Załącznik

ROZWAŻANIA OGÓLNE

Zarówno w dobrze pojętym interesie nauki, jak i dobrostanu zwierząt, istotne jest uniknięcie niepotrzebnego wykorzystywania zwierząt oraz minimalizacja badań, które mogą powodować silne reakcje u zwierząt. Wszystkie informacje na temat danej substancji ważne z punktu widzenia jej potencjalnego działania podrażniającego/korozyjnego na skórę powinny zostać poddane ocenie przed podjęciem badań in vivo. Wystarczające dowody, pozwalające na sklasyfikowanie substancji badanej jako potencjalnie korozyjnej lub żrącej, mogą być dostępne na dzień dzisiejszy, skutkiem czego zbyteczne będzie przeprowadzanie badań na zwierzętach laboratoryjnych. Dlatego wykorzystanie analizy wagi dowodów pochodzących z istniejących danych oraz strategii badań sekwencyjnych zminimalizuje potrzebę badań in vivo, zwłaszcza jeżeli substancja może powodować silne reakcje.

Zalecane jest wykorzystanie analizy wagi dowodów celem oceny istniejących informacji dotyczących podrażnienia i korozji skóry przez substancje, a także celem stwierdzenia, czy należy przeprowadzić dodatkowe badania, inne niż badania skóry in vivo, celem scharakteryzowania takiego potencjalnego działania substancji. Jeżeli niezbędne są dalsze badania, zaleca się realizowanie strategii badań sekwencyjnych celem uzyskania odpowiednich danych doświadczalnych. W odniesieniu do substancji, które nie posiadają historii badań, strategia badań sekwencyjnych powinna zostać zastosowana w celu uzyskania kompletu danych potrzebnych do oceny potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego danej substancji na skórę. Strategia badań opisana w niniejszym załączniku została opracowana w trakcie warsztatów OECD (1), a następnie potwierdzona i rozszerzona w ramach Zharmonizowanego Zintegrowanego Systemu klasyfikacji substancji chemicznych zagrażających zdrowiu ludzkiemu i środowisku, zatwierdzonym w wyniku prac w ramach 28. Wspólnego spotkania Komitetu ds. Związków Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Związków Chemicznych w listopadzie 1998 roku (2).

Pomimo że strategia badań sekwencyjnych nie jest integralną częścią metody badawczej B.4, utożsamia ona zalecane podejście do określania cech korozji/podrażnienia skóry. Wspomniane podejście reprezentuje zarówno najlepszą praktykę, jak i wzorzec etyczny dla badań in vivo podrażnień/korozji skóry. Omawiana metoda badawcza stanowi wytyczne dotyczące prowadzenia badań in vivo i streszcza czynniki, jakim należy poświęcić uwagę przed rozpoczęciem takich badań. Strategia określa podejście do oceny istniejących danych na temat właściwości podrażniających/korozyjnych substancji badanej na skórę oraz podejście warstwowe do generowania odpowiednich danych dotyczących substancji wymagających dodatkowych badań lub takich, w odniesieniu do których nie przeprowadzono jak dotąd badań. W ramach strategii zalecane jest ponadto przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo korozji/podrażnienia skóry w określonych okolicznościach.

OPIS STRATEGII OCENY I BADAŃ

Przed podjęciem badań w ramach strategii badań sekwencyjnych (rysunek) należy poddać ocenie wszystkie dostępne informacje w celu określenia potrzeby prowadzenia badań in vivo na skórze. Chociaż istotne informacje mogą zostać uzyskane na podstawie oceny pojedynczych parametrów (np. wartości skrajnych pH), należy wziąć pod uwagę ogół istniejących informacji. Należy poddać ocenie wszystkie dane dotyczące skutków działania danej substancji lub substancji analogicznych, w podejmowaniu decyzji dotyczącej wagi dowodów, oraz należy przedstawić racjonalne uzasadnienie powziętej decyzji. Główny nacisk należy położyć na istniejące dane na temat działania substancji na ludzi oraz zwierzęta, a w następnej kolejności na wyniki badań in vivo lub ex vivo. O ile to możliwe, należy uniknąć badań in vivo substancji powodujących korozję. Czynniki uwzględniane w omawianej strategii badań obejmują:

