. Próbki ze zbiornika testowego oraz z próbką ślepą filtrowane są przez dokładnie oczyszczony filtr papierowy. Pierwsze 5 ml przefiltrowanej substancji testowej jest odrzucane. Szlamy trudne do przefiltrowania mogą być wcześniej usunięte przez 10-minutowe odwirowywanie. Oznaczenia DOC i COD dokonuje się co najmniej dwukrotnie. Badanie przeprowadza się przez okres 28 dni.
Uwaga: Mętne próbki filtrowane są przez filtry membranowe. Filtry membranowe nie mogą uwalniać ani wchłaniać żadnego materiału organicznego.
Funkcjonalna kontrola aktywnego szlamu
Zbiornik zawierający znaną substancję należy prowadzić równolegle z każdą badaną serią w celu kontroli funkcjonalnej wydajności aktywnego szlamu. W tym celu przydatny jest dietylenoglikol.
Przystosowanie
Jeżeli analizy przeprowadzane są w stosunkowo krótkich odstępach czasu (np. raz dziennie), przystosowanie można łatwo rozpoznać po krzywej degradacji (zob. wykres 2). Dlatego też niniejszego badania nie należy rozpoczynać bezpośrednio przed weekendem.
W przypadku gdy dostosowanie wystąpi na końcu okresu badania, badanie możne zostać przedłużone do chwili zakończenia degradacji.
Uwaga: Jeżeli konieczna jest szersza wiedza w zakresie zachowania dostosowanego szlamu, ten sam aktywny szlam należy poddać działaniu tego samego materiału testowego zgodnie z następującą procedurą:
Należy wyłączyć mieszadło oraz napowietrzacz i umożliwić osadzenie się aktywowanego szlamu. Zebrać supernatan, nalać dwie litry wody testowej, mieszać przez 15 minut i umożliwić ponowne osadzenie się szlamu. Po ponownym zebraniu supernatanu należy użyć pozostały szlam w celu powtórzenia badania z tym samym materiałem testowym zgodnie z 1.6.1.4 i 1.6.2 powyżej. Można również wyizolować aktywny szlam przez odwirowanie zamiast osadzenia.
Dostosowany szlam można zmieszać ze świeżym szlamem w celu uzyskania stężenia o zawartości 0,2–1 g suchej masy/litr.
Środki analityczne
Zazwyczaj próbki filtrowane są przez starannie umyty filtr papierowy (do mycia należy użyć wodę dejonizowaną).
Próbki, które wciąż pozostają mętne należy filtrować przez filtry membranowe (0,45 μm).
Stężenie DOC ustala się dwukrotnie na podstawie filtrowanej próbki (pierwsze 5 ml należy odrzucić) za pomocą przyrządu TOC. Jeżeli nie można dokonać analizy filtratu w tym samym dniu, należy przechować go w chłodziarce do następnego dnia. Nie zaleca się dłuższego okresu przechowywania.
Stężenie DOC ustala się w filtratach próbki za pomocą analitycznego określenia COD na podstawie procedury ustalonej w poz. bibliograficznej (2), poniżej.
2. DANE I ANALIZA
Stężenia DOC i/lub COD ustala się co najmniej dwukrotnie w próbkach zgodnie z 1.6.2, powyżej. Degradacja w czasie T obliczana jest zgodnie ze wzorem (z definicjami) podanym zgodnie z 1.2, powyżej.
Stopień degradacji zaokrąglany jest do najbliższej wartości procentowej. Stopień degradacji uzyskany po zakończeniu badania odnotowywany jest jako „Biodegradacja w teście Zan-Wellens”.
Uwaga: W przypadku uzyskania całkowitej degradacji przed zakończeniem okresu badania oraz gdy taki wynik potwierdzony jest drugą analizą przeprowadzoną w dniu następnym, wówczas badanie może zostać zakończone.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
— początkowe stężenie substancji testowej,
— wszelkie inne informacje oraz wyniki badań dotyczące substancji testowej, substancji odniesienia jeżeli zostały użyte, i próbki ślepej,
— stężenie po trzech godzinach,
— krzywa biodegradacji wraz z opisem,
— data i lokalizacja pobrania próbek badanych organizmów, status dostosowania, użyte stężenie itd.,
— naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury badania.
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Ubytek DOC (COD), stopniowo następujący przez okres badania obejmujący dni lub tygodnie, wskazuje, iż substancja testowa ulega biodegradacji.
Jednakże fizyko-chemiczna adsorpcja może w niektórych przypadkach odegrać istotną rolę, a sygnalizowane jest to w przypadku całkowitego lub częściowego ubytku początkowego w ciągu pierwszych trzech godzin, a różnica między grupą kontrolną i badanymi supernatanami pozostaje na niespodziewanie niskim poziomie.
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań jeżeli istnieje potrzeba rozróżnienia między biodegradacją (lub częściową biodegradacją) a adsorpcją.
Można to osiągnąć na wiele sposobów, ale najbardziej przekonujące jest użycie supernatantu lub szlamu jako inokulum w teście podstawowym (najlepiej teście respirometrycznym).
Substancje testowe powodujące wysoki, nieadsorpcyjny ubytek DOC (COD) w niniejszym badaniu należy uważać za substancje wpływające biodegradacyjnie. Częściowy, nieadsorpcyjny ubytek oznacza, iż substancja chemiczna ulega biodegradacji co najmniej w pewnym stopniu. Niski lub zerowy poziom ubytku DOC (COD) może być spowodowany zahamowaniem aktywności drobnoustrojów przez substancję testową, co można również wykryć przez rozpad lub utratę szlamu, dającego mętne supernatany. Badanie należy powtórzyć, wykorzystując niskie stężenie substancji testowej.
Użycie specyficznej dla danego związku metody analitycznej lub substancji testowej znakowanej izotopem węgla 14C zwiększa czułość metody. W przypadku związków znakowanych 14C, odzyskanie 14CO2 potwierdzi, że zaszła biodegradacja.
W przypadku podawania wyników początkowej biodegradacji, jeżeli możliwe, należy wyjaśnić zmianę w budowie chemicznej, która powoduje utratę reakcji macierzystej substancji testowej.
Potwierdzenie metody analitycznej musi być dostarczone wraz z reakcją, która zaszła w próbce ślepej.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne Badania 302 B, decyzja Rady C(81) 30 wersja ostateczna.
(2) Załącznik V C.9 Degradacja: Chemiczne zapotrzebowanie tlenu, dyrektywa Komisji 84/449/EWG (Dz.U. L 251 z 19.9.1984, s. 1).
Dodatek
PRZYKŁAD ANALIZY
Związek organiczny:
4-kwas etoksybenzoesowy
Teoretyczne stężenie substancji testowej:
600 mg/l
Teoretyczne DOC:
390 mg/l
Inokulum
Oczyszczalnia ścieków z
Stężenie:
1 gram suchej masy/litr
Poziom dostosowania:
Niedostosowany
Analiza:
Ustalenie DOC
Ilość próbki:
3 ml
Substancja kontrolna:
Dietylenoglikol
Toksyczność związku chemicznego:
Brak skutków toksyczności poniżej 1 000 mg/l
Użyty test: Test probówkowy fermantacji
Czas
Substancja kontrolna
Substancja testowa
Próba ślepa
DOC (5)
mg/l
DOC (5)
mg/l
DOC netto
mg/l
Degradacja
%
DOC (5)
mg/l
DOC netto
mg/l
Degradacja
%
0
— —
300,0
— —
390,0
— 3 godziny
4,0
298,0
294,0
2
371,6
367,6
6
1 dzień
6,1
288,3
282,2
6
373,3
367,2
6
2 dni
5,0
281,2
276,2
8
360,0
355,0
9
5 dni
6,3
270,5
264,2
12
193,8
187,5
52
6 dni
7,4
253,3
245,9
18
143,9
136,5
65
7 dni
11,3
212,5
201,2
33
104,5
93,2
76
8 dni
7,8
142,5
134,7
55
58,9
51,1
87
9 dni
7,0
35,0
28,0
91
18,1
11,1
97
10 dni
18,0
37,0
19,0
94
20,0
2,0
99
Wykres 1
Przykłady krzywych biodegradacji
Degradacja (%)
Substancje:
Pepton
Amina
Glikoester
Czas (dni)
Wykres 2
Przykłady dostosowania szlamu
Degradacja (%)
Substancja:
Polialkohol
dostosowany
niedostosowany
Faza dostosowania
Faza degradacji
Punkt końcowy
Czas (dni)
C.10. BIODEGRADACJA
BADANIA SYMULACJI AKTYWOWANYCH SZLAMÓW
1. METODA
1.1. WSTĘP
1.1.1. Uwagi ogólne
Metodę stosuje się jedynie w odniesieniu do tych substancji organicznych, które przy wielkości stężenia używanego w badaniu:
— są rozpuszczalne w wodzie w stopniu koniecznym do przygotowania roztworów testowych,
— posiadają nieznaczne ciśnienie pary w warunkach badania,
— nie hamują bakterii.
Informacje dotyczące względnych proporcji głównych składników materiału testowego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, w szczególności w tych przypadkach gdzie wyniki są na niskim poziomie lub marginalne.
Pożądane są informacje dotyczące wpływu toksyczności substancji na drobnoustroje w celu dokonania interpretacji wyników o niskim poziomie oraz wyboru właściwych wielkości stężeń.
1.1.2. Ustalenie całkowitej biodegradacji (analizy DOC/COD)
Celem metody jest ustalenie całkowitej biodegradacji przez pomiar stopnia ubytku substancji i jakichkolwiek metabolitów w modelu zakładu oczyszczającego ścieki przez aktywowane szlamy przy stężeniu odpowiadającym > 12 mg DOC/litr (lub około 40 mg COD/litr); 20 mg DOC/litr wydaje się być optymalne. (DOC = rozwiązany węgiel organiczny; COD = chemiczne zapotrzebowanie tlenu).
Należy ustalić skład węgla organicznego (lub chemiczne zapotrzebowanie tlenu) materiału testowego.
1.1.3. Ustalenie początkowej biodegradacji (analizy szczególne)
Celem metody jest ustalenie początkowej biodegradacji substancji w modelu zakładu oczyszczającego ścieki przez aktywowane szlamy, przy stężeniu w wysokości około 20 mg/litr, wykorzystując szczególną metodę analityczną (można wykorzystać niższe lub wyższe stężenie, jeżeli zezwala na to metoda analityczna i stężenie toksyczności). Powyższe pozwala na oszacowanie początkowej biodegradacji substancji (zanik macierzystej budowy chemicznej).
Celem niniejszej metody nie jest ustalenie mineralizacji substancji testowej.
Wymagana jest dostępność do odpowiedniej metody analitycznej w celu ustalenia substancji testowej.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
1.2.1. Analizy DOC/COD
Stopień ubytku substancji podawany jest przez:
[1 (a)]
gdzie:
DR
=
procentowy stopień ubytku substancji DOC (lub COD) w danym średnim czasie retencji odnoszącym się do materiału testowego,
T
=
stężenie materiału testowego w cieczy wpływającej do zbiornika w mg DOC/litr (lub mg COD/litr),
E
=
stężenie DOC (lub COD) w cieczy wypływającej ze zbiornika w jednostce testowej w mg DOC/litr (lub mg COD/litr),
E0
=
stężenie DOC (lub COD) w cieczy wypływającej ze zbiornika w próbce ślepej w mg DOC/litr (lub mg COD/litr).
Degradację stwierdza się jako procent ubytku DOC (lub COD) w danym czasie retencji w odniesieniu do materiału testowego.
1.2.2. Analizy szczególne
Procentowe wydzielenie testowej substancji z fazy wodnej (Rw) w danym średnim czasie retencji wyrażone jest przez:
[1 (b)]
gdzie:
Cl
=
stężenie substancji w cieczy wpływającej do zbiornika w jednostce testowej (mg substancji/litr, ustalone na podstawie analiz szczególnych),
C0
=
stężenie substancji w cieczy wypływającej ze zbiornika w jednostce testowej (mg substancji/litr, ustalone na podstawie analiz szczególnych).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
W niektórych przypadkach podczas badania nowych substancji użyteczne mogą okazać się substancje odniesienia; jednakże nie można jeszcze zalecić szczególnych substancji odniesienia.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
W celu określenia całkowitej biodegradowalności należy równolegle uruchomić dwie pilotowe jednostki szlamu aktywowanego (test potwierdzający OECD lub jednostki porowatego wkładu). Substancja testowa dodawana jest do cieczy wpływającej do zbiornika (ściek syntetyczny lub wewnętrzny) jednej z jednostek, podczas gdy druga jednostka otrzymuje czysty ściek. W celu określenia podstawowej biodegradowalności, z analizą szczególną cieczy wpływającej do i wypływającej ze zbiornika, należy użyć tylko jednej jednostki.
Dokonywany jest pomiar stężeń DOC (lub COD) w cieczach wypływających ze zbiornika lub stężenia substancji ustalane są w oparciu o analizy szczególne.
Ze względu na materiał testowy nie dokonuje się pomiaru DOC, ale jedynie oznacza jego wartość.
W przypadku przeprowadzania pomiarów DOC (lub COD) zakłada się, iż różnica średnich stężeń między cieczami testowymi wypływającymi ze zbiornika a kontrolnymi cieczami wypływającymi ze zbiornika spowodowana jest brakiem degradacji materiału testowego.
W przypadku przeprowadzania szczególnych analiz można dokonać pomiaru stężenia molekuły macierzystej (biodegradacja podstawowa).
Jednostki mogą być eksploatowane zgodnie z „trybem jednostek połączonych”, zgodnie z metodą transinokulacji.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Początkowe stężenie substancji zależy od rodzaju przeprowadzonej analizy i jej ograniczeń.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowanie
1.6.1.1. Urządzenia
Wymagane są dwie jednostki tego samego rodzaju, z wyjątkiem przypadków gdy przeprowadzane są analizy szczególne. Można użyć dwa rodzaje jednostek:
Test potwierdzający OECD
Sprzęt (dodatek 11) składa się ze zbiornika (A) do magazynowania ścieków syntetycznych, pompy dozującej (B), zbiornika napowietrzającego (C), osadnika (D), powietrznego podnośnika cieczy (E) do zwracania do obiegu aktywnego szlamu i naczynia (F) do zbierania poddawanych procesowi cieczy wypływających ze zbiornika.
