Rozporządzenie Komisji (WE) nr 152/2009 z dnia 27 stycznia 2009 r. ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz

Załącznik III

W mocy

METODY ANALIZY SKŁADU MATERIAŁÓW I MIESZANEK PASZOWYCH

A. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Należy zauważyć, że w przypadku pasz zawierających substancje lotne, np. kwasy organiczne, podczas oznaczania wilgotności oznaczana jest również znaczna liczba substancji lotnych.

Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako materiały paszowe oraz mieszanek paszowych złożonych głównie z produktów mlecznych, a także badania tłuszczów i olejów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz nasion i owoców oleistych.

Oznaczanie zawartości wilgoci w nasionach oleistych należy przeprowadzać za pomocą metody przewidzianej w normie EN ISO 665 – Oznaczanie zawartości wilgoci i substancji lotnych, przy założeniu, że nasiona soi muszą być zmielone przed określeniem zawartości wilgoci.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Ubytek masy jest określany metodą wagową. Jeżeli pasze stałe mają wysoką zawartość wilgoci, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia.

3. Aparatura i sprzęt

3.1. Rozdrabniarka z materiału nieabsorbującego wilgoci, łatwa do czyszczenia, i umożliwiająca szybkie i równomierne rozdrabnianie bez wytwarzania znacznych ilości ciepła, uniemożliwiająca kontakt z powietrzem z zewnątrz, na ile jest to możliwe, i spełniająca wymagania podane w pkt 4.1.1 i 4.1.2 (np. mikrorozdrabniarki młotkowe lub chłodzone wodą, składane młynki stożkowe, rozdrabniarki powolne lub z walcami uzębionymi)

3.2. Waga analityczna ważąca z dokładnością do 1 mg

3.3. Suche pojemniki z nierdzewnego metalu lub ze szkła z przykrywkami umożliwiającymi hermetyczne zamknięcie, o powierzchni roboczej umożliwiającej równomierne rozprowadzenie badanej próbki w warstwie 0,3 g/cm2

3.4. Suszarka elektryczna termostatowana (± 2 °C), dobrze wentylowana i pozwalająca na szybką regulację temperatury (

)

3.5. Suszarka próżniowa elektrycznie ogrzewana z regulacją temperatury zaopatrzona w pompę olejową oraz mechanizm umożliwiający nawiew gorącego suchego powietrza lub wprowadzenie środka suszącego (np. tlenku wapnia).

3.6. Eksykator z płytką z grubego perforowanego metalu lub porcelany, zawierający efektywny środek suszący.

4. Sposób postępowania

Uwaga:

Czynności opisane w tej części należy wykonywać natychmiast po otworzeniu opakowania próbki. Analizę należy wykonać co najmniej dwukrotnie.

4.1.

Przygotowanie

4.1.1.

Pasze inne niż określone w pkt 4.1.2 i 4.1.3

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Jeżeli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom zawartości wilgoci (zob. pkt 6).

4.1.2.

Zboża i kasze

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez oczka sita o średnicy 0,5 mm co najmniej w 50 % i pozostają w ilości nie wyższej niż 10 % na sicie o oczkach o średnicy 1 mm.

4.1.3.

Pasze płynne lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów

Pobrać około 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość wysuszonego piasku odważonego z dokładnością do 10 mg i zmieszać do uzyskania jednorodnego produktu.

4.2.

Suszenie

Wysuszyć pojemnik (pkt 3.3) z przykrywką w suszarce ustawionej na temperaturę 103 °C przez 30 min ± 1 min. Wyjąć z suszarki i pozostawić do schłodzenia do temperatury otoczenia w eksykatorze (pkt 3.6).

4.2.1.

Pasze inne niż określone w pkt 4.2.2 i 4.2.3

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 1 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez cztery godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 103 °C. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Pasze z przeważającym (> 50 %) udziałem olejów lub tłuszczów pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego suszyć ponownie w suszarce przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 103 °C. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.2.2.

Zboża, mąki, kasze i mączki

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130 °C. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

4.2.3.

Mieszanki paszowe zawierające ponad 4 % sacharozy lub laktozy: materiały paszowe, takie jak chleb świętojański, hydrolizowane produkty zbożowe, słód jęczmienny, susz buraczany, hydrolizaty rybne i cukrowe

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki próżniowej (pkt 3.5) podgrzanej do temperatury od 80 do 85 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe.

Podwyższyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić w celu wysuszenia na cztery godziny pod działaniem tego ciśnienia, w strumieniu gorącego, suchego powietrza albo stosując środek suszący (ok. 300 g na 20 próbek). W drugim przypadku odłączyć pompę próżniową po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia. Czas suszenia liczyć od chwili, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę od 80 do 85 °C. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut o temperaturze od 80 do 85 °C i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.3.

Wstępne (częściowe) suszenie

„Mokre” pasze o ułamku masowym wynoszącym mniej niż 85 % suchej masy (np. zielonki, całkowicie wymieszane dawki (TMR), pasza (inna niż) płynna) należy przed mieleniem na drobno poddać częściowemu suszeniu w celu przeanalizowania ich stabilnych substancji; w przypadku substancji niestabilnych częściowe suszenie nie jest możliwe.

Częściowe suszenie może być przeprowadzane przy użyciu suszarki z wymuszonym obiegiem powietrza lub kuchenki mikrofalowej, lub poprzez liofilizację. Z wyjątkiem częściowego suszenia w drodze liofilizacji paszę należy suszyć przy jednoczesnym utrzymaniu temperatury próbki poniżej 60 °C, tak aby w minimalnym stopniu wpłynąć na skład chemiczny. Suszenie w temperaturach wyższych niż 60 °C powoduje zmiany chemiczne w paszy (np. degradacja białka). Suszona pasza jest pozostawiona w temperaturze pokojowej przez około 15 minut przed pomiarem częściowej suchej masy, tak aby zminimalizować potencjalną zmianę wilgotności, jaka może wystąpić podczas mielenia i przechowywania. Suszenie w temperaturach niższych niż 60 °C nie usuwa całej wody z paszy; w związku z tym (początkowe) częściowe suszenie nie pozwala oznaczyć całkowitej suchej masy paszy. Po suszeniu podpróbkę mieli się i analizuje pod kątem (końcowej) suchej masy częściowo wysuszonej próbki (pozostałe 3–15 % wilgoci) przy oznaczaniu innych składników chemicznych.

W związku z tym zaleca się dwuetapową procedurę oznaczania suchej masy. Najpierw należy oznaczyć częściową zawartość suchej masy (jeżeli ma wartość niższą niż 85 % suchej masy), a następnie oznaczyć pozostałą zawartość suchej masy na zmielonej próbce badanej i pomnożyć częściową suchą masę przez pozostałą suchą masę w celu oznaczenia całkowitej zawartości suchej masy.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następujących wzorów:

5.1.

Suszenie bez suszenia wstępnego

gdzie:

początkowa masa w gramach badanej próbki

masa w gramach badanej próbki po wysuszeniu

5.2.

Suszenie z suszeniem wstępnym (

)

gdzie:

początkowa masa w gramach badanej próbki

masa w gramach badanej próbki po wstępnym suszeniu

masa w gramach badanej próbki po rozdrobnieniu lub zmieleniu

masa w gramach badanej próbki po wysuszeniu

5.3.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,2 % bezwzględnej wartości wilgotności, z wyjątkiem wilgotnej karmy dla zwierząt domowych i gryzaków dla psów, w przypadku których różnica nie przekracza 0,5 % bezwzględnej wartości wilgotności.

6. Objaśnienia

Jeżeli rozdrabnianie próbki jest konieczne i wpływa na zawartość wilgoci w produkcie, wyniki analizy składników paszy należy skorygować w oparciu o poziom wilgotności w początkowym stanie próbki.

B. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO I ROŚLINNEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w temperaturze 103 °C do uzyskania stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi wynosić 1 mg lub mniej). Ubytek masy jest określany metodą wagową.

3. Aparatura i sprzęt

3.1. Naczynie z płaskim dnem wykonane z materiału nierdzewnego, o średnicy od 8 do 9 cm i wysokości około 3 cm

3.2. Termometr rtęciowy ze wzmocnionym zbiornikiem i ekspansyjną rurką w górnym końcu, z podziałką od 80 do co najmniej 110 °C i o długości około 10 cm

3.3. Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzejna

3.4. Eksykator zawierający efektywny środek suszący

3.5. Waga analityczna

4. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g zhomogenizowanej próbki do suchego, zważonego naczynia (pkt 3.1), zawierającego termometr (pkt 3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzejnej (pkt 3.3), ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90 °C w czasie około 7 minut.

Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105 °C. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki.

W celu całkowitego odparowania wilgoci należy ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103 °C ± 2 °C, schładzając do 93 °C pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (pkt 3.4) i zważyć. Powtarzać czynności, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy niż 2 mg.

Uwaga

Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczenia wyniku wziąć masę próbki z ważenia przed wzrostem jej masy.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

masa w gramach badanej próbki

masa w gramach naczynia z zawartością przed ogrzewaniem

masa w gramach naczynia z zawartością po ogrzewaniu

Wyniki oznaczania niższe niż 0,05 % należy zapisać, używając określenia „niższe niż 0,05 %”.

Powtarzalność

Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,1 % w wartości bezwzględnej.

C. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI AZOTU I OBLICZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszy na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla (

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. Amoniak destyluje się i zbiera w znanej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany roztworem wzorcowym wodorotlenku sodu.

Ewentualnie uwolniony amoniak jest destylowany do nadmiaru roztworu kwasu borowego, a następnie miareczkowany roztworem kwasu chlorowodorowego lub siarkowego.

3. Odczynniki

3.1. Siarczan potasu

3.2. Katalizator: tlenek miedzi(II) CuO lub pentahydrat siarczanu miedzi(II), CuSO4 5H2O

3.3. Granulowany cynk

3.4. Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5. Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6. Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7. Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8. Czerwień metylowa, wskaźnik: rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, σ = 95–96 % (v/v).

3.9. Roztwór wodorotlenku sodu (może być techniczny), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Wodorotlenek sodu, roztwór mianowany c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11. Wodorotlenek sodu, roztwór mianowany c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12. Granulowany kamień pumeksowy, przemyty kwasem chlorowodorowym i wyprażony

3.13. Acetanilid (temperatura topnienia = 114 °C, zawartość N = 10,36 %)

3.14. Sacharoza (niezawierająca azotu)

3.15. Kwas borowy (H3BO3)

3.16. Roztwór czerwieni metylowej, wskaźnik: rozpuścić 100 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.17. Roztwór zieleni bromokrezolowej: rozpuścić 100 mg zieleni bromokrezolowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.18. Roztwór kwasu borowego (od 10 g/l do 40 g/l, w zależności od stosowanej aparatury i sprzętu).

Przy stosowaniu kolorymetrycznego wyznaczania punktu końcowego do roztworów kwasu borowego należy dodać wskaźniki czerwieni metylowej i zieleni bromokrezolowej. Jeżeli przygotowuje się 1 l roztworu kwasu borowego, przed dostosowaniem objętości należy dodać 7 ml roztworu czerwieni metylowej (pkt 3.16) i 10 ml roztworu zieleni bromokrezolowej (pkt 3.17).

Odczyn pH roztworu kwasu borowego może różnić się między seriami w zależności od użytej wody. Odczyn pH roztworu kwasu borowego musi wynosić między 4,3 a 4,7. Często do uzyskania pozytywnej próby ślepej konieczne jest dostosowanie pH przy pomocy niewielkiej ilości zasady.

Uwaga:

Dodanie ok. 3–4 ml NaOH (pkt 3.11) do 1 l kwasu borowego o stężeniu 10 g/l zwykle zapewnia dobre dostosowanie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej oraz chronić przed światłem i źródłami oparów amoniaku.

3.19. Kwas chlorowodorowy, roztwór mianowany o stężeniu c(HCl) = 0,10 mol/l

Uwaga:

można zastosować inne stężenia roztworów wolumetrycznych (pkt 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19), jeżeli zostanie to uwzględnione w obliczeniach. Stężenie należy podawać zawsze z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.

4. Aparatura i sprzęt

Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla

5. Sposób postępowania

5.1.

Mineralizacja

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1 g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (pkt 3.1), odpowiednią ilość katalizatora (pkt 3.2) (od 0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub od 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.4) oraz, w razie potrzeby, kilka granulek kamienia pumeksowego (pkt 3.12) i zamieszać.

Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia substancji i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje się na ściankach kolby. Zapobiegać przegrzewaniu się ścianek i przylepianiu do nich organicznych cząstek.

Od chwili gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić do schłodzenia.

5.2.

Destylacja

Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie w razie potrzeby dodać kilka granulek cynku (pkt 3.3). Postępować zgodnie z pkt 5.2.1 lub 5.2.2.

5.2.1.

Destylacja do kwasu siarkowego

Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego odmierzone 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.5 lub 3.7), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (pkt 3.8).

Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu destylacyjnego i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (zob. objaśnienia pkt 8.3). Powoli wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.9) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (zob. objaśnienia pkt 8.1). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku.

5.2.2.

Destylacja do kwasu borowego

Jeżeli miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie wykonywane jest ręcznie, zastosowanie ma poniższe postępowanie. Jeżeli aparat destylacyjny jest w pełni zautomatyzowany i obejmuje miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie, należy stosować się do instrukcji producenta aparatu.

Umieścić kolbę odbieralnika zawierającą od 25 do 30 ml roztworu kwasu borowego (pkt 3.18) pod ujściem chłodnicy w taki sposób, aby rurka doprowadzająca znajdowała się pod powierzchnią nadmiaru roztworu kwasu borowego. Ustawić aparat destylacyjny, aby podał 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.9). Obsługiwać aparat destylacyjny zgodnie z instrukcjami producenta i oddestylować amoniak uwolniony w wyniku dodania roztworu wodorotlenku sodu. Zebrać destylat w roztworze kwasu borowego. Ilość destylatu (czas destylacji parą wodną) zależy od zawartości azotu w próbce. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga:

W przypadku półautomatycznego aparatu destylacyjnego dodawanie nadmiaru wodorotlenku sodu i destylacja parą wodną przeprowadzane są automatycznie.

5.3.

Miareczkowanie

Postępować zgodnie z pkt 5.3.1 lub 5.3.2.

5.3.1.

Kwas siarkowy

Miareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego.

5.3.2.

Kwas borowy

Miareczkować zawartość kolby odbieralnika roztworem mianowanym kwasu chlorowodorowego (pkt 3.19) lub kwasu siarkowego (pkt 3.6) przy pomocy biurety i odczytać ilość zużytego titrantu.

Przy stosowaniu kolorymetrycznego wyznaczania punktu końcowego punkt końcowy osiąga się w momencie pojawienia się pierwszego śladu różowego zabarwienia zawartości. Określić odczyt biurety z dokładnością do 0,05 ml. W wizualizacji punktu końcowego pomocna jest podświetlana płyta mieszadła magnetycznego lub detektor fotometryczny.

Można to przeprowadzić automatycznie za aparatury do destylacji z parą wodną z funkcją automatycznego miareczkowania.

Przy obsłudze konkretnego aparatu destylacyjnego lub aparatu do miareczkowania stosować się do instrukcji producenta.

Uwaga:

Jeżeli stosowany jest system automatycznego miareczkowania, rozpoczyna się ono bezpośrednio po rozpoczęciu destylacji i stosowany jest 1 % roztwór kwasu borowego (pkt 3.18).

Jeżeli stosowany jest w pełni automatyczny aparat destylacyjny, automatyczne miareczkowanie amoniaku można przeprowadzić również z wykryciem punktu końcowego przy pomocy potencjometrycznego systemu pH.

W tym przypadku stosowany jest automatyczny aparat do miareczkowania z pehametrem. Pehametr musi być odpowiednio skalibrowany w zakresie od pH 4 do pH 7 za pomocą zwykłych laboratoryjnych metod kalibracji pH.

Punkt końcowy pH w miareczkowaniu osiąga się przy wartości pH równej 4,6, co stanowi najwyższy punkt krzywej miareczkowania (punkt przegięcia).

5.4.

Próba ślepa

W celu potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, przeprowadzić próbę ślepą (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (pkt 3.14) zamiast próbki.

6. Obliczanie wyników

Obliczenia wykonywane są zgodnie z pkt 6.1 lub 6.2.

6.1.

Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.1

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

objętość (ml) NaOH (pkt 3.10 lub 3.11) zużytego do próby ślepej

objętość (ml) NaOH (pkt 3.10 lub 3.11) zużytego do miareczkowania próbki

stężenie (mol/l) wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11)

masa (g) próbki

6.2.

Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.2

6.2.1.

Miareczkowanie kwasem chlorowodorowym

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

masa (g) naważki

stężenie (mol/l) roztworu mianowanego kwasu chlorowodorowego (pkt 3.19)

objętość (w ml) kwasu chlorowodorowego użytego do próby ślepej

objętość (w ml) kwasu chlorowodorowego użytego do naważki

6.2.2.