Ocenę istniejących danych na temat działania substancji na ludzi i zwierzęta (etap 1). W pierwszej kolejności należy wziąć pod uwagę istniejące dane dotyczące działania na ludzi, np. badania kliniczne lub dane na temat stanowisk pracy, a także studia konkretnych przypadków oraz/lub dane pochodzące z badań przeprowadzonych na zwierzętach, np. pojedyncze lub wielokrotne badania ekspozycji na substancje toksyczne, ponieważ dostarczają informacji bezpośrednio związanych z oddziaływaniem na skórę. Substancje o znanym działaniu podrażniającym lub korozyjnym, a także substancje wyraźnie niewywierające skutków korozyjnych lub podrażniających nie muszą być badane in vivo.

Analiza zależności aktywności i struktury (SAR) (etap 2). Należy uwzględnić wyniki badań substancji pokrewnych pod względem budowy, o ile są one dostępne. W przypadku dostępności wystarczających danych na temat oddziałania na ludzi i/lub zwierzęta substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, wskazujących na ich potencjalne działanie korozyjne/podrażniające na skórę, można domniemywać, że substancja badana poddawana ocenie spowoduje taką samą reakcję. W takich przypadkach substancja ta nie musi być poddawana badaniu. Negatywne wyniki z badań na temat substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji nie są wystarczającym dowodem na brak działań podrażniających lub korozyjnych danej substancji w świetle strategii badań sekwencyjnych. Zweryfikowane i zaakceptowane podejście SAR powinno zostać wykorzystane w celu zidentyfikowania potencjalnego oddziałania korozyjnego i podrażniającego na skórę.

Właściwości fizyko-chemiczne i reaktywność chemiczna (etap 3). Substancje charakteryzujące się skrajnym pH ≥ 2,0 i ≤ 11,5 mogą mieć silne działanie miejscowe. Jeżeli takie skrajne pH jest podstawą do identyfikacji substancji jako korozyjnej dla skóry, możliwe jest wykorzystanie jej rezerwy kwasowej/alkalicznej (tj. zdolności buforowej) (3)(4). Jeżeli zdolność buforowa wskazuje na to, że substancja może nie być korozyjna dla skóry, należy przeprowadzić dalsze badania w celu potwierdzenia tej cechy, najlepiej przy użyciu zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (zob. etapy 5 i 6).

Toksyczność skórna (etap 4). Jeżeli dana substancja chemiczna okazała się być bardzo toksyczna na skórę, badanie in vivo podrażnień/korozji skórnej może okazać się niemożliwe do przeprowadzenia, ponieważ ilość substancji badanej normalnie podawanej mogłaby przekroczyć bardzo toksyczną dawkę, co w konsekwencji powodowałoby śmierć lub silne cierpienie zwierząt. Dodatkowo, jeżeli badania toksyczności skórnej na białych królikach już zostały przeprowadzone do poziomu dawki granicznej 2 000 mg/kg masy ciała lub wyższego, i nie zaobserwowano skutków korozyjnych lub podrażniających, dodatkowe badania podrażnienia/korozji skóry mogą okazać się niepotrzebne. Należy uwzględnić wiele czynników w trakcie oceny ostrej toksyczności skórnej w przeprowadzonych uprzednio badaniach. Na przykład przedstawione informacje na temat zmian skóry mogą być niekompletne. Badania i obserwacje mogły być przeprowadzone na innych niż króliki gatunkach, które mogą wykazywać znaczące różnice w zakresie wrażliwości reakcji. Także postać substancji badanej zaaplikowanej zwierzętom mogła być nieodpowiednia do oceny działania korozyjnego/podrażniającego na skórę (np. poziom rozcieńczenia substancji do badań toksyczności skórnej (5)). Jednakże w przypadku właściwie zaprojektowanych i przeprowadzonych badań toksyczności u królików wyniki negatywne mogą stanowić wystarczające dowody na to, że dana substancja nie jest korozyjna lub podrażniająca.

Wyniki badań in vitro lub ex vivo (etap 5 i 6). Substancje, które wykazują właściwości korozyjne lub silnie podrażniające w zweryfikowanych i zaakceptowanych badaniach in vitro lub ex vivo (6)(7), przewidziane do oceny tych specyficznych skutków, nie muszą być badane na zwierzętach. Można przyjąć, że substancje te dadzą podobne wyniki in vivo.