Zbiorniki (A) i (F) muszą być wykonane ze szkła lub odpowiedniego tworzywa sztucznego o objętości co najmniej 24 litrów. Pompa (B) musi zapewniać stały przepływ syntetycznego ścieku do napowietrzanego zbiornika; użyć można każdy odpowiedni system, po warunkiem że zapewniony zostanie przepływ i stężenie. W trakcie zwyczajnej eksploatacji wysokość osadnika (D) ustalona jest w taki sposób, aby jego objętość zawarta w napowietrzanym zbiorniku wynosiła trzy litry zmieszanego płynu. Spiekana kostka napowietrzania (G) jest zawieszana w zbiorniku (C) na wierzchołku stożka. Ilość powietrza wdmuchiwanego przez napowietrzacz może być mierzona przy użyciu przepływomierza.
Powietrzny podnośnik cieczy (E) jest umieszczony w taki sposób, że aktywny szlam z osadnika jest nieustannie i regularnie zwracany do zbiornika napowietrzającego (C).
„Porowaty wkład”
Porowaty wkład wykonany jest z płyt porowatego polietylenu (o grubości 2 mm, maksymalny rozmiar pory 95 μm), które tworzą walce o średnicy 14 cm o stożkowej podstawie 45o (rysunki 1 i 2 dodatku 2). Porowaty wkład jest zawarty w nieprzepuszczalnym zbiorniku wykonanym z odpowiedniego plastiku o średnicy wylotu 15 cm oraz wysokości 17,2 cm części walcowatej, co określa objętość (3 litrów) w naczyniu. Na szczycie wewnętrznego zbiornika znajduje się sztywna wspierająca opaska wykonana z odpowiedniego tworzywa sztucznego w taki sposób, aby powstała przestrzeń cieczy wypływającej ze zbiornika, wynosząca 0,5 cm między zbiornikiem wewnętrznym a zewnętrznym.
Porowaty wkład można zamocować u podstawy termostatycznie kontrolowanej kąpieli wodnej. Powietrze dostarczane jest do podstawy wewnętrznego zbiornika, na której umieszczone są odpowiednie dyfuzory.
Zbiorniki (A) i (E) muszą być wykonane ze szkła lub odpowiedniego tworzywa sztucznego i muszą posiadać objętość 24 litrów. Pompa (B) musi zapewniać stały przepływ syntetycznego ścieku do napowietrzanego zbiornika; użyć można każdy odpowiedni system, po warunkiem że zapewniony zostanie przepływ i stężenie.
Wymagane są zapasowe wewnętrzne porowate wkłady w celu zastąpienia jakichkolwiek naczyń, które mogą zostać zablokowane w trakcie używania; zablokowane naczynia należy oczyścić przez 24-godzinne zanurzenie w roztworze podchlorynu po gruntownym umyciu bieżącą wodą.
1.6.1.2. Filtracja
Urządzenia do filtracji membranowej i filtry membranowe o rozmiarach porów 0,45 μm. Filtry membranowe są odpowiednie, jeżeli zostanie potwierdzone, że nie uwalniają węgla ani nie absorbują substancji w fazie filtracji.
1.6.1.3. Ścieki
Każda odpowiednia syntetyczna pożywka lub wewnętrzne ścieki mogą zostać użyte do badania.
Przykład syntetycznej pożywki
Rozpuszczenie w każdym litrze wody bieżącej:
Pepton:
160 mg,
Ekstrakt z mięsa:
110 mg,
Karbamid:
30 mg,
NaCl:
7 mg,
CaCl2.2H20:
4 mg,
MgSO4.7H20:
2 mg,
K2HP04:
28 mg.
Ścieki wewnętrzne
Świeże ścieki należy zebrać każdego dnia z przepływowego odstojnika podstawowego w oczyszczalni ścieków, oczyszczającej w przeważającej mierze ścieki wewnętrzne.
1.6.1.4. Roztwór podstawowy materiału testowego
Należy przygotować roztwór materiału testowego, np. 1 %, celem dodania do jednostki testowej. Należy ustalić stężenie materiału w celu poznania właściwej objętości materiału mającego być dodanym do ścieków lub bezpośrednio do jednostki przez drugą pompę dla uzyskania wymaganego stężenia.
1.6.1.5. Inokulum
Uwagi: W przypadku wykorzystania wewnętrznych ścieków bezcelowe byłoby użycie inokulum o niskim stężeniu bakteryjnym, ale wykorzystać można aktywowany szlam.
Zastosować można odmianę inokulum.
Podaje się trzy przykłady odpowiedniego inokulum:
a) Inokulum pochodzące z cieczy powtórnie opuszczającej zbiornik
Inokulum należy uzyskać z wtórnej cieczy wypływającej ze zbiornika o dobrej jakości zebranej z oczyszczalni ścieków oczyszczającej przeważnie ścieki wewnętrzne. Ciecze wypływające ze zbiornika należy przetrzymywać w warunkach tlenowych w okresie między zebraniem, a zastosowaniem. W celu przygotowania inokulum próbka jest filtrowana przez gruboziarnisty filtr, a pierwsze 200 ml filtratu należy odrzucić. Filtrat należy przechowywać w warunkach tlenowych aż do chwili jego użycia. Inokulum należy użyć w dniu jej zebrania. Do szczepienia należy użyć co najmniej 3 ml inokulum.
b) Inokulum łączne
Inokulum z wtórnej cieczy wypływającej ze zbiornika:
zob. opis powyżej.
Inokulum z gleby:
100 g gleby ogrodowej (żyznej, niesterylnej) zawieszone jest w 1 000 ml bezchlorowej wody pitnej. (Gleby o znacznej frakcji iłowej, piasek lub próchnica są nieodpowiednie). Po wymieszaniu zawiesina osiada przez okres 30 minut. Supernatan filtrowany jest przez gruboziarnistą bibułę filtracyjną, pierwsze 200 ml należy odrzucić. Należy rozpocząć natychmiastowe napowietrzanie filtratu aż do chwili jego użycia. Inokulum należy użyć w dniu zebrania.
Inokulum z wody powierzchniowej:
Następne częściowe inokulum uzyskiwane jest z mezosaprobicznej wody powierzchniowej. Próbka filtrowana jest przez gruboziarnisty papier, pierwsze 200 ml należy odrzucić. Filtrat należy przechowywać w warunkach tlenowych aż do chwili jego użycia. Inokulum należy użyć w dniu zebrania.
Równe wielkości trzech częściowych próbek inokulum są łączone i dokładnie mieszane, ostateczne inokulum uzyskiwane jest z powstałej mieszaniny. Do inokulacji należy użyć co najmniej 3 ml inokulum.
c) Inokulum z aktywnego szlamu
Jako inolukum można użyć pewnej ilości (nie więcej niż 3 litry) aktywowanego szlamu (zawieszona sucha masa do 2,5 g/litr) pobranego ze zbiornika napowietrzającego w oczyszczalni ścieków, w przeważającej mierze oczyszczającej ścieki wewnętrzne.
1.6.2. Procedura
Badanie przeprowadzane jest w temperaturze pokojowej; temperaturę należy utrzymywać w przedziale 18–25 oC.
Odpowiednio do potrzeb, badanie można przeprowadzić w niższej temperaturze (do 10 oC); w przypadku degradacji substancji dalsze badanie nie jest konieczne. Jednakże w przypadku gdy substancja nie ulegnie degradacji, badanie należy przeprowadzić przy stałej temperaturze w przedziale 18–25 oC.
1.6.2.1. Okres eliminacji: Tworzenie szlamu/stabilizacja jednostek
Okres wzrostu/stabilizacji szlamu jest okresem, w którym stężenie zawieszonej suchej masy aktywnego szlamu oraz wydajność jednostek rozwija się do stanu stałego w zastosowanych warunkach działalności,
Okres eliminacji to okres, który trwa od chwili pierwszego dodania substancji testowej do czasu, gdy jej ubytek osiągnie plateau (względnie stałą wartość). Okres nie może przekroczyć sześciu miesięcy.
Okres analizy wynosi trzy tygodnie od chwili, gdy ubytek substancji testowej osiągnie względnie stałą i zazwyczaj wysoką wartość. Dla tych substancji, które nie wykazują degradacji lub wykazują znikomą degradację w pierwszych sześciu tygodniach, okres analizy przyjmuje się jako kolejne trzy tygodnie.
Początkowo należy napełnić jednostkę (jednostki) inokulum wymaganym do przeprowadzenia jednego badania i zmieszanym z cieczą wpływającą do zbiornika.
Następnie należy zainstalować napowietrzacz (i powietrzny podnośnik cieczy (E) w przypadku jednostek testu potwierdzającego OECD) oraz jednostkę dozującą (B).
Ciecz wpływająca do zbiornika bez substancji testowej musi przechodzić przez napowietrzane naczynie (C) w tempie jednego litra na godzinę albo w tempie półtorej litra na godzinę; pozwala to uzyskać średni czas retencji wynoszący trzy lub sześć godzin.
Tempo napowietrzania należy regulować w taki sposób, aby zawartość zbiornika (C) utrzymywana była stale w zawieszeniu, podczas gdy zawartość rozpuszczonego tlenu wynosi co najmniej 2 mg/litr.
Wytwarzanie piany należy powstrzymać właściwymi środkami. Nie wolno używać środków przeciwpieniących, które hamują działanie szlamu aktywowanego.
Szlam nagromadzony wokół wylotu zbiornika napowietrzającego (C) (i, w przypadku jednostek testu potwierdzającego OECD, u podstawy osadnika (D) oraz w obiegu) musi zostać ponownie dodany do zmieszanego płynu co najmniej raz dziennie przez zeszczotkowanie lub w inny właściwy sposób.
Kiedy szlamu nie udaje się oddzielić, jego gęstość można zwiększyć przez dodanie porcji 2 ml 5 % roztworu chlorku żelaza, powtarzane w razie potrzeby.
Ciecz wypływająca ze zbiornika zbierana jest w zbiorniku (E lub F) przez 20–24 godzin, a próbka pobierana jest po całkowitym wymieszaniu. Zbiornik (E lub F) należy dokładnie oczyścić.
W celu monitorowania i kontroli wydajności procesu dokonuje się pomiaru chemicznego zapotrzebowania tlenu (COD) lub rozwiązanego węgla organicznego (DOC), filtratu nagromadzonej cieczy wypływającej ze zbiornika co najmniej dwa razy w tygodniu, a także przefiltrowanej cieczy wpływającej do zbiornika (używając membrany o wielkości poru 0,45 μm, pierwsze 20 ml (około) filtratu należy odrzucić).
Obniżenie wartości COD lub DOC powinno się ustabilizować w chwili uzyskania w miarę regularnej dziennej wartości degradacji.
Zawartość suchej masy aktywowanego szlamu w zbiorniku napowietrzającym powinna być określana dwa razy w tygodniu. Jednostki mogą działać na jeden lub dwa sposoby: należy ustalić zawartość suchej masy w aktywnym szlamie dwa razy w tygodniu i – jeżeli niniejsza zawartość wyniesie więcej niż 2,5 g/litr – nadwyżka aktywnego szlamu musi zostać odrzucona albo 500 ml zmieszanego płynu usuwana jest z każdego naczynia raz dziennie w celu otrzymania średniego czasu retencji szlamu wynoszącego sześć dni.
W przypadku gdy parametry pomiarowe i szacowane (wydajność procesu (odnośnie do usuwania COD lub DOC), stężenie szlamu, oddzielanie się szlamu, mętność cieczy wypływających ze zbiorników itd.) dwóch jednostek są dostatecznie stabilne, substancję testową można wprowadzić do cieczy wpływającej do jednej z jednostek, zgodnie z 1.6.2.2.
Alternatywnie, substancję testową można dodać na początku okresu wzrostowego szlamu (1.6.2.1), w szczególności gdy szlam dodawany jest jako inokulum.
1.6.2.2. Procedura badawcza
Należy utrzymywać warunki działania w okresie eliminacji oraz należy dodawać odpowiedni roztwór podstawowy (około 1 %) materiału testowego do cieczy wpływającej do jednostki testowej w celu otrzymania pożądanego stężenia materiału testowego (w przybliżeniu 10–20 mg DOC/litr lub 40 mg COD/litr) w ścieku. Powyższe można otrzymać przez codzienne wmieszanie roztworu podstawowego do ścieków lub przez oddzielny system pompowania. Właściwe stężenie można otrzymać stopniowo. W przypadku braku wystąpienia skutków oddziaływania toksyczności substancji testowej na aktywowany szlam można również przeprowadzić badanie wyższych stężeń.
Do jednostki z próbką ślepą wprowadza się jedynie ciecz wpływającą do zbiornika bez dodanych substancji, pobierane są odpowiednie wielkości cieczy wypływających ze zbiorników do analizy i filtrowane przez filtry membranowe (0,45 μm), odrzucając (około) 20 ml pierwszego filtratu.
Przefiltrowane próbki muszą zostać przeanalizowane w tym samym dniu, w przeciwnym razie muszą być przechowane odpowiednią metodą, na przykład przez użycie 0,05 ml 1 % roztworu chlorku rtęciowego (HgCl2) dla każdego 10 ml filtratu lub przez przechowanie ich w temperaturze 2–4 oC przez okres nie dłuższy niż 24 godziny lub poniżej - 18 oC przez dłuższe okresy czasu.
Okres eliminacji, z dodatkiem substancji testowej, nie powinien przekraczać sześciu tygodni, a okres analizy nie powinien być krótszy niż trzy tygodnie, tj. około 14–20 oznaczeń powinno zostać dokonane w celu obliczenia wyników końcowych.
Tryb jednostek połączonych
Połączenie jednostek można osiągnąć przez wewnętrzną wymianę 1,5 litra zmieszanego płynu (włączając szlam) z napowietrzanego zbiornika aktywnego szlamu między dwiema jednostkami raz dziennie. W przypadku silnie absorbującego materiału testowego jedynie 1,5 litra supernatanu pobierane jest z osadnika i wlewane do zbiornika z aktywowanym szlamem w drugiej jednostce.
1.6.2.3. Analiza
Przeprowadzić można dwa rodzaje analizy w celu obserwacji zachowania substancji:
DOC i COD
Analizę stężenia DOC przeprowadza się dwukrotnie za pomocą analizatora węglowego i/lub wartości COD zgodnie z odniesieniem (2).
Szczególne analizy
Stężenia substancji testowej ustala się za pomocą odpowiedniej metody analitycznej. Jeżeli to możliwe, należy dokonać szczególnego ustalenia absorpcji substancji przez szlam.
2. DANE I OSZACOWANIE
2.1. TRYB JEDNOSTEK POŁĄCZONYCH
W przypadku wykorzystania „trybu jednostek połączonych” dzienny stopień ubytku substancji, DR, oblicza się zgodnie z 1.2.1.