Miareczkowanie kwasem siarkowym

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

masa (g) naważki

stężenie (mol/l) roztworu mianowanego kwasu siarkowego (pkt 3.6)

objętość (w ml) kwasu siarkowego (pkt 3.6) użytego do próby ślepej

objętość (w ml) kwasu siarkowego (pkt 3.6) użytego do naważki

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 0,4 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %,

— 2,0 % względem wyższej wartości, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %,

— 0,8 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %.

7.2.

Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach nie może przekraczać:

— 1,8 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %,

— 9,0 % względem wyższej wartości, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %,

— 3,6 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %.

7.3.

Dokładność

Przeprowadzić analizę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując odpowiednią ilość acetanilidu (pkt 3.13) (np. od 0,2 do 0,3 g) w obecności 1 g sacharozy (pkt 3.14); 1 g acetanilidu zużywa 14,80 ml kwasu siarkowego (pkt 3.5). Odzysk musi wynosić co najmniej 99 %.

8. Objaśnienia

8.1. Sprzęt i aparatura mogą być obsługiwane ręcznie, półautomatycznie lub być całkowicie zautomatyzowane. W przypadku konieczności przeniesienia pomiędzy etapami mineralizacji i destylacji, czynność tę należy wykonać bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu natychmiast przed podłączeniem kolby do chłodnicy, wlewając ciecz powoli po ściankach.

8.2. Jeżeli roztwór przechodzi w postać stałą, ponownie przeprowadzić oznaczanie, stosując większe ilości kwasu siarkowego (pkt 3.4) niż podano w pkt 5.1.

8.3. W przypadku produktów o niskiej zawartości azotu objętość kwasu siarkowego (pkt 3.7), która ma zostać dodana do kolby odbieralnika, może być w miarę potrzeby zmniejszona do 10 lub 15 ml i uzupełniona wodą do objętości 25 ml.

8.4. Do celów rutynowego badania można stosować inne metody analizy w odniesieniu do oznaczania białka surowego, ale metoda Kjeldahla opisana w niniejszej części C stanowi metodę referencyjną. Równoważność wyników uzyskanych inną metodą (np. DUMAS) w porównaniu z metodą referencyjną musi zostać wykazana odrębnie dla każdej matrycy. Ze względu na fakt, iż nawet po potwierdzeniu równoważności wyniki uzyskane inną metodą mogą się nieznacznie różnić od wyników uzyskanych metodą referencyjną, konieczne jest podanie w sprawozdaniu z analizy metody analitycznej zastosowanej do oznaczenia białka surowego.

D. OZNACZANIE MOCZNIKA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości mocznika stosowanego jako dodatek paszowy w paszach przeznaczonych dla przeżuwaczy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka ze środkiem klarującym tworzy w wodzie zawiesinę. Zawiesina jest filtrowana. Zawartość mocznika w filtracie jest oznaczana po dodaniu 4-dwumetyloaminobenzaldehydu (4-DMAB) poprzez pomiar gęstości optycznej przy długości fali 420 nm.

3. Odczynniki

3.1. Roztwór 4-dwumetyloaminobenzaldehydu: rozpuścić 1,6 g 4-DMAB w 100 ml 96 % etanolu i dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (ρ20 1,19 g/ml). Trwałość tego odczynnika wynosi nie więcej niż dwa tygodnie.

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu, K4Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4. Aktywny węgiel nieabsorbujący mocznika (sprawdzony)

3.5. Roztwór 0,1 % (w/v) mocznika

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min

4.2. Probówki: 160 × 16 mm ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.3. Spektrofotometr

5. Sposób postępowania

5.1.

Analiza próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić razem z 1 g aktywnego węgla (pkt 3.4) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody i 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2), mieszać przez ok. 30 sekund, a następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3). Mieszać przez 30 minut w tumblerze. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, wstrząsnąć i przefiltrować.

Do probówek ze szlifowanymi korkami szklanymi przenieść po 5 ml przezroczystego, bezbarwnego filtratu, dodać 5 ml roztworu 4-DMAB (pkt 3.1) i zamieszać. Wstawić probówki do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 20 °C (+/- 4 °C). Po 15 minutach zmierzyć gęstość optyczną roztworu próbki spektrofotometrem przy długości fali 420 nm. Pomiar porównać z roztworem do badań ze ślepej próby odczynnikowej.

5.2.