Badania in vivo na królikach (etap 7 i 8). W przypadku podjęcia, na podstawie analizy wagi dowodów, decyzji dotyczącej przeprowadzenia badań in vivo, badanie takie powinno rozpocząć się badaniem wstępnym na jednym zwierzęciu. Jeżeli wyniki tego badania wskazują, że substancja ma działanie korozyjne na skórę, dalsze badania powinny zostać wstrzymane. W przypadku niestwierdzenia działania korozyjnego w badaniu wstępnym reakcja podrażniająca lub negatywna powinna zostać potwierdzona przy użyciu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt poddanych ekspozycji przez czas czterech godzin. W przypadku wystąpienia podrażnienia we wstępnym badaniu należy przeprowadzić sekwencyjne badanie potwierdzające lub jednoczesną ekspozycję obydwu zwierząt.

BIBLIOGRAFIA

(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test method. Held on Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www 1 .oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19–26.

(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Method for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 56032-356-6, Chapter 31,411–436.

(6) Testing Method B.40.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.

RYSUNEK STRATEGIA BADAŃ I OCENY PODRAŻNIEŃ/KOROZJI SKÓRY

B.5. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA: PODRAŻNIENIE/KOROZJA OCZU

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 405 (2002).

1.1. WPROWADZENIE

W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia oka wywołane przez daną substancję zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych (1). Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (2)(3). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo zalecane jest przeprowadzenie badań in vivo podrażnień/korozji skóry w celu oszacowania korozji oka przed przystąpieniem do badań in vivo oka.

Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach oraz/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (4)(5) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (6)(6a). Takie badania mogą być przeprowadzone przed lub w następstwie analizy wagi dowodów.

W przypadku pewnych substancji takie analizy mogą wskazywać na potrzebę badań in vivo potencjalnego korozyjnego/drażniącego działania danej substancji na oko. W każdym takim przypadku przed podjęciem badań in vivo oka zostaną przeprowadzone najpierw badania in vivo skutków działania substancji na skórę, zgodnie z metodą badawczą B.4 (7). Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii badań sekwencyjnych powinno ograniczyć potrzebę prowadzenia badań in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań. Jeżeli nie jest możliwe określenie potencjalnego działania korozyjnego lub drażniącego na oka przy zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych, nawet po przeprowadzeniu badań in vivo pod kątem korozji i podrażnienia skóry, można przeprowadzić badania in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka.

Załącznik do niniejszej metody zawiera preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (8), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu klasyfikacji związków chemicznych (GHS) (9). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu wartościowych z naukowego punktu widzenia danych dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego wymaga uzasadnienia.

1.2. DEFINICJE

Podrażnienie oka: zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu.

Korozja oka: uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne uszkodzenie wzroku, spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ

Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na jedno oko zwierzęcia doświadczalnego, drugie oko jest wykorzystywane do badania kontrolnego. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany poprzez ocenę punktową zmian spojówki, rogówki oraz tęczówki w określonych odstępach. Inne zmiany w oku i niekorzystne skutki ogólnoustrojowe są również opisywane w celu uzyskania kompletnej oceny skutków. Długość trwania badania powinien być odpowiedni do oszacowania odwracalności lub nieodwracalności obserwowanych skutków.

Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badania powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Kryteria dotyczące podjęcia decyzji o uśmierceniu w sposób humanitarny zwierząt w stanie agonalnym i silnie cierpiących zawiera załącznik (10).

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.1. Przygotowanie do badań in vivo

1.4.1.1. Wybór gatunków zwierząt

Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierząt

Obydwoje oczu zwierzęcia doświadczalnego wstępnie wybranego do badania powinny być zbadane na 24 godziny przed przystąpieniem do badań. Zwierzęta z objawami podrażnienia oczu, wad wzroku lub uszkodzeń rogówki nie powinny być wykorzystywane w badaniu.

1.4.1.3. Warunki przetrzymywani i karmienia

Zwierzęta powinny być przetrzymywane oddzielnie. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 oC (± 3 oC) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

1.4.2. Procedura badań

1.4.2.1. Podawanie substancji

Substancja badana powinna zostać umieszczona na spojówce jednego oka każdego ze zwierząt po delikatnym odsunięciu powieki z gałki ocznej. Powieki są następnie delikatnie zamykane na około jedną sekundę w celu zapobieżenia utraty materiału badanego. Drugie, nienaruszone oko jest przedmiotem badania kontrolnego.