Te dzienne stopnie usunięcia DR są korygowane względem DRc dla transferu materiału spowodowanego procedurą transinokulacji zgodnie z równaniem [2] dla trzygodzinnego średniego czasu retencji lub równaniem [3] dla czasu sześciogodzinnego.
[2]
[3]
Obliczana jest średnia serii wartości DRc, a ponadto zgodnie z równaniem [4] obliczane jest odchylenie standardowe
[4]
gdzie:
SDRc
=
odchylenie standardowe serii wartości DRc,
c
=
średnia wartości DRc,
n
=
liczba okrążeń
Oddzielne wartości serii DRc są eliminowane zgodnie z odpowiednią procedurą statystyczną, np. Nalimova (6), przy 95 % stopniu prawdopodobieństwa i średnia wartość oraz odchylenie standardowe wartości DRc (wolnej od wartości oddzielnych) są obliczane ponownie.
Następnie końcowe wyniki obliczane są za pomocą równania [5], jako:
[5]
gdzie:
tn-1; α
=
wartość tablicowa t dla n wartości par E i E0 i pewnością statystyczną P (P = 1-α), gdy wartość P = 95 % (1).
Wynik podany jest jako średnia z granicami tolerancji o poziomie prawdopodobieństwa 95 %, odpowiednie odchylenie standardowe oraz liczba danych z zestawu wartości DRc wolnych od wartości oddzielnych oraz liczba wyników odbiegających, np.
DRc
=
98,6±2,3 % ubytku DOC,
s
=
4,65 % ubytku DOC,
n
=
18,
x
=
liczba wyników odbiegających.
2.2. TRYB JEDNOSTEK ODDZIELNYCH
Wydajność jednostek testowych można sprawdzić w następujący sposób:
Dzienna wartość usunięć może zostać graficznie zapisana w celu wykazania wszelkich tendencji, np. tendencji do aklimatyzacji.
2.2.1. Użycie ustaleń wartości COD/DOC
Dzienna wartość stopnia usunięcia DR jest obliczana zgodnie z 1.2.1.
Obliczana jest średnia serii wartości DR; ponadto jej odchylenie standardowe oblicza się zgodnie z:
[6]
gdzie:
SDR
=
odchylenie standardowe serii wartości DRi,
=
średnia wartości DRi,
n
=
liczba okrążeń.
Oddzielne wartości serii DRc są eliminowane zgodnie z odpowiednią procedurą statystyczną, np. Nalimova (6), przy 95 % stopniu prawdopodobieństwa i średnia wartość oraz odchylenie standardowe wartości DRc (wolnej od wartości oddzielnych) są obliczane ponownie.
Końcowe wyniki obliczane są za pomocą równania [7] jako:
[7]
gdzie:
tn-1; α
=
wartość tablicowa t dla n wartości par E i E0 i pewnością statystyczną P (P = 1-α), gdy wartość P = 95 % (1).
Wynik podany jest jako średnia z granicami tolerancji o poziomie prawdopodobieństwa 95 %, odpowiednie odchylenie standardowe oraz liczba danych z zestawu wartości DRc wolnych od wartości oddzielnych oraz liczba wyników odbiegających, np.
DR
=
(98,6 ± 2,3) % ubytku DOC,
s
=
4,65 % ubytku DOC,
n
=
18,
x
=
liczba wyników odbiegających.
2.2.2. Wykorzystanie szczególnych analiz
Procent wydalenia substancji testowej z fazy wodnej (Rw) obliczany jest zgodnie z 1.2.2.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
— formularz podany w dodatku 3, zawierający warunki działań badawczych,
— rodzaj wybranych urządzeń (test potwierdzający OECD lub porowaty wkład),
— rodzaj wybranego trybu działania: tryb jednostek połączonych lub oddzielnych,
— rodzaj ścieku: syntetyczny lub wewnętrzny – w przypadku ścieków wewnętrznych, data i lokalizacja próbki,
— rodzaj inokulum, data i lokalizacja próbki,
— deklaracja wraz z opisem metody analitycznej w przypadku przeprowadzenia analiz szczególnych,
— wykres ubytku COD lub DOC względem czasu, włączając okres eliminacji i okres analizy,
— analityczna regeneracja substancji testowej jako COD wartości DOC w roztworze podstawowym,
— w przypadku przeprowadzenia szczególnych analiz, wykres procentowego ubytku substancji testowej z fazy wodnej względem czasu (okres eliminacji i okres analizy),
— średnia wartość ubytku DOC lub COD substancji testowej i odchylenie standardowe obliczane na podstawie wyników okresu analitycznego, tj. w przypadku gdy zachodzi stałe usuwanie materiału testowego lub okres równomiernego działania,
— wykres stężenia aktywowanego szlamu względem czasu,
— wszelkie uwagi dotyczące aktywnego szlamu (ilość odrzuconej nadwyżki szlamu, obecność pęcznienia, FeCl3 itd.),
— stężenie substancji używanej w badaniu,
— wszelkie wyniki analiz przeprowadzonych na szlamie,
— wszelkie informacje oraz wyniki badania dotyczące substancji testowej i substancji odniesienia, jeżeli została użyta,
— naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury.
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Niska wartość ubytku substancji testowej z fazy wodnej może być spowodowana zahamowaniem aktywności drobnoustrojów przez substancję testową. Powyższe można również wykazać na podstawie rozpadu i utraty szlamu, dającego mętny supernatant, i przez spadek wydajności usuwania COD (lub DOC) jednostki pilotowej.
W niektórych przypadkach istotną rolę może odegrać absorpcja fizyko-chemiczna. Różnice między biologicznym działaniem na molekułę a adsorpcją fizyko-chemiczną można ujawnić w oparciu o przeprowadzone analizy szlamu po odpowiedniej desorpcji.
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań, jeżeli istnieje potrzeba rozróżnienia między biodegradacją (lub częściową biodegradacją) a adsorpcją.
Można to osiągnąć na wiele sposobów, ale najbardziej przekonujące jest użycie supernatantu lub szlamu jako inokulum w teście podstawowym (najlepiej teście respirometrycznym)
Jeżeli zaobserwowana jest wysoka wartość DOC lub COD, spowodowane jest to biodegradacją, podczas gdy przy niskich wartościach ubytku substancji biodegradacji nie można odróżnić od wydalania substancji. Na przykład jeżeli związek rozpuszczalny wykazuje wysoką stałą adsorpcję w wysokości 98 % i wskaźnik nadwyżki straty szlamu wynosi 10 % na dzień, możliwe jest wydzielenie do 40 %; przy wskaźniku nadwyżki straty szlamu w wysokości 30 % wydzielenie z powodu adsorpcji i usunięci nadwyżki szlamu może wynieść do 65 % (4).
W przypadku wykorzystania analiz szczególnych należy zwrócić uwagę na powiązanie między strukturą substancji a zastosowaną analizą szczególną. W tym przypadku obserwowane zjawisko nie można interpretować jako mineralizację substancji.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne Badania 201, decyzja Rady C(81) 30 wersja ostateczna.
(2) Załącznik V C.9 Degradacja: Chemiczne zapotrzebowanie tlenu, dyrektywa Komisji 84/449/EWG (Dz.U. L 251 z 19.9.1984, s. 1).
(3) Painter, H. A., King, E. F., WRC Metoda porowatego wkładu dla oznaczenia biodegradacji, Raport Techniczny TR 70, czerwiec 1978, Wodny Ośrodek Badawczy, Zjednoczone Królestwo.
(4) Wierich, P., Gerike, P., Eliminacja związków rozpuszczalnych, opornych i adsorbujących w oczyszczalniach ścieków działających na zasadzie szlamów aktywowanych, Ekotoksykologia i Bezpieczeństwo Środowiskowe, tom 5, nr 2, czerwiec 1981, str. 161–171;
(5) Dyrektywy Rady 82/242/EWG i 82/243/EWG,
Dziennik Urzędowy Wspólnot Europejskich L 109 z 22.4.1982 (Dz.U. L 109 z 22.4.1982, s. 1), zmieniające dyrektywy Rady 73/404/EWG i 73/405/EWG w sprawie biodegradacji detergentów (Dz.U. L 347 z 17.12.1973, s. 51).
(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreißertests, insbesondere bei Ringversuchen zur Uberpriifung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschriftfür Analytische Chemie, 303 (1980), str. 406–408.
Dodatek 1
Rysunek 1
A = naczynie zbiorcze;
B = urządzenie dozujące;
C = komora napowietrzania (3 l pojemności);
D = osadnik;
E = powietrzny podnośnik cieczy;
F = kolektor;
G = napowietrzacz;
H = przepływomierz (nieobowiązkowo).
powietrze
powietrze
Klucz:
Rysunek 2
twarde PVC
Materiał:
szkło lub wodoodporne
tworzywo sztuczne
(twarde PVC)
Poziom cieczy
twarde PVC
3 litry
Dodatek 2
Rysunek 1
Sprzęt do określania stopnia biodegradacji
air
Klucz:
A = naczynie zbiorcze;
B = pompa dozująca;
C = porowaty zbiornik napowietrzający;
D = nieprzepuszczalny zbiornik zewnętrzny;
E= zbiornik cieczy wypływających ze zbiorników;
F = napowietrzający aparat dyfuzyjny;
G = fluorymetr gęstości; (nieobowiązkowo).
Rysunek 2
Szczegółowy opis trzylitrowego porowatego naczynia napowietrzającego
średnica wewnętrzna naczynia porowatego
Obręcz
Uszczelka
Nieskalowane
wewnętrzna strona stożka
zewnętrzna strona stożka
średnica wewnętrzna naczynia zewnętrznego
Dodatek 3
Warunki działalności w badaniu symulacji aktywnego szlamu
Kontrola w każdej grupie
Urzqdzenia
Test potwierdzający OECD
Naczynie porowate
Tryb działania
Pojedyncza jednostka
Połączone jednostki
Jednostki oddzielne
Transinokulacja
Brak
Aktywowany szlam
Supernatan
Średni czas retencji
Trzy godziny
Sześć godzin
Pożywka podstawowa
Ścieki wewnętrzne
Ścieki syntetyczne
Inokulum
Wtórne ciecze wypływające ze zbiornika
Kompozyt
Aktywny szlam
Dodawanie materiału testowego
Od rozpoczęcia badania
Stopniowy wzrost po
uformowaniu się szlamu
Analiza
Szczególna
COD
DOC
C.11. BIODEGRADACJA
BADANIE HAMOWANIA ODDYCHANIA AKTYWOWANYCH SZLAMÓW
1. METODA
1.1. WSTĘP
Opisana metoda ocenia skutki wpływu substancji testowej na drobnoustroje, przez dokonywanie pomiaru stopnia oddychania w określonych warunkach w obecności różnych stężeń substancji testowej.
Celem tej metody jest dostarczenie bardzo szybkiej metody badań, za pomocą której można zidentyfikować związki, które mogą mieć niekorzystny wpływ na florę bakterii aerobowych oczyszczalni, oraz wskazać odpowiednie, nieinhibujące stężenia substancji testowych, które mają być użyte w testach biodegradowalności.
Badanie ustalania wielkości stężeń może poprzedzać badanie ostateczne. Dostarcza ono informacji dotyczących zakresu wielkości stężeń mających być zastosowanymi w badaniu głównym.
Do projektu badania należy włączyć dwie grupy kontrolne bez substancji testowej, jedną w chwili rozpoczęcia badania i drugą po zakończeniu serii badań. Należy skontrolować każdą partię aktywowanego szlamu, używając substancji odniesienia.
Niniejsza metoda łatwo stosuje się do substancji, które ze względu na ich rozpuszczalność w wodzie i niską lotność mogą pozostać w wodzie.
W odniesieniu do substancji o ograniczonej rozpuszczalności w badanym środku ustalenie EC50 może okazać się niemożliwe
Wyniki oparte na wchłanianiu tlenu mogą doprowadzić do błędnych wniosków w przypadku, gdy substancja testowa ma skłonność do rozszczepiania fosforylacji oksydacyjnej.
Przydatne jest posiadanie następujących informacji w celu przeprowadzenia badania:
— rozpuszczalność w wodzie,
— ciśnienie pary,
— wzór strukturalny,
— czystość substancji testowej.
Zalecenie
Aktywowany szlam może zawierać potencjalne organizmy chorobotwórcze i należy się z nim obchodzić ostrożnie.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Wskaźnik oddychania jest to zużycie tlenowe drobnoustrojów ściekowych w szlamie tlenowym, ogólnie wyrażane jako mg O2 na mg szlamu na godzinę.
W celu dokonania obliczeń hamującego wpływu substancji testowej przy danym stężeniu wskaźnik oddychania wyrażony jest jako procent średniej z dwóch kontrolnych wskaźników oddychania.
gdzie:
Rs
=
wskaźnik zużycia tlenu przy badanym stężeniu substancji testowej,
Rc1
=
wskaźnik zużycia tlenu, grupa kontrolna 1,
Rc2
=
wskaźnik zużycia tlenu, grupa kontrolna 2.
W niniejszej metodzie EC50 jest stężeniem substancji testowej, przy którym wskaźnik oddychania wynosi 50 % wskaźnika wykazanego w grupie kontrolnej w warunkach opisanych w niniejszej metodzie.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Zaleca się użycie 3,5-dichlorofenolu, znanego inhibitora oddychania, jako substancji odniesienia i przeprowadzenie badania w celu ustalenia EC50 każdej partii aktywowanego szlamu jako środek kontrolny w celu oznaczenia nieprawidłowości w czułości szlamu.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Wskaźnik oddychania aktywowanego szlamu zasilonego standardową ilością ścieku syntetycznego mierzony jest po upływie kontaktowego czasu 30 minut lub trzech godzin, lub po upływie tych okresów czasu łącznie. Dokonuje się także pomiaru wskaźnika oddychania tego samego aktywowanego szlamu w obecności różnych stężeń substancji testowej w odmiennych warunkach. Hamujący wpływ substancji testowej o danym stężeniu jest wyrażony jako procent średnich wskaźników oddychania z dwóch grup kontrolnych. Wartość EC50 obliczana jest z ustaleń różnych stężeń.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Wyniki badania są ważne, jeżeli:
— wskaźniki oddychania dwóch grup kontrolnych wynoszą 15 % dla każdej z nich,
— wartość EC50 (30 minut i/lub trzy godziny) 3,5-dichlorofenolu mieści się w zakresie 5–30 mg/litr.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Odczynniki
1.6.1.1. Roztwory substancji testowej
Roztwory substancji testowej są przygotowywane w chwili rozpoczęcia badań z wykorzystaniem roztworu podstawowego. Stężenie roztworu podstawowego w wysokości 0,5 g/litr jest właściwe w przypadku stosowania niżej zalecanej procedury.