Krzywa wzorcowa

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml nalać 1, 2, 4, 5 i 10 ml roztworu mocznika (pkt 3.5) i uzupełnić do pełnej objętości kolb wodą. Odlać 5 ml każdego z roztworów, dodać do każdej kolby po 5 ml roztworu 4-DMAB (pkt 3.1), zhomogenizować i zmierzyć gęstość optyczną w podany wyżej sposób, porównując z roztworem kontrolnym zawierającym 5 ml 4-DMAB i 5 ml wody pozbawionej mocznika. Wykreślić krzywą wzorcową.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie krzywej wzorcowej oznaczyć zawartość mocznika w próbce.

Wynik należy wyrazić w mg mocznika na kg próbki.

7. Ocena metody

7.1.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki w tym samym laboratorium i przez tego samego analityka nie może przekraczać:

— przy 420 nm

— 50 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 5 000 mg/kg,

— 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 5 000 mg/kg do niższej niż 7 000 mg/kg,

— 20 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 7 000 mg/kg lub wyższej,

— przy 435 nm

— 40 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 5 000 mg/kg,

— 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 5 000 mg/kg do niższej niż 9 000 mg/kg,

— 5 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 9 000 mg/kg lub wyższej.

7.2.

Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach lub przez różnych analityków nie może przekraczać:

— przy 420 nm

— 3 000 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 12 000 mg/kg,

— 4 500 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości mocznika 12 000 mg/kg lub wyższej,

— przy 435 nm

— 50 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 8 000 mg/kg,

— 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 8 000 mg/kg lub wyższej.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

Zorganizowano porównanie międzylaboratoryjne UE, w którym wzięło udział 18 laboratoriów. Zbadano pięć pozytywnych próbek mieszanek paszowych dla przeżuwaczy (MAT w tabelach 1 i 2) (1 analiza) ze ślepymi duplikatami, a jedna ślepa próbka mieszanki paszowej dla przeżuwaczy została zbadana raz.

Obliczenia wartości granicznych powtarzalności (r) i odtwarzalności (R), jak określono w wytycznych międzynarodowych, przeprowadzono po usunięciu wartości odstających przy użyciu analizy wariancji ważnych wartości.

Obliczone dane liczbowe dotyczące wydajności metody (powtarzalność, odtwarzalność) przedstawiono w tabelach poniżej. W odniesieniu do wszystkich badanych próbek, w tym ślepych, nie znaleziono wyników fałszywie pozytywnych ani wyników fałszywie negatywnych.

Tabela 1

Charakterystyka wydajności analitycznej dla mocznika zmierzona przy λ = 420 nm we wszystkich materiałach

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

Owce

Bydło

Owce

Bydło

Docelowy ułamek masowy (mg kg-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Średni ułamek masowy (mg kg-1)

4 241

6 993

7 830

9 962

12 071

Odchylenie standardowe odtwarzalności sR (mg kg-1)

1 141

1 303

985

994

1 711

Odchylenie standardowe powtarzalności sr (mg kg-1)

723

601

549

712

737

Względne odchylenie standardowe odtwarzalności RSDR

(%)

Względne odchylenie standardowe powtarzalności RSDr

(%)

Granica odtwarzalności, R

[R = 2,8 × sR

]

3 195

3 649

2 759

2 784

4 790

Granica powtarzalności, r

[r = 2,8 × sr

]

2 024

1 684

1 536

1 994

2 064

Tabela 2

Charakterystyka wydajności analitycznej dla mocznika zmierzona przy λ = 435 nm we wszystkich materiałach

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

Owce

Bydło

Owce

Bydło

Docelowy ułamek masowy (mg kg-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Średni ułamek masowy (mg kg-1)

4 101

6 467

7 890

10 062

11 642

Odchylenie standardowe odtwarzalności sR (mg kg-1)

706

1 194

675

745

1 378

Odchylenie standardowe powtarzalności sr (mg kg-1)

570

628

613

196

167

Względne odchylenie standardowe odtwarzalności RSDR

(%)

Względne odchylenie standardowe powtarzalności RSDr

(%)

Granica odtwarzalności, R

[R = 2,8 × sR

]

1 977

3 344

1 889

2 087

3 859

Granica powtarzalności, r

[r = 2,8 × sr

]

1 596

1 759

1 715

549

467

9. Objaśnienia

9.1. W przypadku gdy zawartość mocznika jest wyższa niż 3 %, zmniejszyć masę próbki do 1 g lub rozcieńczyć pierwotny roztwór tak, aby w 500 ml nie znajdowało się więcej niż 50 mg mocznika.