1.4.2.2. Nawilżanie

Oczy zwierząt badanych nie powinny być przepłukiwane przez przynajmniej 24 godziny po wkropleniu substancji badanej, z wyjątkiem badania ciał stałych (zob. sekcja 1.4.2.3.2) i przypadków natychmiastowego działania korozyjnego lub podrażniającego. O ile to stosowne, po 24 godzinach można przepłukać oczy.

Włączanie dodatkowej satelickiej grupy zwierząt w celu zbadania skutków przepłukiwania nie jest zalecane, chyba że ma to uzasadnienie naukowe. W przypadku potrzeby grupy satelickiej należy użyć dwóch królików. Warunki przepłukiwania powinny być dokładnie dokumentowane np. czas przepłukiwania, skład i temperatura roztworu, długość trwania, objętość i szybkość aplikowania.

1.4.2.3. Poziom dawki

1.4.2.3.1. Badanie cieczy

W badaniu cieczy stosuje się dawkę o objętości 0,1 ml. Nie powinno się stosować cieczy pod ciśnieniem do aplikowania substancji bezpośrednio na oko. Struga cieczy powinna zostać rozprężona i zebrana w zbiorniku przed aplikowaniem jej 0,1 ml na oko.

1.4.2.3.2. Badanie substancji stałych

W badaniu ciał stałych, past i cząstek stałych stosowana ilość powinna mieć objętość 0,1 ml lub wagę nie większą niż 100 mg. Badany materiał powinien zostać sproszkowany. Objętość ciała stałego powinna być mierzona po delikatnym zbiciu np. poprzez ostukanie pojemnika pomiarowego. Jeżeli substancja badana w formie ciała stałego nie została usunięta w wyniku działania mechanizmów fizjologicznych w pierwszym punkcie czasowym obserwacji po upłynięciu godziny, oko może zostać przepłukane roztworem soli fizjologicznej lub wodą destylowaną.

1.4.2.3.3. Badanie aerozoli

Zaleca się, aby wszystkie strugi cieczy pod ciśnieniem i aerozole zostały rozprężone i zebrane przed osadzeniem na oku. Wyjątek stanowią substancje w aerozolach znajdujące się w pojemnikach pod ciśnieniem, które nie mogą zostać zebrane z powodu ich parowania. W takich przypadkach należy przytrzymać oko w pozycji otwartej i zaaplikować substancję badaną do oka jednym podmuchem, trwającym około sekundy, z odległości 10 cm prostopadle do oka. Ta odległość może zależeć w znacznym stopniu od ciśnienia w rozpylaczu i jego zawartości. Należy uważać, aby nie doszło do uszkodzenia oka z powodu ciśnienia w rozpylaczu. W odpowiednich przypadkach, może być niezbędna ocena możliwości potencjalnego „mechanicznego” uszkodzenia oka spowodowanego siłą rozpylacza.

Oszacowanie dawki aerozolu może być wykonane poprzez następującą symulację badania: substancja jest napylana na papierek wagowy przez otwór o rozmiarze oka królika znajdujący się bezpośrednio przed papierkiem. Poziom wzrostu wagi papierka wykorzystuje się celem określenia przybliżonej ilości jaka byłaby zaaplikowana do oka. Dla substancji lotnych, dawka może zostać oszacowana poprzez zważenie pojemnika odbiorczego przed i po badanego materiału.

1.4.2.4. Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji oka z wykorzystaniem jednego zwierzęcia)

Zgodnie ze strategią badań sekwencyjnych (zob. załącznik 1) stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia

Jeżeli wyniki takich badań wskazują, że substancja ma właściwości korozyjne lub powoduje silne podrażnienia oka, procedura przewiduje zaprzestanie dalszych badań podrażnień oczu.

1.4.2.5. Znieczulenie miejscowe

Znieczulenie miejscowe może zostać zastosowane na podstawie analizy wyników uzyskanych w indywidualnych przypadkach. Jeżeli analiza wagi dowodów wskazuje na to, że substancja może potencjalnie powodować ból, lub badania wstępne pozwalają sądzić, że pojawią się bolesne reakcje, można zastosować miejscowe znieczulenie przed zaaplikowaniem substancji badanej. Rodzaj, stężenie i dawka znieczulenia miejscowego powinny zostać uważnie wybrane, tak aby zapewnić, że różnice w reakcji na substancję badaną nie są wynikiem zastosowania znieczulenia. Oko kontrolne powinno również zostać znieczulone.