1.6.1.2. Roztwór substancji kontrolnej
Roztwór 3,5-dichlorofenolu można przygotować na przykład przez rozpuszczenie 0,5 g 3,5-dichlorofenolu w 10 ml 1 M NaOH, rozcieńczając w około 30 ml wody destylowanej, dodając podczas mieszania 0,5 M H2SO4 do punktu początkowego opadu – na koniec wymagane jest około 8 ml 0,5 M H2SO4 – a następnie należy rozcieńczyć mieszaninę wodą destylowaną do jednego litra. Wartość pH powinna wówczas wynosić 7–8.
1.6.1.3. Ścieki syntetyczne
Syntetyczną pożywkę dla mikroflory ścieku aktywowanego otrzymuje się przez rozpuszczenie następujących ilości substancji w jednym litrze wody:
— 16 g pepton,
— 11 g ekstrakt mięsa,
— 3 g mocznik,
— 0,7 g NaCl,
— 0,4 g CaCl2.2H2O,
— 0,2 g MgSO4.7H2O,
— 2,8 g K2HPO4.
Uwaga 1: Niniejszy ściek syntetyczny jest 100-krotnym koncentratem w porównaniu z koncentratem opisanym w Raporcie technicznym OECD „Proponowana metoda określania biodegradacji środków powierzchniowo czynnych stosowanych w syntetycznych detergentach” (11 czerwca 1976 r.), z dodatkiem ortofosforanu dipotasu.
Uwaga 2: Jeżeli przygotowany środek nie zostanie niezwłocznie zastosowany, należy go przechowywać bez dostępu światła w temperaturze 0–4 oC, przez okres nie dłuższy niż jeden tydzień, w warunkach, które nie spowodują żadnej zmiany w jego składzie. Środek można również wysterylizować przed przechowaniem lub można dodać pepton i ekstrakt mięsa tuż przed rozpoczęciem badania. Przed użyciem należy go dokładnie zmieszać i dostosować pH.
1.6.2. Urządzenia
Urządzenia pomiarowe: dokładny projekt nie jest istotny. Jednakże powinna być przestrzeń u góry naczynia, a sonda powinna być ciasno dopasowana w szyjce kolby pomiarowej.
Wymagany jest zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności następujące urządzenia:
— urządzenia pomiarowe,
— urządzenie napowietrzające,
— elektroda pH i urządzenia pomiarowe,
— elektroda O2.
1.6.3. Przygotowanie inokulum
Aktywowany szlam pochodzący z oczyszczalni ścieków w przeważającej mierze oczyszczającej ścieki wewnętrzne stosowany jest w badaniu jako mikrobiologiczne inokulum.
Jeżeli konieczne, po powrocie do laboratorium gruboziarniste cząsteczki można usunąć przez osadzanie przez krótki okres czasu, np. 15 minut, i przelanie górnej warstwy drobniejszej suchej masy w celu jej użycia. Alternatywnie, szlam można zmieszać przez okres kilku sekund, wykorzystując mikser.
Ponadto w przypadku podejrzenia występowania materiału hamującego szlam należy umyć bieżącą wodą lub roztworem izotonicznym. Po odwirowaniu należy przelać supernatant (procedurę powtarza się trzy razy).
Niewielką ilość szlamu należy zważyć i osuszyć. Na podstawie wyniku można obliczyć ilość mokrego szlamu, która ma być zawieszona w wodzie w celu uzyskania aktywowanego szlamu o wartości płynnej zawieszonej suchej masy wynoszącej 2–4 g/litr. Niniejszy poziom daje stężenie między 0,8 a 1,6 g/litr w badanej substancji, jeżeli przestrzegana jest niżej zalecana procedura.
Jeżeli szlamu nie można użyć w dniu jego zebrania, należy dodać 50 ml syntetycznego ścieku do każdego litra aktywowanego szlamu przygotowanego w sposób opisany powyżej; następnie należy go napowietrzać przez całą noc w temperaturze 20 ± 2 oC. Napowietrzanie należy stosować aż do chwili jego użycia w dniu następnym. Przed użyciem należy sprawdzić i dostosować pH, jeżeli jest to konieczne, do wartości pH 6–8. Płynną zawieszoną suchą masę należy ustalić w sposób określony w poprzednim ustępie.
Jeżeli wymagane jest użycie tej samej partii szlamu w kolejnych dniach badania (maksymalnie przez cztery dni), należy dodać kolejne 50 ml syntetycznej pożywki dla mikroflory ścieku aktywowanego na litr szlamu po zakończeniu każdego dnia roboczego.
1.6.4. Przeprowadzenie badania
Czas trwania/czas kontaktu:
30 minut i/lub trzy godziny, podczas którego przeprowadzane jest napowietrzanie
Woda:
Woda pitna (odchlorowana w razie konieczności)
Dostarczenie powietrza:
Czyste, bezoleiste powietrze. Strumień powietrza 0,5 –1 litr/minuta
Aparatura pomiarowa:
Kolba o płaskim dnie taka jak kolba BOD
Tlenomierz:
Odpowiednia elektroda tlenowa, z rejestratorem
Pożywka:
Ścieki syntetyczne (zob. powyżej)
Substancja testowa:
Substancja testowa jest świeżo przygotowywana przed rozpoczęciem badania.
Substancje odniesienia:
np. 3,5 -dichlorofenol (co najmniej trzy stężenia)
Kontrole:
Zaszczepiona próbka bez substancji testowej
Temperatura:
20 ± 2 oC.
Poniżej podano sugerowaną procedurę doświadczalną, którą można zastosować zarówno w badaniu, jak i do substancji odniesienia w trzygodzinnym czasie kontaktu.
Należy użyć kilka zbiorników (np. jednolitrowe zlewki).
Należy użyć co najmniej pięć wielkości stężeń, rozmieszczonych o stały czynnik najlepiej nieprzekraczający 3,2.
W czasie „0” 16 ml syntetycznej pożywki dla mikroflory ścieku aktywowanego uzupełniane jest wodą do objętości 300 ml. Należy dodać 200 ml inokulum bakteryjnego, a całą mieszaninę (500 ml) wlać do pierwszego zbiornika (pierwsza grupa kontrolna C1).
Zbiorniki testowe należy stale napowietrzać w celu zapewnienia, że rozpuszczony O2 nie opadnie poniżej wartości 2,5 mg/litr i że bezpośrednio przed pomiarem wskaźnika oddychania stężenie O2 wyniesie około 6,5 mg/litr.
Po „15 minutach” (15 minut stanowi bezwzględny, ale wygodny przedział czasowy) powyższa procedura jest powtarzana, z wyjątkiem 100 ml podstawowego roztworu substancji testowej, które dodaje się do 16 ml syntetycznego ścieku przed dodaniem wody do 300 ml i inokulum bakteryjnego w celu uzyskania objętości 500 ml. Następnie mieszanina ta jest wlewana do drugiego zbiornika i napowietrzana w sposób opisany powyżej. Proces powtarzany jest w 15-minutowych przedziałach czasu z różnymi wielkościami podstawowego roztworu substancji testowej celem uzyskania serii zbiorników zawierających różne stężenia substancji testowej. Na końcu przygotowuje się drugą grupę kontrolną (C2).
Po upływie trzech godzin odnotowuje się pH oraz wlewa się dobrze zmieszaną próbkę pobraną z zawartości pierwszego zbiornika do urządzeń pomiarowych i dokonuje się pomiaru wskaźnika oddychania przez czas do 10 minut.
Oznaczenie to powtarza się w odniesieniu do każdego zbiornika w 15-minutowych odstępach w taki sposób, aby czas kontaktu w każdym zbiorniku wynosił trzy godziny.
Substancja odniesienia badana jest dla każdej partii inokulum bakteryjnego według tej samej procedury.
W przypadku dokonywania pomiarów po 30 minutach kontaktu wymagany jest odmienny reżym (np. więcej niż jeden tlenomierz).
Jeżeli konieczny jest pomiar chemicznego zużycia tlenu, należy przygotować kolejne zbiorniki zawierające substancję testową, syntetyczną pożywkę dla mikroflory ścieku aktywowanego oraz wodę, ale bez aktywnego szlamu. Należy zmierzyć i odnotować zużycie tlenu po 30-minutowym okresie napowietrzania i/lub trzech godzinach (czas kontaktu).
2. DANE I OSZACOWANIE
Wskaźnik oddychania obliczany jest na podstawie historii zapisów między około 6,5 mg O2/litr a 2,5 mg O2/litr lub przez okres 10 minut, gdzie wskaźnik oddychania jest niski. Odcinek krzywej oddychania, powyżej którego następuje pomiar wskaźnika oddychania powinien być linearny.
Jeżeli wskaźniki oddychania z dwóch grup kontrolnych nie zawierają się w 15 % wartości każdego z nich lub wartość EC50 (30 minut i/lub trzy godziny) substancji odniesienia nie zawiera się w przyjętym przedziale (5–30 mg/litr dla 3,5-dichlorofenolu), badanie jest nieważne i musi zostać powtórzone.
Procent zahamowania obliczany jest dla każdej badanej wielkości stężenia (zob. 1.2). Procent zahamowania nanoszony jest na wykres względem stężenia na papierze logarytmicznym (lub papierze półlogarytmicznym) i uzyskanej wartości EC50.
95 % limit potwierdzenia dla wartości EC50 może zostać ustalony przez procedury standardowe.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
— dane identyfikacyjne chemicznej substancji testowej,
— system badania: źródło, stężenie i wstępne poddanie aktywnego szlamu działaniu substancji testowej,
— warunki badania:
— pH mieszaniny reakcji przed pomiarem oddychania,
— temperatura badania,
— czas trwania badania,
— substancje odniesienia i pomiar ich EC50,
— pobór abiotycznego tlenu (jeżeli dotyczy).
— wyniki:
— jakiekolwiek dane pomiarowe,
— krzywa zahamowania i metoda obliczania EC50,
— EC50 i, jeżeli to możliwe, 95 % limitów pewności, EC20 i EC30,
— jakiekolwiek uwagi i odstępstwa od metody badawczej, które mogły wpłynąć na wyniki.
3.2. INTERPRETACJA DANYCH
Wartość EC50 należy interpretować jedynie jako wskazówkę do prawdopodobnej toksyczności substancji testowej zarówno dla działania na ścieki aktywowanym szlamem, jak i dla mikroorganizmów występujących w ściekach, ponieważ złożone wzajemne oddziaływania zachodzące w środowisku nie mogą być odpowiednio stymulowane podczas badania laboratoryjnego. Ponadto substancje testowe, które mogą hamująco wpływać na utlenianie amoniaku, mogą również powodować nietypowe krzywe zahamowania. W związku z tym takie krzywe należy interpretować z ostrożnością.
4. ODNIESIENIA
(1) Międzynarodowy standard ISO 8192-1986.
(2) Broecker, B., Zahn, R., Badania wody 11, 1977, s. 165.
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosfera 10, 1981, s. 245.
(4) ETAD (Ekologiczne i Toksykologiczne Stowarzyszenie Przemysłu Przetwórczego Substancji Barwiących), Zalecana Metoda nr 103, również opisana przez:
(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, s. 80.
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, s. 247.
(7) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne Badania 209, decyzja Rady C (81) 30 wersja ostateczna.
C.12. BIODEGRADACJA
ZMODYFIKOWANE BADANIE SCAS
1. METODA
1.1. WSTĘP
Celem metody jest ocena wpływu całkowitej biodegradacji rozpuszczalnych w wodzie, nielotnych substancji organicznych, w przypadku ich ekspozycji na stosunkowo wysokie stężenia drobnoustrojów przez długi okres czasu. Żywotność drobnoustrojów utrzymywana jest przez ten okres, codziennie dodając zasiedloną pożywkę szlamową. (Odnośnie do wymogów związanych z przerwą weekendową, ścieki można przechowywać w temperaturze 4 oC. W związku z tym można użyć syntetycznych ścieków (test potwierdzający OECD).
Może mieć miejsce fizyczna i chemiczna adsorpcja zawieszonych substancji stałych, co należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników (zob. 3.2).
Z powodu długiego okresu zatrzymania fazy płynnej (36 godzin) i nieregularnego dodawania odżywek badanie nie pozoruje faktycznych warunków występujących w oczyszczalni ścieków. Wyniki otrzymane z różnymi substancjami testowymi oznaczają, iż badanie wykazuje wysoki wpływ biodegradacyjny.
Warunki stworzone w badaniu wysoce sprzyjają wyborowi i/lub przystosowaniu drobnoustrojów zdolnych do degradacji badanego związku. (Procedurę można również wykorzystać w celu wytworzenia zaaklimatyzowanego inokulum mogącego być zastosowanym w innych badaniach).
W metodzie tej pomiar stężenia rozwiązanego węgla organicznego lub chemicznego zapotrzebowania tlenu wykorzystywany jest w celu określenia całkowitej biodegradacji substancji testowej. Najlepiej ustalać DOC po zakwaszeniu i oczyszczeniu niż jako różnicę Ccałkowite – Cnieorganiczne.
Równoczesne zastosowanie szczególnej metody analitycznej może umożliwić ocenę podstawowej biodegradacji substancji (zanik pierwotnej budowy chemicznej).
Metodę stosuje się jedynie w odniesieniu do tych organicznych substancji testowych, które przy wielkości stężenia użytego w badaniu:
— są rozpuszczalne w wodzie (przy co najmniej 20 ml rozpuszczonego węgla organicznego/litr),
— posiadają nieznaczne ciśnienie pary,
— nie hamują bakterii,
— nie są znacznie absorbowane w badanym systemie,
— nie są tracone w wyniku wytwarzania piany z badanego roztworu.
Należy ustalić zawartość węgla w organicznym materiale testowym.
Informacje dotyczące względnych części składowych materiału testowego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, w szczególności w tych przypadkach gdzie wyniki są na niskim poziomie lub marginalne.
Informacje dotyczące wpływu toksyczności substancji na drobnoustroje mogą okazać się użyteczne w celu dokonania interpretacji słabych wyników oraz wyboru właściwych wielkości stężeń.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
CT
=
stężenie testowego związku jako węgla organicznego obecnego w lub dodawanego do osadzonego ścieku na początku czasu napowietrzania (mg/litr),
Ct
=
stężenie rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie substancji testowej na końcu czasu napowietrzania (mg/litr),
Cc
=
stężenie rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie w grupie kontrolnej na końcu czasu napowietrzania (mg/litr).