1.4.2.6. Badanie potwierdzające (Badanie in vivo podrażnienia oka na dodatkowych zwierzętach)

W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniu wstępnym działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Jeżeli obserwuje się silne działanie podrażniające w badaniu wstępnym, zaleca się, aby badanie potwierdzające zostało przeprowadzone w sposób sekwencyjny na jednym zwierzęciu, a niejednocześnie na dwóch zwierzętach. Jeżeli działanie na drugim zwierzęciu okaże się korozyjne lub silnie podrażniające, badanie nie będzie kontynuowane. Dodatkowe zwierzę może być potrzebne w celu potwierdzenia słabego lub średniego działania podrażniającego.

1.4.2.7. Okres obserwacji

Długość trwania obserwacji powinien być wystarczający do oceny pełnej odwracalności obserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany w momencie, gdy zwierzę wykazuje objawy silnego bólu lub strachu (9). W celu określenia odwracalności efektów w normalnych okolicznościach zwierzę powinno być obserwowane przez 21 dni po zaaplikowaniu substancji badanej. Jeżeli odwracalność jest obserwowana przed upływem 21 dni, eksperyment powinien zostać przerwany w tym momencie.

1.4.2.7.1. Obserwacje kliniczne i ocena reakcji oka

Oczy powinny zostać zbadane po 1, 24, 48 i 72 godzinach od podania substancji badanej. Zwierzęta powinny być pod obserwacją nie dłużej niż to konieczne do uzyskania wszystkich informacji. Zwierzęta wykazujące objawy ciągłego silnego bólu lub strachu powinny zostać bezzwłocznie uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Uśmiercone w sposób humanitarny powinny zostać zwierzęta z następującymi zmianami oka zaszłymi w następstwie zaaplikowania substancji: perforacja lub owrzodzenie rogówki, włączając garbiak; krwawienie z tylnej komory oka; zmętnienie rogówki równe 4 utrzymujące się 48 godzin; brak odbicia światła (reakcja rogówki o wartości punktowej 2) utrzymujący się 72 godziny; owrzodzenie błony spojówki; martwica spojówki lub błony mrużnej; lub oddzielająca się tkanka martwicza. Wynika to z faktu, że tego typu zmiany są na ogół nieodwracalne.

Zwierzęta, u których nie wystąpiły zmiany oczne, mogą zostać uśmiercone nie wcześniej niż 3 dni od zaaplikowania substancji. Zwierzęta z łagodnymi lub umiarkowanymi zmianami powinny przebywać pod obserwacją do czasu zaniknięcia zmian lub przez 21 dni, po których badanie zostaje przerwane. Obserwacje powinny być prowadzone 7., 14. i 21. dnia w celu określenia stanu zmian oraz ich odwracalności lub nieodwracalności.

Wartości punktowe reakcji oka (spojówki, rogówki i tęczówki) powinny być zapisywane dla każdego badania (tabela I). Należy również podać informacje na temat innych zmian oka (np. przekrwienie, plamy) lub innych niekorzystnych skutków ogólnoustrojowych.

Badanie reakcji może zostać wykonane przy zastosowaniu lupy stereoskopowej, ręcznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innego odpowiedniego urządzenia. Po zapisaniu obserwacji w 24 godzinie oko może zostać poddane dalszym badaniom przy pomocy fluoresceiny.

Ocena odpowiedzi ocznej jest z konieczności subiektywna. W celu zharmonizowania oceny reakcji ocznej i w celu wsparcia laboratoriów badawczych i osób biorących udział w interpretacjach i obserwacjach należy przeprowadzić odpowiednie szkolenia w zakresie stosowanego systemu.

2. DANE

2.2. OCENA WYNIKÓW

Wartości punktowe podrażnienia skóry winny być ocenianie stosownie do natury oraz natężenia zmian, oraz w świetle ich odwracalności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowią normy bezwzględnej właściwości podrażniających danego materiału, ponieważ ocenie poddawane są również pozostałe skutki ekspozycji na badany materiał. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny być traktowane jako wartości odniesienia, które muszą być oceniane w świetle wszystkich pozostałych spostrzeżeń z badań.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:

Uzasadnienie badań in vivo: analizę wagi dowodów, włączając wyniki realizacji strategii badań sekwencyjnych:

— opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych badań,

— dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej,

— opis przeprowadzonych badań in vitro, włączając szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,

— opis przeprowadzonych badań in vitro podrażnień/korozji skóry, wraz z otrzymanymi wynikami,

— analiza wagi dowodów dla celów przeprowadzenia badań in vivo.

Substancja badana:

— identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czystość, znane zanieczyszczenia, numer osobnika),

— stan skupienia i właściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność, reakcyjność z wodą),

— w przypadku mieszaniny skład i zawartość procentowa składników,

— jeżeli zastosowano znieczulenie miejscowe, identyfikacja, czystość, rodzaj, dawka i możliwe interakcje z substancją badaną.

Nośnik:

— identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy) użyta objętość,

— uzasadnienie użycia nośnika.

Badane zwierzęta:

— wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż białe króliki,

— wiek każdego zwierzęta na początku badań,

— liczba zwierząt każdej płci w grupie badanej i kontrolnej (jeżeli występuje),

— indywidualna masa ciała na początku i na końcu badań,

— źródło zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp.

Warunki badań:

— opis zastosowanej metody wykorzystywanej do punktowej oceny podrażnienia w każdym punkcie czasowym (np. ręczna lampa szczelinowa, biomikroskop, fluoresceina),

— tabela wyników reakcji podrażnienia/korozji, dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru, do momentu wyeliminowania zwierzęcia z badań,

— narracyjny opis stopnia i natury obserwowanego podrażnienia lub korozji,

— opis jakichkolwiek innych zmian zaobserwowanych w oku (np. waskularyzacja, przekrwienie, adhezje, plamy),

— opis innych niekorzystnych miejscowych i ogólnoustrojowych niedotyczących oczu zmian oraz wyniki badania histopatologicznego, o ile są dostępne.

Omówienie wyników.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW

Transponowanie wyników badań podrażnienia oka u zwierząt laboratoryjnych na ludzi ma sens tylko w ograniczonym stopniu. W wielu przypadkach białe króliki są bardziej wrażliwe niż ludzie na podrażnienia lub korozję oka.

W interpretacji danych należy zadbać o pominięcie podrażnienia oka będącego wynikiem infekcji wtórnej.

4. BIBLIOGRAFIA

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410–429.

(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35,159–164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12,227–231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.

(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(7) Testing Method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabela I

OCENA PUNKTOWA ZMIAN OKA

Rogówka

Zmętnienie: stopień gęstości (odczyt powinien dotyczyć obszaru o największej gęstości) (*1)

Brak owrzodzenia lub zmętnienia

0

Rozrzucone lub rozmyte obszary zmętnienia (inne od lekkiego zmatowienia normalnego połysku);

1

wyraźnie widoczne szczegóły tęczówki Jasno określone obszary półprzezroczyste; lekko zaciemnione detale tęczówki

2

Obszary o kolorze perłowym; brak widocznych szczegółów tęczówki; rozmiar źrenicy trudny do określenia

3

Zmatowienie rogówka; tęczówka niewidoczna z powodu zmętnienia

4

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4

UWAGI

Tęczówka

W normie

0

Głęboko pomarszczona, zastój krwi, opuchlizna, przekrwienie okołorogówkowe; lub; tęczówka reaguje na światło (przyjmuje się, że powolna reakcja stanowi skutek)

1

Krwawienie, silne zniszczenia, lub brak reakcji na światło

2

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 2

Spojówka

Zaczerwienienie (dotyczy spojówki powieki i gałki ocznej; wyłączając rogówkę i tęczówkę)

w normie

0

Niektóre naczynia krwionośne przekrwione

1

Rozmycie, kolor karmazynowy; pojedyncze naczynia trudno widoczne

2

Rozmycie, kolor mięsa czerwonego

3

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 3

Obrzęk spojówki

Opuchlizna (dotyczy powiek i/lub błony mrużnej)

W normie

0

Niewielka opuchlizna powyżej normy

1

Widoczna opuchlizna z częściowym wynicowaniem powieki

2

Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi w połowie

3

Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi więcej niż w połowie

4

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4