W metodzie tej biodegradacja określana jest jako zanik węgla organicznego. Biodegradację można wyrazić jako:
1. Procent ubytku Dda ilości substancji dodawanej codziennie:
[1]
gdzie:
Dda
=
degradacja/dzienna dawka dodana
2. Procent ubytku Dssd ilości substancji obecnej przy rozpoczęciu każdego dnia badania:
[2 (a)]
[2(b)]
gdzie:
Dssd
=
degradacja/substancja przy rozpoczęciu każdego dnia;
wskaźniki i oraz (i + 1) odnoszą się do dnia pomiaru.
Zaleca się równanie 2a) w przypadku, gdy ciecz wypływająca ze zbiornika DOC różni się z dnia na dzień, podczas gdy równanie 2b) można zastosować w przypadku, gdy ciecz wypływająca ze zbiornika DOC pozostaje na względnie stałym poziomie w kolejnych dniach.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
W niektórych przypadkach podczas badania nowych substancji użyteczne mogą okazać się substancje odniesienia; jednakże nie można zalecić żadnych poszczególnych substancji odniesienia.
Dane dotyczące kilku związków chemicznych przeanalizowanych za pomocą prób pierścieniowych dostarczane są głównie w celu przeprowadzenia (zob. dodatek 1) kalibracji metody odpowiednio do potrzeb i umożliwienia dokonania porównania wyników w przypadku zastosowania innej metody.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Aktywowany szlam, pochodzący z oczyszczalni ścieków, umieszczany jest w jednostce działającej na zasadzie szlamu aktywowanego o przepływie półstałym (SCAS). Następnie dodawany jest badany związek oraz wewnętrzne ścieki, po czym następuje napowietrzanie mieszaniny przez 23 godziny. Po 23 godzinach napowietrzanie zostaje przerwane w celu umożliwienia osadzenia się szlamu i ubytku supernatantów.
Następnie szlam pozostały w komorze napowietrzania jest mieszany z dalszą podwielokrotnością badanego związku i ścieku, a cykl jest powtarzany.
Biodegradacja ustalana jest przez określenie zawartości rozwiązanego węgla organicznego w supernatancie. Uzyskana wartość porównywana jest z wartością ustaloną dla płynu otrzymanego z probówki kontrolnej dozowanej jedynie osiadłym ściekiem.
W przypadku użycia szczególnej metody analitycznej można dokonać pomiaru zmian w stężeniu pierwotnej molekuły w wyniku biodegradacji (podstawowa biodegradacja).
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Reprodukcyjność metody, oparta na ubytku rozwiązanego węgla organicznego, nie została jeszcze ustalona. (W przypadku rozważania podstawowej biodegadacji bardzo dokładne dane uzyskiwane są w odniesieniu do materiałów degradowanych ekstensywnie).
Czułość metody jest przeważnie ustalana przez zmienność próbki ślepej i, w mniejszym stopniu, przez precyzję określenia rozwiązanego węgla organicznego i poziomu badanego związku w roztworze po rozpoczęciu każdego cyklu.
1.6. OPIS PROCEDURY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowania
Dla każdej substancji testowej oraz grup kontrolnych składana jest odpowiednia liczba czystych napowietrzanych jednostek, ewentualnie można zastosować oryginalne, 1,5-litrowe jednostki badawcze SCAS oraz probówki doprowadzające powietrze (rysunek 1). Sprężone powietrze doprowadzane do jednostek testowych, oczyszczone przez bawełniano-wełniany filtr, nie powinno zawierać węgla organicznego oraz powinno zostać nasycone wodą w celu obniżenia jej ubytku wskutek parowania.
Próbka zmieszanego płynu, zawierająca 1–4 g zawieszonej suchej masy na litr, otrzymywana jest z oczyszczalni ścieków, oczyszczającej w głównej mierze ścieki wewnętrzne. Wymagane jest około 150 ml zmieszanego płynu dla każdej napowietrzanej jednostki.
Roztwory podstawowe substancji testowej przygotowywane są w wodzie destylowanej; wymagana wartość stężenia zazwyczaj wynosi 400 mg/litr, tak jak węgiel organiczny, którego stężenie substancji testowej wynosi 20 mg/litr węgla na początku każdego cyklu napowietrzania, jeżeli nie zachodzi biodegradacja.
Dopuszczane są wyższe stężenia, jeżeli pozwala na to wpływ toksyczności na drobnoustroje.
Skład węgla organicznego roztworów podstawowych podlega pomiarowi.
1.6.2. Warunki badania
Badanie należy przeprowadzić w temperaturze 20–25 oC.
Stosowane jest wysokie stężenie drobnoustrojów tlenowych (1–4 g/litr zawieszonej suchej masy), a skuteczny okres zatrzymania wynosi 36 godzin. Materiał zawierający węgiel w pożywce szlamowej jest rozlegle utleniany, zazwyczaj w ciągu ośmiu godzin od rozpoczęcia każdego cyklu napowietrzania. Od tego czasu szlam oddycha endogenicznie przez pozostały czas napowietrzania, w którym jedyny dostępny substrat stanowi związek testowy, jeżeli również nie ulega łatwej metabolizacji. Cechy te, połączone z codziennym szczepieniem substancją testową, w przypadku zastosowania wewnętrznego ścieku jako pożywki, zapewniają wysoce korzystne warunki zarówno dla aklimatyzacji, jak i dla wysokiego stopnia biodegradacji.
1.6.3. Przeprowadzenie badania
Próbka zmieszanego płynu pochodząca z oczyszczalni ścieków, oczyszczającej w głównej mierze ścieki wewnętrzne lub jednostki laboratoryjnej, uzyskiwana jest i utrzymywana w warunkach tlenowych aż do chwili jej użycia w laboratorium. Każda napowietrzana jednostka, a także jednostka kontrolna wypełniana jest 150 ml zmieszanego płynu (w przypadku użycia oryginalnej jednostki testowej SCAS należy pomnożyć dane wielkości przez 10) i rozpoczyna się napowietrzanie. Po 23 godzinach napowietrzanie zostaje przerwane na 45 minut, w celu umożliwienia osadzenia się szlamu. Z kolei należy otworzyć zawór każdego zbiornika i pobrać 100 ml porcję supernatanu. Próbka osiadłego ścieku wewnętrznego powinna zostać pobrana bezpośrednio przed jej użyciem i 100 ml dodawane jest do szlamu pozostającego w każdej napowietrzanej jednostce. Proces napowietrzania rozpoczyna się od nowa. W tej fazie nie są dodawane żadne materiały testowe, a jednostki zasilane są codziennie wyłącznie wewnętrznymi ściekami aż do chwili otrzymania czystego supernatanu po osadzeniu. Powyższa faza zazwyczaj trwa dwa tygodnie, podczas których rozwiązany węgiel organiczny w supernatanie zbliża się do stałej wartości na końcu każdego cyklu napowietrzania.
Po upływie tego okresu poszczególne osadzone szlamy należy zmieszać i dodać 50 ml otrzymanego w ten sposób połączonego szlamu do każdej jednostki.
95 ml osadzonego ścieku i 5 ml wody dodawane jest do jednostek kontrolnych, i 95 ml osadzonego ścieku plus 5 ml właściwego roztworu podstawowego badanego związku (400 mg/litr) dodawane jest do jednostek testowych. Napowietrzanie należy rozpocząć od nowa i kontynuować przez 23 godziny. Następnie należy umożliwić osadzenie się szlamu przez okres 45 minut oraz należy ściągnąć i przeanalizować supernatan w celu ustalenia składu rozwiązanego węgla organicznego.
Powyższą procedurę napełniania i ściągania powtarza się codziennie przez cały okres trwania badania.
Przed osadzeniem konieczne jest oczyszczenie ścian jednostek w celu zapobieżenia nagromadzania się suchej masy ponad poziom płynu. W tym celu należy użyć oddzielnego skrobaka lub szczotki dla każdej z jednostek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Najlepiej, aby wartość rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie ustalana była codziennie, chociaż dopuszcza się rzadsze przeprowadzanie analiz. Przed przeprowadzeniem analiz płyny filtrowane są przez oczyszczone 0,45 μm filtry membranowe lub odwirowywane. Filtry membranowe są odpowiednie jeżeli zostanie potwierdzone, iż nie uwalniają węgla, ani nie absorbują substancji w fazie filtracji. Temperatura próbki nie może przekraczać 40 oC w chwili umieszczenia jej w wirówce laboratoryjnej.
Długość trwania badania w odniesieniu do związków wykazujących niską lub zerową biodegradację nie jest określona, ale doświadczenie sugeruje, iż taki okres powinien trwać co najmniej 12 tygodni, ale nie dłużej niż 26 tygodni.
2. DANE I OSZACOWANIE
Wartości rozwiązanego węgla organicznego w supernatanach w jednostkach testowych i jednostkach kontrolnych nanoszone są na wykres względem czasu.
W przypadku osiągnięcia biodegradacji jej poziom określony w jednostce badawczej zbliży się do poziomu w jednostce kontrolnej. Po ustaleniu stałej różnicy między dwoma poziomami w trzech kolejnych pomiarach liczba kolejnych pomiarów uzależniona jest od możliwości dokonania statystycznej analizy danych oraz należy obliczyć procentową biodegradację związku testowego (Dda lub Dssd, zob. 1.2).
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
— wszelkie informacje dotyczące rodzaju ścieku, typu zastosowanej jednostki oraz wyniki badania dotyczące substancji testowej, substancji odniesienia, jeżeli została użyta, oraz próbki ślepej,
— temperatura,
— krzywa ubytku związku wraz z opisem, sposób obliczania (zob. 1.2),
— data i lokalizacja pobrania próbki aktywowanego szlamu i ścieku, poziom przystosowania, stężenie itd.,
— naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury badawczej,
— data i podpis.
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Ponieważ substancja przeznaczona do badania niniejszą metodą nie będzie ulegać łatwej biodegradacji, jakikolwiek ubytek DOC spowodowany wyłącznie biodegradacją przebiegać będzie stopniowo w okresie dni i tygodni, z wyjątkiem takich przypadków, gdzie aklimatyzacja jest nagła i zasygnalizowana nagłym zniknięciem substancji następującym po okresie kilku tygodni.
Jednakże fizyko-chemiczna adsorpcja może w niektórych przypadkach odegrać istotną rolę; sygnalizowane jest to w chwili gdy następuje całkowity lub częściowy ubytek dodanego DOC na początku badania. To, co następuje później, zależy od czynników, takich jak stopnie adsorpcji i stężenia zawieszonej suchej masy w odrzuconej cieczy wypływającej ze zbiornika. Zwykle różnica między stężeniami DOC w supernatanach w grupie kontrolnej i w grupie badanej stopniowo wzrasta od początkowej niskiej wartości, a następnie utrzymuje się na nowym poziomie wartości w pozostałym okresie badania, jeżeli nie zachodzi aklimatyzacja.
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań, jeżeli istnieje potrzeba rozróżnienia między biodegradacją (lub częściową biodegradacją) i adsorpcją. Można to osiągnąć na wiele sposobów, ale najbardziej przekonujące jest użycie supernatantu lub szlamu jako inokulum w teście podstawowym (najlepiej teście respirometrycznym).
Substancje testowe powodujące wysoki, nieadsorpcyjny ubytek DOC w niniejszym badaniu należy uważać za substancje wpływające biodegradacyjnie. Częściowy, nieadsorpcyjny ubytek oznacza, że substancja chemiczna ulega co najmniej nieznacznej biodegradacji.
Niski, lub zerowy poziom ubytku DOC może być spowodowany zahamowaniem aktywności drobnoustrojów przez substancję testową, co można również wykryć przez rozpad lub utratę szlamu, dającego mętne supernatany. Badanie należy powtórzyć, wykorzystując niskie stężenie substancji testowej.
Użycie specyficznej dla danego związku metody analitycznej lub substancji testowej znakowanej izotopem węgla 14C zwiększa czułość metody. W przypadku związków znakowanych 14C odzyskanie 14CO2 potwierdzi, że zaszła biodegradacja.
W przypadku podawania wyników z uwzględnieniem początkowej biodegradacji, jeżeli możliwe, należy wyjaśnić zmianę w budowie chemicznej, która powoduje utratę reakcji macierzystej substancji testowej.
Zatwierdzenie metody analitycznej musi być dostarczone razem z reakcją, która zaszła w próbce ślepej.
4. ODNIESIENIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne badania 209, decyzja Rady C (81) 30 wersja ostateczna.
Dodatek 1
Badanie SCAS: przykładowe wyniki
Substancja
CT
(mg/l)
Ct – Cc
(mg/l)
Procentowa biodegradacja,
Dda
Czas trwania badania
(dni) Sulfonian 4-acetyloaminobenzenu
17,2
2,0
85
40
Sulfonian tetrapropylenobenzenu
17,3
8,4
51,4
40
4-nitrofenol
16,9
0,8
95,3
40
Glikol dietylenowy
16,5
0,2
98,8
40
Anilina
16,9
1,7
95,9
40
Cyklopentanotetrakarboksylan
17,9
3,2
81,1
120
Dodatek 2
Przykładowe urządzenia badawcze
powietrze
Objętość 50 ml
C.13. BIOKONCENTRACJA: BADANIE RYB W WARUNKACH PRZEPŁYWU
1. METODA
Ta metoda biokoncentracji jest powtórzeniem OECD WT 305 (1996).
1.1. WPROWADZENIE
Metoda ta opisuje procedurę charakteryzowania biokoncentracyjnego potencjału substancji znajdujących się w rybach w warunkach przepływu. Chociaż preferuje się bardziej wymogi obowiązujące dla badań w warunkach przepływu, dopuszczalne są wymogi obowiązujące dla badań w warunkach częściowo statycznych, pod warunkiem że spełnione są kryteria prawidłowości.
Metoda podaje wystarczające szczegóły dla przeprowadzenia badania, jednocześnie zezwalając na stosowną dowolność w dostosowywaniu procedury doświadczalnej do warunków w poszczególnych laboratoriach oraz na zróżnicowane właściwości substancji badanych. Jest ona najbardziej prawidłowo stosowana w odniesieniu do chemikaliów organicznych o wartościach log Pow między 1,5 i 6,0 (1), ale może być także stosowana do substancji superlipofilowych (o wartości log Pow > 6,0). Wstępne oszacowanie czynnika biokoncentracji (BCF), czasami oznaczanego jako KB, dla takich substancji będzie prawdopodobnie wyższe niż wartość czynnika biokoncentracji w stanie ustalonym (BCFSS), które spodziewa się uzyskać w doświadczeniach laboratoryjnych. Wstępne oszacowania czynnika biokoncentracji dla chemikaliów organicznych o wartościach log Pow wynoszących około 9,0 można uzyskać, stosując równanie Binteina i inne (2). Parametry, które charakteryzują potencjał biokoncentracji, zawierają stałą szybkość absorpcji (k1), stałą szybkość oczyszczania (k2) oraz BCFSS.
Substancje badane oznakowane radiologicznie mogą ułatwić analizę próbek wody i ryb oraz mogą być wykorzystywane do określania, czy konieczne jest wykonanie identyfikacji i kwantyfikacji degradacji. Jeżeli mierzony jest ogół pozostałości radioaktywnych (np. przez spalanie lub rozpuszczanie tkanki), BCF jest oparte na związku macierzystym, wszelkich zatrzymanych metabolitach, a także na asymilowanym węglu. Z tego względu BCFS, oparty na ogóle pozostałości radioaktywnych, nie może być bezpośrednio porównywalny z BCF uzyskiwanym w drodze szczegółowej analizy chemicznej wyłącznie związku macierzystego.
W badaniach substancji oznaczonych radiologicznie można zastosować procedury oczyszczania w celu określenia czynnika BCF w oparciu o związek macierzysty i, jeżeli uzna się to za konieczne, można opisać główne metabolity. Możliwe jest także połączenie badania metabolizmu ryb z badaniem biokoncentracji poprzez analizę i identyfikacje pozostałości w tkankach.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Biokoncentracja/bioakumulacja: jest wzrostem koncentracji substancji badanej w organizmie lub na nim (jego określonych tkankach), w stosunku do koncentracji substancji badanej w otaczającym środowisku.
Czynnik biokoncentracji (BCF lub KB) w każdym momencie w trakcie fazy absorpcji tego badania akumulacji jest stężeniem substancji badanej w/na rybie lub w jej określonych tkankach (Cf jako μg/g (ppm)), podzielone przez koncentrację tej substancji chemicznej w otaczającym środowisku (Cw jako μg/ml (ppm)).
Stały czynnik biokoncentracji (BCFSS lub KB) nie zmienia się znacząco w długim okresie czasu, stężenie substancji badanej w otaczającym środowisku w tym okresie czasu jest stale.
Plateau lub stan ustalony osiągany jest, wykreślając ilość substancji badanej w rybach (Cf) w zależności od momentu, kiedy krzywa staje się równoległa do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy Cf, wykonane na próbkach pobranych w odstępach, co najmniej dwóch dni, różnią się od siebie o ± 20 % i nie ma znacznych różnic między trzema okresami pobierania próbek. Przy wspólnej analizie próbek wymagane są przynajmniej cztery następujące po sobie analizy. W odniesieniu do substancji badanych, które są pobierane powoli, odstępy czasu powinny wynosić odpwiednio siedem dni.
Czynniki biokoncentracji, obliczane bezpośrednio ze stałych wskaźników kinetycznych (k1/k2), określane są jako czynniki koncentracji kinetycznej, BCFK.
Współczynnik podziału oktanol-woda (Pow) jest to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie w równowadze (metoda A.8), wyrażany także jako Kow. Logarytm Pow wykorzystywany jest jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do biokoncentracji przez organizmy wodne.
Faza narażenia na działanie substancji j absorpcji jest to czas, w trakcie którego ryby narażone są na działanie badanej substancji chemicznej.
Stała szybkość absorpcji (k1) jest wartością liczbową określającą tempo wzrostu koncentracji substancji badanej w rybach i na nich (lub w nich czy ich określonych tkankach) w czasie gdy ryby wystawione są na działanie tej substancji (k1 wyraża się w dniach-1).
Faza po narażeniu na działanie substancji/oczyszczania (ubytku) jest to czas następujący po przeniesieniu ryb ze środowiska zawierającego substancje do środowiska wolnego od tej substancji, w trakcie którego badane jest oczyszczanie (lub ich określonych tkanek) z substancji (ubytek netto).
Stała szybkość oczyszczania (ubytku) (k2) jest wartością liczbową określającą tempo zmniejszania koncentracji substancji badanej w badanych rybach (lub ich określonych tkankach) po przeniesieniu badanych ryb ze środowiska zawierającego substancje badaną do środowiska wolnego od tej substancji (k2 wyrażana jest w dniach-1).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Badanie składa się z dwóch faz: faza narażenia na działanie substancji (absorpcja) i faza po narażeniu na działanie substancji (oczyszczania). Podczas fazy absorpcji oddzielne grupy ryb jednego gatunku narażone są na działanie substancji badanej o co najmniej dwóch różnych stężeniach. Następnie ryby przenosi się do środowiska wolnego od substancji badanej w celu przeprowadzenia fazy oczyszczania. Faza oczyszczania jest zawsze konieczna, chyba że absorpcja substancji podczas fazy absorpcji jest nieznaczna (np. czynnik BCF jest mniejszy niż 10). Stężenie substancji badanej w/na rybach (lub w ich określonych tkankach) śledzi się w obu fazach badania. Oprócz dwóch badań stężeń substancji badanej, kontrolowaną grupę ryb przetrzymuje się w identycznych warunkach, z wyjątkiem obecności substancji badanej, w celu odniesienia możliwych negatywnych skutków zaobserwowanych w badaniu biokoncentracji do odpowiedniej grupy kontrolowanej oraz w celu uzyskania bazowych stężeń substancji badanej.
Faza absorpcji trwa 28 dni, jeżeli nie wykaże się, że równowaga została osiągnięta wcześniej. Przewidywany czas trwania fazy absorpcji i czas osiągnięcia stanu ustalonego można obliczyć w oparciu o równanie podane w załączniku 3. Następnie rozpoczyna się okres oczyszczania przez przeniesienie ryb do takiego samego środowiska, ale bez substancji badanej w innym czystym naczyniu. W miarę możliwości czynnik biokoncentracji oblicza się zarówno jako stosunek (BCFSS) stężenia w rybach (Cf) i w wodzie (Cw) w pozornym stanie ustalonym, jak też jako kinetyczny czynnik biokoncentracji (BCFK), będący stosunkiem stałych szybkości absorpcji (k1) i oczyszczania (k2), uznając kinetykę reakcji pierwszego rzędu. Jeżeli kinetyka reakcji pierwszego rzędu jest w oczywisty sposób nieprzestrzegana, należy zastosować bardziej złożone wzory (załącznik 5).
Jeżeli stanu ustalonego nie osiągnie się w ciągu 28 dni, fazę absorpcji należy przedłużyć do czasu osiągnięcia stanu ustalonego lub do 60 dni, w zależności od tego, co nastąpi najpierw; następnie rozpoczyna się fazę oczyszczania.
Stała szybkość absorpcji, stała szybkość reakcji (lub stałe w przypadku gdy zastosowane są bardziej złożone wzory) oczyszczania (ubytku), czynnik biokoncentracji oraz, w miarę możliwości, przedziały ufności dla każdego z tych parametrów oblicza się w oparciu o wzór, który najlepiej opisuje mierzone stężenia substancji badanej w rybach i wodzie.
BCF wyraża się jako funkcje całkowitej mokrej masy ryb. Jednakże do szczególnych celów można wykorzystać określone tkanki lub organy (np. mięsnie, wątroba), jeżeli ryby są wystarczająco duże, lub podzielić ryby na części jadalne (filet) i niejadalne (wnętrzności). Ze względu na to, że w odniesieniu do wielu substancji organicznych istnieje wyraźny związek między zdolnością do biokoncentracji i lipofilowości, istnieje także odpowiadająca mu zależność między zawartością lipidów w rybach i zaobserwowaną biokoncentracją takich substancji. Dlatego w celu zmniejszenia tego źródła zróżnicowania w wynikach badania dla substancji o wysokiej lipofilowosci (tj. o log Pow > 3) biokoncentracja powinna być wyrażona w odniesieniu do zawartości lipidów oprócz całkowitej masy ciała.
Zawartość lipidów powinna być określana na takim samym materiale biologicznym, jaki jest wykorzystywany dla określania substancji badanej, jeżeli jest to możliwe.
1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI BADANEJ
Przed przeprowadzaniem badania na biokoncentrację powinny być znane następujące informacje dotyczące substancji badanej:
— rozpuszczalność w wodzie,
— współczynnik podziału oktanol-woda Pow (oznaczany także jako Kow ustalany za pomocą metody HPLC w A.8),
— hydroliza,
— fotodysocjacja w wodzie, określana w warunkach napromieniowania słonecznego lub symulowanym napromienianiu słonecznym i w warunkach napromieniania badania na biokoncentracji (3),
— napięcie powierzchniowe (np. dla substancji, dla których nie można ustalić log Pow),
— prężność pary,
— biodegradalność inicjalna (jeżeli dotyczy).
Inną wymaganą informacją jest toksyczność dla ryb, które mają być wykorzystywane w trakcie badania, najlepiej asymptotyczna LC50 (tj. niezależna od czasu). Dostępna musi być odpowiednia metoda analizy o potwierdzonej dokładności, precyzji i czułości, dla kwantyfikacji substancji badanej w roztworach badawczych i materiale biologicznym, wraz ze szczegółami dotyczącymi przygotowania i składowania próbki. Powinna być również znana analityczna granica detekcji substancji badanej zarówno w wodzie, jak i w tkankach ryb. Jeśli wykorzystywana jest substancja oznakowana 14C, powinien być znany udział radioaktywności związany z zanieczyszczeniami.
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Następujące warunki powinny mieć zastosowanie w odniesieniu do badania, aby było ono ważne:
— zmiana temperatury jest mniejsza niż ± 2 oC,
— stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia,
— stężenie substancji badanej w komorach utrzymuje się na poziomie ± 20 % średniej zmierzonych wartości w trakcie fazy absorpcji,
— śmiertelność lub inne negatywne skutki/choroby, zarówno wśród ryb kontrolnych, jak i badanych, jest mniejsza niż 10 % po zakończeniu badania; w przypadku gdy badanie jest przedłużone o kilka tygodni lub miesięcy, śmiertelność lub inne negatywne skutki w obydwu grupach ryb powinny być niższe niż 5 % w stosunku miesięcznym i całkowicie nie powinny przekraczać 30 %.
1.6. ZWIĄZKI ODNIESIENIA
Wykorzystanie związków odniesienia o znanej zdolności do biokoncentracji może być użyteczne przy sprawdzaniu procedury doświadczalnej, jeżeli jest to wymagane. Jednakże niemożliwe jest na razie polecenie konkretnych substancji.
1.7. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.7.1. Aparatura
Należy zadbać, aby unikać wykorzystywania w odniesieniu do wszystkich części aparatury, materiałów, które mogą rozpuszczać się, sorbować lub ługować i wywoływać szkodliwe skutki dla ryb. Można wykorzystywać standardowe, prostokątne lub cylindryczne zbiorniki, wykonane z materiałów chemicznie obojętnych i o odpowiedniej pojemności, zgodnej ze wskaźnikiem pojemności. Wykorzystanie rur z miękkiego plastiku powinno być minimalne. Zalecane jest wykorzystywanie rur teflonowych, ze stali nierdzewnej i/lub szklanych. Doświadczenie wskazało, że dla substancji o wysokich współczynnikach absorpcji, jak np. syntetyczne pyretroidy, może być wymagane szkło silanizowane. W takich sytuacjach sprzęt będzie musiał po zostać wyrzucony po wykorzystaniu.
1.7.2. Woda
Zwykle do badania wykorzystywana jest woda naturalna, która powinna być uzyskiwana z niezanieczyszczonego źródła oraz ze źródła o jednolitej jakości. Woda rozcieńczana powinna być jakości, która pozwoli na przetrwanie wybranych gatunków ryb przez okres trwania aklimatyzacji i okres badań oraz nie będzie powodowała pojawienia się nieprawidłowego ich wyglądu lub zachowania. W idealnym przypadku powinno się wskazać, że badane gatunki mogą przeżyć, rosnąć i rozmnażać się w wodzie rozcieńczonej (np. badanie w warunkach laboratoryjnych lub na toksyczność w cyklu życia). Woda powinna być scharakteryzowana, przynajmniej przez pH, twardość, całkowitą zawartość ciał stałych, całkowitą zawartość węgla organicznego oraz w miarę możliwości amonu, azotynu oraz alkaliczności i, w odniesieniu do gatunków morskich, zasolenia. Parametry, które są ważne dla optymalnego dobrostanu ryb, są znane w pełni, jednak załącznik 1 podaje zalecane najwyższe stężenia kilku parametrów dla badanych wód słodkich i morskich.
W czasie trwania badania jakość wody powinna być stała. Wartość pH powinna mieścić się w zakresie 6,0–8,5, ale podczas danego badania powinna wynosić ±0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, że woda rozcieńczana nie wpłynie negatywnie na wyniki badania (np. przez zmianę właściwości substancji badanej) lub na zachowanie ryb, co pewien czas należy pobierać próbki do analizy. Powinny zostać oznaczone zawartości metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Cd, Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestycydów (np. całkowitej zawartości pestycydów organofosforowych i organochlorowych), zawartości węgla organicznego i zawiesin, np. co trzy miesiące, w przypadku gdy wiadomo, że woda rozcieńczona ma względnie stałą jakość. Jeżeli wykazano, że woda ma stałą jakość przez okres co najmniej jednego roku, oznaczenia mogą być przeprowadzane rzadziej, a odstępy czasu między oznaczeniami wydłużone (np. co sześć miesięcy).
Naturalna zawartość cząstek, jak również całkowita zawartość węgla organicznego (TOC) wody do rozcieńczania powinna możliwie jak najniższa, w celu uniknięcia absorpcji substancji badanej do materii organicznej, która może zmniejszyć jej biodostępność (4). Najwyższa dopuszczalna wartość wynosi 5 mg/l dla cząstek stałych (masa sucha, która nie jest przepuszczana przez filtr 0,45 μm) oraz 2 mg/l dla całkowitej zawartości węgla organicznego (zob. załącznik 1). W miarę potrzeb woda powinna zostać przefiltrowana przed wykorzystaniem. Udział zawartości węgla organicznego w wodzie, z badania ryb (odchody) oraz z pozostałości pożywienia powinien być możliwie jak najniższy. W trakcie trwania badania stężenie węgla organicznego w naczyniu do badania nie powinno przekraczać stężenia węgla organicznego pochodzącego z substancji badanej i – jeżeli jest wykorzystywany – środka rozpuszczającego o więcej niż 10 mg/l (± 20 %).
1.7.3. Badane roztwory
Podstawowy roztwór substancji badanej przygotowywany jest w odpowiednim stężeniu. Roztwór podstawowy powinien być przygotowywany przez mieszanie lub wstrząsanie substancji badanej w wodzie do rozcieńczania. Nie zaleca się wykorzystywania rozpuszczalników lub dyspergatorów (czynników rozpuszczających); jednakże może to nastąpić w niektórych przypadkach, w celu wytworzenia roztworu podstawowego o odpowiednim stężeniu. Rozpuszczalniki, które mogą zostać wykorzystane, to etanol, metanol, eter monometylowy glikolu etylenowego, eter dwumetylenowy glikolu etylenowego, dwumetyloformamid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne dyspergatory to kremofor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Wykorzystując czynniki łatwo ulegające biodegradacji, należy zachować ostrożność, ponieważ mogą one powodować problemy z porostem bakterii w badaniach przepływowych. Substancja badana może być oznakowana radiologicznie i powinna być o możliwie największej czystości (np. > 98 %).
W odniesieniu do badań przepływowych wymagany jest system, który nieprzerwanie dostarcza i rozcieńcza roztwór podstawowy substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, sytnik), w celu dostarczenia koncentratów badanych do komór badawczych. Zezwala się na co najmniej pięciokrotną wymianę całej objętości roztworu dziennie w każdej komorze badawczej. Preferowana ma być technika przepływowa, ale w przypadkach gdy nie jest to możliwe (np. gdy zachodzi negatywne działanie na organizmy badane), dopuszczalne jest stosowanie techniki półstatycznej, pod warunkiem że spełnione są kryteria ważności. Szybkość przepływu roztworów podstawowych i wody do rozcieńczania powinny być sprawdzane 48 godzin przed badaniem, a potem co najmniej raz dziennie. W tej kontroli zawarte jest określenie szybkości przepływu przez każdą komorę badawczą i zapewnione jest, że nie różni się ona między komorami i wewnątrz nich o więcej niż 20 %.
1.7.4. Wybór gatunków
Ważnymi kryteriami w wyborze gatunków jest fakt, że są one łatwo dostępne, mogą być uzyskane w odpowiednich rozmiarach i mogą być z powodzeniem przetrzymywane w laboratorium. Inne kryteria w odniesieniu do wybierania gatunków obejmują względy rekreacyjne, handlowe i ekologiczne, jak również porównywalną wrażliwość, pomyślne wykorzystanie w przeszłości itp.
Zalecane gatunki do badania są podane w załączniku 2. Inne gatunki mogą zostać wykorzystane, ale może istnieć konieczność dostosowania procedury badawczej celu zapewnienia odpowiednich warunków dla przeprowadzenia badania. W takim przypadku powinno zostać odnotowane racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru gatunku i metody doświadczalnej.
1.7.5. Przetrzymywanie ryb
Podstawową populacje ryb aklimatyzować przez co najmniej dwa tygodnie w wodzie w temperaturze badania i karmić w oparciu o wystarczającą dietę, tego samego rodzaju, która ma być wykorzystana w trakcie badania.
Po 48-godzinnym okresie adaptacji odnotowuje się współczynnik śmiertelności i stosuje się następujące kryteria:
— śmiertelność wyższa niż 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: odrzucić całą partię,
— śmiertelność między 5 i 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: aklimatyzować przez dodatkowe siedem dni,
— śmiertelność niższa niż 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: zaakceptować partię – jeżeli śmiertelność jest wyższa niż 5 % w ciągu siedmiu dodatkowych dni, odrzucić całą partię.
Zapewnić, że ryby wykorzystywane w badaniu są wolne od dostrzegalnych chorób i nieprawidłowości. Odrzucić wszystkie chore ryby. Ryby nie powinny być leczone na żadną chorobę w okresie dwóch tygodni poprzedzających badanie albo w trakcie badania.
1.8. PRZEPROWADZENIE BADANIA
1.8.1. Badanie wstępne
Może być ono użyteczne w celu przeprowadzenia wstępnego doświadczenia w celu zoptymalizowania warunków dla przeprowadzenia badania ostatecznego, np. wybór stężenia (stężeń) substancji, czasu trwania fazy absorpcji i oczyszczania.
1.8.2. Warunki narażenia na działanie substancji
1.8.2.1. Czas trwaniafazy wchłaniania
Przewidzenie czasu trwania fazy wchłaniania może zostać uzyskane w oparciu o doświadczenie praktyczne (np. z poprzedniego badania lub nagromadzenia powiązanej substancji chemicznej) lub w oparciu o pewne empiryczne związki wykorzystujące wiedzę dotyczącą albo rozpuszczalności w wodzie albo współczynnika podziału oktanol/woda substancji badanej (zob. załącznik 3).
Faza wchłaniania powinna trwać 28 dni, chyba że może zostać udowodnione, iż równowagę osiągnięto wcześniej. Jeśli stan ustalony nie został osiągnięty przed upływem 28 dni, faza absorpcji powinna zostać przedłużona, pobierając dalsze pomiary, do momentu osiągnięcia stanu ustalonego, lub też do 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy.
1.8.2.2. Czas trwania fazy oczyszczania
Okres połowy czasu trwania fazy absorpcji jest zazwyczaj wystarczający do zmniejszenia pojawiania się (95 %) substancji w masie ciała (zob. załącznik 3 dla wyjaśnienia oszacowania). Jeżeli czas wymagany do osiągnięcia 95 % straty jest zbyt długi, co jest jednocześnie niepraktyczne, przekraczając przykładowo dwukrotnie normalny czas trwania fazy absorpcji (tzn. więcej niż 5–6 dni), może zostać wykorzystany krótszy (np. do czasu, aż stężenie substancji badanej jest niższe niż 10 % stężenia substancji w stanie ustalonym). Jednakże w odniesieniu do substancji posiadającej bardziej złożone wzory absorpcji i oczyszczania niż te, które reprezentuje jednokomorowy model ryby i które oparte są na kinetyce pierwszego rzędu, można zastosować dłuższą fazę oczyszczania, w celu określenia stałych wartości wskaźnika utraty. Okres ten jednak może być regulowany przez okres, w trakcie którego stężenie substancji badanej w rybach pozostaje na poziomie powyżej analitycznego limitu wykrywania.
1.8.2.3. Liczba badanych ryb
Wybrać taką liczba ryb przypadającą na badanie, aby w każdej próbce były co najmniej cztery ryby. Jeśli wymagana jest większa ilość, niezbędna będzie większa liczba ryb przypadających na badanie. Jeśli wykorzystywane są dorosłe ryby, udokumentować przed czy w doświadczeniu wykorzystano samce, samice czy też obie płci.
Jeżeli wykorzystano ryby obu płci, udokumentować różnice występujące w zawartości lipidów, aby nie miały one znaczenia dla doświadczenia przed rozpoczęciem narażenia na działanie substancji; niezbędne może być połączenie wszystkich samic i samców ryb w jednym zbiorniku.
W jakimkolwiek badaniu wybierane są ryby o podobnej masie, tak aby masa najmniejszej z nich nie była mniejsza niż dwie trzecie masy największej z ryb. Wszystkie ryby powinny należeć do tej samej klasy wiekowej i pochodzić z tego samego źródła. Ze względu na to, że masa i wiek ryb mają znaczący wpływ na wartości BCF (1), szczegóły te są odpowiednio udokumentowane. Zaleca się zważenie podpróbki z zasobów ryb przed rozpoczęciem badania, w celu ustalenia średniej masy.
1.8.2.4. Dostarczanie ryb
Wykorzystuje się wysoką proporcję między ilością ryb i wody w celu zminimalizowania zmniejszenia w Cw spowodowanego przez dodanie ryb na początku badania, a także w celu uniknięcia spadku stężenia rozpuszczonego tlenu. Proporcje te są stosowane również w tym celu, aby uniknąć spadków stężenia rozpuszczonego tlenu. Ważne jest, aby wskaźnik dostarczenia ryb był odpowiedni dla poszczególnych badanych gatunków. W każdym przypadku zaleca się, aby wskaźnik dostarczenia ryb wynosił 0,1–1,0 g ryb (masa mokra) na litr wody dziennie. Wysokie wskaźniki dostarczania ryb mogą być wykorzystane, jeśli wykaże się, że wymagane stężenie substancji badanej może być zachowane w ramach ograniczeń ± 20 % oraz że stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia.
Wybierając systemy dostarczania ryb, bierze się pod uwagę naturalne środowisko, w którym występują dane gatunki ryb. Na przykład ryby żyjące na dnie zbiorników mogą wymagać większej przestrzeni dna akwarium w odniesieniu do tej samej objętości wody niż ryby pelagiczne.
1.8.2.5. Karmienie
W czasie aklimatyzacji i badania, ryby są karmione według odpowiedniej diety, o znanej całkowitej zawartości lipidów i białek, w ilości wystarczającej do utrzymania ich w stanie zdrowym i do zachowania ich masy ciała. Ryby są karmione w czasie aklimatyzacji i badania ilością pokarmu, na poziomie w przybliżeniu 1–2 % masy ich ciała dziennie; utrzymuje to stężenie lipidów u większości gatunków na w miarę stałym poziomie w czasie badania. Ilość pokarmu powinna być ponownie obliczana, na przykład raz na tydzień, w celu utrzymania stałej masy ciała i zawartości lipidów. W odniesieniu do tego obliczenia masa ciała ryb w każdej komorze badawczej może być oszacowana na postawie masy ciała ryb pobranych jako próbkę w tej komorze ostatnio. Nie ważyć ryb pozostających w komorze.
Pokarm, który nie został spożyty, oraz ekskrementy są wypłukiwane z komór badawczych wkrótce po karmieniu (od 30 minut do 1 godziny). Komory są utrzymane w miarę możliwości w czystości przez okres trwania badania tak, aby stężenie substancji organicznej utrzymane było na możliwie jak najniższym poziomie, ze względu na to, że obecność węgla organicznego może ograniczyć biodostepność substancji badanej (1).
Ze względu na to, że wiele pokarmów jest uzyskiwanych z mączki rybnej, pokarm powinien być analizowany na obecność substancji badanej. Pożądane jest także analizowanie pokarmu na obecność pestycydów i metali ciężkich.
1.8.2.6. Światło i temperatura
Fotookres trwa zwykle 12–16 godzin, a temperatura (± 2 oC) powinna być odpowiednia dla gatunków badanych (zob. załącznik 2). Powinien być znany rodzaj oraz właściwości oświetlenia. Należy również zwrócić uwagę na możliwe fototransformacje substancji badanej w warunkach napromieniowania. Unikając narażenia ryb na działanie nienaturalnych fotoproduktów, należy wykorzystywać odpowiednie oświetlenie. W niektórych przypadkach odpowiednie może być wykorzystanie filtru w celu odfiltrowania promieniowania UV poniżej 290 nm.
1.8.2.7. Stężenia badania
Ryby są narażone na działanie przynajmniej dwóch stężeń substancji badanej w wodzie w warunkach przepływu. Zazwyczaj wybiera się wyższe (lub najwyższe) stężenie substancji badanej, aby wynosiło około 1 % jego ostrej, asymptotycznej LC50, oraz aby było przynajmniej dziesięciokrotnie wyższe od jej limitu wykrywalności w wodzie przez wykorzystywaną metodę analityczną.
Najwyższe stężenie badania można również oznaczyć przez podzielenie ostrej 96h LC50 przez odpowiedni ostry/chroniczny wskaźnik (odpowiednie wskaźniki dla niektórych substancji chemicznych wynoszą 3–100). Jeśli jest to możliwe, wybrać inne stężenie (stężenia), tak aby różniło się ono od podanego wyżej współczynnika o 10. Jeśli nie jest to możliwe ze względu na kryterium 1 % z LC50 oraz na limit analityczny, można użyć czynnika niższego od 10 albo też wziąć pod uwagę zastosowanie oznakowanej substancji badanej 14C. Żadne wykorzystane stężenie nie powinno przekraczać poziomu rozpuszczalności substancji badanej.
W przypadku gdy wykorzystuje się czynnik rozpuszczający, jego stężenie nie powinno być wyższe niż 0,1 ml/l i powinno być takie samo we wszystkich naczyniach badawczych. Wpływ stężenia, wraz z substancją badaną, na całkowitą zawartość węgla organicznego w wodzie badanej powinien być znany. Jednakże powinny zostać podjęte wszelkie wysiłki, w celu uniknięcia wykorzystania takich materiałów.
1.8.2.8. Kontrole
Powinna zostać przeprowadzona jedna kontrola wody do rozcieńczania lub, jeżeli jest to stosowne, jedna kontrola obejmującą czynnik rozpuszczający powinna zostać przeprowadzona oprócz badania, pod warunkiem że ustalono, iż czynnik nie wywiera wpływu na ryby. Jeśli nie ustalono tego, powinny zostać zorganizowane obie kontrole.
1.8.3. Częstotliwość pomiarów jakości wody
W trakcie badania powinny zostać przeprowadzone pomiary rozpuszczonego tlenu, TOC, pH oraz temperatury we wszystkich zbiornikach. Całkowita twardość i zasolenie, jeśli jest to odpowiednie, powinno zostać zmierzone w czasie kontroli, natomiast jeden ze zbiorników powinien zostać zbadany przy wyższym (lub najwyższym) stężeniu. Jako minimum poziom rozpuszczonego tlenu oraz zasolenie, jeśli jest to odpowiednie powinno zostać zmierzone trzykrotnie: na początku, w połowie i pod koniec fazy absorpcji oraz raz w tygodniu w czasie fazy oczyszczania. TOC powinno zostać zmierzone na początku badania (24 godziny i 48 godzin przed rozpoczęciem fazy absorpcji), przed wpuszczeniem ryb oraz przynajmniej raz w tygodniu w czasie fazy absorpcji i oczyszczania. Temperatura powinna być mierzona codziennie, pH na początku i na końcu każdego okresu, a twardość – raz w ciągu trwania badania. Zaleca się ciągłe monitorowanie temperatury, przynajmniej jednym pojemniku.
1.8.4. Pobieranie próbek oraz analiza ryb i wody
1.8.4.1. Plan pobierania próbek ryb i wody
Próbka wody z komór badawczych do oznaczania stężenia substancji badanej, pobierana jest przed wpuszczeniem ryb, oraz w trakcie zarówno fazy absorpcji, jak i oczyszczania. Próbki wody pobierane są przed karmieniem i w tym samym czasie, co próbki ryb. W trakcie fazy absorpcji oznaczane są stężenia substancji badanych, w celu sprawdzenia ich zgodności z kryteriami ważności.
Próbki ryb są pobierane przynajmniej pięć razy podczas fazy absorpcji oraz przynajmniej cztery razy podczas fazy oczyszczania. Ze względu na to, że czasami trudno będzie obliczyć dokładne oszacowanie wartości BCF w oparciu o tą ilość próbek, zwłaszcza jeśli wskazane są inne typy kinetyki niż prosta kinetyka pierwszego rzędu, wskazane może być pobieranie próbek podczas obu faz z większą częstotliwością (zob. załącznik 4). Dodatkowe próbki są składowane i analizowane jedynie wówczas gdy wyniki badań próbek pochodzących z pierwszej serii nie są wystarczające do obliczenia wartości czynnika BCF z pożądaną dokładnością.
Przykład dopuszczalnego planu pobierania próbek podany jest w załączniku 4. Inne harmonogramy można łatwo obliczyć, wykorzystując inne przyjęte wartości Pow dla określenia czasu narażenia na działanie czynników dla 9 5 % absorpcji.
Pobieranie próbek kontynuuje się podczas fazy absorpcji do momentu, kiedy osiągnięty zostanie stan ustalony lub przez 28 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Jeśli nie osiągnięto stanu ustalonego przed w okresie 28 dni, pobieranie próbek jest kontynuowane do czasu aż osiągnięty zostanie stan ustalony lub przez 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Przed rozpoczęciem fazy oczyszczania ryby przenoszone są do czystych zbiorników.
1.8.4.2. Pobieranie i przygotowywanie próbek
Próbki wody do analizy uzyskiwane na przykład przez ich wypłukiwanie z centralnego punktu komory badawczej. Ze względu na to, że zarówno filtracja, jak i odwirowywanie nie zawsze powoduje oddzielenie się czynnika bioniedostępnego z pierwszej substancji od czynnika biodostępnego (zwłaszcza w substancjach superlipofilowych, tzn. w tych substancjach, które mają log Pow > 5) (1)(5), próbki mogą nie być poddawane takim obróbkom.
Zamiast tego pomiary powinny być pobierane w celu utrzymania zbiorników w czystości oraz zawartość całkowita węgla organicznego powinna być monitorowana zarówno podczas fazy absorpcji, jak i oczyszczania.
Odpowiednia ilość ryb (zwykle co najmniej cztery) jest usuwana z komór badawczych podczas każdorazowego pobierania próbek. Ryby pobrane w próbkach są szybko opłukiwane wodą, plamione „na sucho”, zabijane, wykorzystując odpowiedni i humanitarny sposób, a następnie ważone.
Preferowane jest analizowanie ryby i wody natychmiast po pobraniu próbek, w celu zapobieżenia degradacji lub innym stratom oraz w celu obliczenia średnich wskaźników absorpcji i oczyszczania w trakcie postępowania badania. Natychmiastowa analiza unika również opóźnień w określaniu, kiedy plateau zostało osiągnięte.
W przypadku niepowodzenia przeprowadzenia natychmiastowej analizy, próbki są składowane, wykorzystując odpowiednią metodę. Przed rozpoczęciem badania uzyskiwane są informacje dotyczące właściwej metody składowania w odniesieniu do poszczególnych substancji badanych – np. głębokiego zamrażania, przetrzymywania w temperaturze 4 oC, czasu trwania składowania, ekstrakcji itp.
1.8.4.3. Jakość metody analitycznej
Ze względu na to, że cała procedura uzależniona jest zasadniczo od dokładności, precyzji i czułości metody analitycznej wykorzystywanej w odniesieniu do substancji badanej, sprawdzić doświadczalnie, iż precyzja oraz powtarzalność analizy chemicznej, jak również odzyskiwanie substancji badanej zarówno z wody, jak i są wystarczające dla danej metody. Sprawdzić również, że substancja badana nie jest wykrywalna wykorzystanej wodzie do rozcieńczania.
W miarę potrzeb wartości Cw i Cf, uzyskane z badania, są korygowane w odniesieniu do wartości tłowych uzyskanych w czasie kontroli. Z próbkami ryb i wody postępuje się w międzyczasie w taki sposób, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub straty (np. wynikające z adsorpcji przez urządzenia do pobierania próbek).
1.8.4.4. Analiza próbek ryb
Jeśli w badaniu wykorzystywane są substancje oznakowane radiologicznie, możliwe jest przeprowadzenie analizy w odniesieniu do całkowitego oznaczenia radiologicznego (np. macierzyste i metabolity) lub można oczyścić próbki, tak aby związek macierzysty mógł zostać poddany analizie oddzielnie. Główne metabolity mogą zostać również określone w stanie ustalonym lub pod koniec fazy pobierania, w zależności od tego, która z tych faz nastąpi szybciej. Jeśli czynnik BCF jest > 1 000 % w kategoriach całkowitych pozostałości substancji oznakowanej radiologicznie, wskazane może być, a w odniesieniu do niektórych kategorii chemikaliów, takich jak pestycydy, stanowczo zalecane zidentyfikowanie i obliczenie ilości degradatów stanowiących > 10 % całkowitej ilości pozostałości substancji w tkankach ryb w stanie ustalonym. Jeśli degradaty stanowiące > 10 % całkowitych pozostałości substancji o oznaczeniu radiologicznym w tkankach ryb są zidentyfikowane i obliczone, zaleca się również identyfikację i podanie ilości degradatów w wodzie badanej.
Stężenie substancji badanej powinno zazwyczaj być oznaczane dla każdej indywidualnie ważonej ryby. Jeśli nie jest to możliwe, można zebrać wszystkie próbki w jednym zbiorniku podczas każdego pobierania próbek, ale nie ogranicza to procedur statystycznych, które mogą mieć zastosowanie do danych. Jeżeli szczególne procedury statystyczne oraz moc statystyczna są ważnymi względami, odpowiednia liczba ryb w celu przystosowania odpowiedniej procedury zgromadzenia próbek w jednym zbiorniku powinna zostać objęta badaniem (6)(7).
BCF powinno być wyrażone zarówno jako funkcja całkowitej masy mokrej, jak i, w odniesieniu do substancji wysokolipofilowych, jako funkcja zawartości lipidów. Zawartość lipidów ryb określa się podczas każdorazowego pobierania próbek, jeśli jest to możliwe. Odpowiednie metody powinny zostać wykorzystane w celu oznaczenia zawartości lipidów (odniesienia 8 i 2 w załączniku 3). Metoda ekstrakcji chloroform/metanol może być zalecana jako metoda standardowa (9). Różne metody nie dają identycznych wartości (10), zatem ważne jest podanie szczegółów dotyczących wykorzystanej metody. Jeśli jest to możliwe, analiza dla lipidów często powinna być przeprowadzona na tym samym ekstrakcie, który wytworzony został dla potrzeb analizy na obecność substancji badanej, ze względu na to, że lipidy często muszą zostać usunięte z ekstraktu zanim zostanie on poddany analizie chromatograficznie. Zawartość lipidów w rybie (podana w mg/kg mokrej masy) pod koniec doświadczenia nie powinna różnić się od tej z początku doświadczenia o więcej niż ± 25 %. Procent zawartości ciał stałych w tkance powinien zostać także odnotowany, w celu umożliwienia przekształcenia stężenia lipidów z bazy mokrej w bazę stałą.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Krzywa absorpcji badanej substancji uzyskiwana jest przez wykreślenie jej stężenia w/na rybie (lub w określonych tkankach) w fazie absorpcji, w danym czasie, w skali arytmetycznej. Jeśli krzywa osiągnęła plateau, to znaczy, że stała się w przybliżeniu asymptotyczna do osi czasu, stan ustalony BCFSS obliczany jest w następujący sposób:
W przypadku gdy nie został osiągnięty stan ustalony, może istnieć możliwość obliczenia BCFSS o wystarczającej precyzji dla oceny zagrożenia na podstawie „stanu ustalonego” przy 80 % (1,6/k2) lub 95 % (3,0/k2) równowagi.
Również czynnik stężenia (BCFK) jest oznaczany jako stosunek k1/k2, dwóch stałych kinetycznych pierwszego rzędu. Stała szybkość oczyszczania (k2) jest zwykle określana na podstawie krzywej oczyszczania (tzn. na podstawie wykresu spadku stężenia badanej substancji w rybie wraz z upływem czasu). Stała szybkość absorpcji (k1) wyliczana jest wówczas na podstawie k2 oraz wartości Cf, którą uzyskuje się z krzywej absorpcji (zob. także załącznik 5). Preferowaną metodą uzyskiwania BCFK oraz stałych wskaźników, k1 i k2, jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze (11). W przeciwnym razie dla obliczenia k1 i k2 można korzystać z metod graficznych. Jeśli krzywa oczyszczenia w wyraźny sposób nie może być uznana za krzywą procesu pierwszego rzędu, wówczas powinny zostać zastosowane modele bardziej złożone (zob. odniesienia w załączniku 3) i powinno się zasięgnąć rady u biostatystyka.
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Wyniki powinny być interpretowane uważnie w przypadku, gdy mierzone stężenia badanych roztworów występują na poziomach zbliżonych do granicy wykrywalności metody analitycznej.
Jasno określone krzywe absorpcji i ubytku wskazują dobrej jakości dane o biostężeniu. Rozbieżność w stałych absorpcji/oczyszczenia między dwoma badanymi stężeniami powinna być niższa niż 20 %. Powinny zostać odnotowane zaobserwowane różnice dotyczące szybkości absorpcji/oczyszczenia między dwoma zastosowanymi badanymi stężeniami, podając możliwe wyjaśnienia. Ogólnie granica ufności BCFs, na podstawie dobrze zaprojektowanego podejścia badawczego, wynosi ± 20 %.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
3.1. BADANA SUBSTANCJA:
— własności fizyczne oraz, gdy jest to istotne, właściwości fizyczno-chemiczne,
— dane dotyczące identyfikacji chemicznej (łącznie z zawartością węgla organicznego, w odpowiednich przypadkach),
— w przypadku oznakowania radiologicznego, dokładne położenie znaczonego atomu (znaczonych atomów) oraz zawartość procentową radioaktywności, związanej z nieczystościami.
3.2. BADANE GATUNKI
— nazwa naukowa, gatunek, źródło, jakakolwiek obróbka wstępna, aklimatyzacja, wiek, zakres rozmiarów itp.
3.3. WARUNKI PRZEPROWADZANIA BADANIA:
— wykorzystana procedura badawcza (np. przepływowa lub półstatyczna),
— rodzaj i właściwości zastosowanego oświetlenia i fotookresów,
— projekt badania (np. numer i rozmiar komór badawczych, szybkość wymiany objętości wody, liczba powtórzeń, liczba ryb przypadających na powtórzenie, liczba stężeń badania, długość faz absorpcji i oczyszczenia, częstotliwość pobierania próbek ryb i wody),
— metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość ich odnawiania, (jeśli został użyty, należy podać czynnik rozpuszczający, jego stężenie oraz jego udział w zawartości węgla organicznego wody używanej do przeprowadzenia badań),
— nominalne stężenia badania, średnia mierzonych wartości oraz ich standardowe odchylenia, odnoszące się do naczyń używanych w badaniach, oraz metoda, za pomocą której zostały one uzyskane,
— źródło wody do rozcieńczania, opis jakiejkolwiek obróbki wstępnej, wyniki przeprowadzenia dowodu na zdolność ryb do życia w wodzie oraz właściwości wody: pH, twardość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziomy pozostałościowego chloru (jeśli dokonano pomiaru), węgiel organiczny ogółem, zawiesina, stopień zasolenia środowiska zastosowanego w badaniach (jeśli występuje taka potrzeba) oraz inne wykonane pomiary,
— jakość wody w naczyniach wykorzystane w badaniach, pH, twardość, węgiel organiczny ogółem (TOC), temperatura oraz stężenie rozpuszczonego tlenu,
— szczegółowe informacje w sprawie karmienia (np. rodzaj karmy, jej źródło, skład – przynajmniej, jeśli to możliwe, zawartość lipidów i białka, ilość podanej karmy i częstotliwość karmienia),
— informacje w sprawie postępowania z próbkami ryb i wody, łącznie ze szczegółami dotyczącymi przygotowania, składowania, ekstrakcji i procedur analitycznych (oraz dokładność) w odniesieniu do badanej substancji i zawartości lipidów (jeśli zmierzono).
3.4. WYNIKI:
— wyniki z wszelkich przeprowadzonych badań wstępnych,
— śmiertelność ryb kontrolowanych oraz ryb w każdej z komór narażonych na działanie substancji oraz wszelkie inne zaobserwowane nieprawidłowe zachowania,
— zawartość lipidów ryb (jeśli oznaczono w momencie przeprowadzania badania),
— krzywe (łącznie z wszystkimi zmierzonymi danymi) przedstawiające absorpcję i oczyszczenie badanej substancji chemicznej w rybie, czas poprzedzający stan ustalony,
— Cf i Cw (razem z odchyleniami standardowymi i zakresem, jeśli jest to stosowne) dla wszystkich czasów pbierania próbek (Cf wyrażone w μg/g mokrej masy (ppm)) całego organizmu lub określonych tkanek, np. lipidy, i Cw w μg/ml (ppm). Wartości Cw dla serii kontrolnych (należy również zgłosić tło),
— czynnik biostężenia w stanie ustalonym (BCFSS) i/lub czynnik stężenia kinetycznego (BCFK) oraz, w stosownych przypadkach, 95 % granicy ufności dla stałej szybkości absorpcji i oczyszczenia (ubytku), wyrażone w odniesieniu do całego organizmu i całkowitej zawartości lipidów jeśli dokonano pomiaru, zwierzęcia lub jego poszczególnych tkanek, granice ufności i odchylenie standardowe, jeśli są dostępne, oraz metody analizy obliczeń/danych dla każdego stężenia wykorzystanej substancji badanej,
— w przypadku gdy wykorzystano substancje oznakowane radiologicznie oraz, jeśli jest wymagane, nagromadzenie jakichkolwiek wykrytych metabolitów może zostać przedstawione,
— wszystko, co odbiega od normy, jeśli chodzi o badanie, wszelkie odchylenia od tych procedur oraz wszelkie inne ważne informacje;
zminimalizować ilość wyników jako „niewykrytych w granicy wykrywalności” w drodze opracowywania metod stosowanych przed badaniem i za pomocą projektu doświadczalnego, ponieważ wyniki takie nie mogą być użyte do obliczenia stałej szybkości reakcji.
4. BIBLOGRAFIA
(1) Connell D.W. (1988). Bio accumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156.
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on noctanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29–390.
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derivedfrom OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bio availability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852. Julyl975.
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Emronmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Rozdział 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.
(10) Randall R. C, Lee H, Ozretich R.J, Lake J. L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bio accumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431–1436.
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report Marzecl 987. Autorzy: P. Kristensen i N. Nyholm.
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
Tekst urzędowy w EUR-Lex. Lexeva pokazuje treść przepisu, nie udziela porad prawnych. Moc prawną ma wyłącznie tekst opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.