9.2. W przypadku niskiej zawartości mocznika zwiększać masę próbki na tyle, aby filtrat pozostał przezroczysty i bezbarwny.

9.3. Powyższe wyniki porównań międzylaboratoryjnych nie wskazują na znaczącą różnicę precyzji między mocznikiem zmierzonym przy 420 nm lub 435 nm.

E. OZNACZANIE AMINOKWASÓW (Z WYJĄTKIEM TRYPTOFANU)

Metody analizy, które należy stosować do oznaczania aminokwasów (z wyjątkiem tryptofanu):

— EN ISO 13903 Pasze – Oznaczanie zawartości aminokwasów;

— EN ISO 17180 Pasze – Oznaczanie lizyny, metioniny i treoniny w komercyjnych produktach aminokwasowych i premiksach (

);

— metoda analizy opisana w pkt 1–10 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych i wolnych peptydów) aminokwasów w materiałach paszowych, mieszankach paszowych i premiksach zawierających mniej niż 10 % (

) każdego aminokwasu z użyciem analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny.

Metoda nie pozwala rozróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu lub hydroksyanalogów aminokwasów.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1.

Wolne aminokwasy

Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór dostosowuje się do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane z zastosowaniem reakcji z ninhydryną, poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm.

2.2.

Aminokwasy całkowite

Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę należy przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna musi być oznaczana w hydrolizatach próbek niepoddanych utlenieniu. Pozostałe aminokwasy wymienione w pkt 1 (Celi zakres stosowania metody) mogą być oznaczane w próbce utlenionej albo niepoddanej utlenianiu.

Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0 °C z użyciem mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany z użyciem pirosiarczynu sodu. Utleniona albo niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (pkt 3.20) przez 23 godziny. Hydrolizat dostosowuje się do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane na drodze reakcji z ninhydryną, przez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny).

3. Odczynniki

Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub równoważnej jakości (przewodność < 10 μS).

3.1. Nadtlenek wodoru, w (w/w) = 30 %

3.2. Kwas mrówkowy, w (w/w) = 98–100 %

3.3. Fenol

3.4. Pirosiarczyn sodu

3.5. Wodorotlenek sodu

3.6. Kwas 5-sulfosalicylowy dihydrat

3.7. Kwas chlorowodorowy, gęstość około 1,18 g/ml

3.8. Cytrynian trisodu, dihydrat

3.9. 2,2’ tiodietanol (tiodiglikol)

3.10. Chlorek sodu

3.11. Ninhydryna

3.12. Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C

3.13. Norleucyna lub inny związek odpowiedni do stosowania jako wzorzec wewnętrzny.

3.14. Azot gazowy (< 10 ppm tlenu)

3.15. 1-oktanol

3.16. Aminokwasy

3.16.1. Substancje wzorcowe aminokwasów wymienione w pkt 1 (Cel i zakres stosowania metody). Czyste związki, niezawierające wody krystalizacyjnej. Suszyć w warunkach próżni w obecności P2O5 lub H2SO4 przez tydzień przed użyciem.

3.16.2. Kwas cysteinowy

3.16.3. Sulfon metioniny

3.17. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 7,5 mol/l:

Rozpuścić 300 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.18. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l:

Rozpuścić 40 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.19. Roztwór kwasu mrówkowego i fenolu:

Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (pkt 3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (pkt 3.3).

3.20. Mieszanina hydrolizująca, c = 6 mol HCl/l, zawierająca 1 g fenolu/l:

Dodać 1 g fenolu (pkt 3.3) do 492 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.21. Mieszanina ekstrakcyjna, c = 0,1 mol HCl/l, zawierająca 2 % tiodiglikolu: Pobrać 8,2 ml HCl (pkt 3.7), rozpuścić w około 900 ml wody, dodać 20 ml tiodiglikolu (pkt 3.9) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą (nie mieszać bezpośrednio odczynników określonych w pkt 3.7 i 3.9).

3.22. Kwas 5-sulfosalicylowy, ß = 6 %:

Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (pkt 3.6) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.23. Mieszanina utleniająca (kwas nadmrówkowy – fenol):

Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.1) z 4,5 ml roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (pkt 3.19). Inkubować w temperaturze od 20 do 30 °C przez godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie schłodzić w łaźni lodowej (15 minut) przed dodaniem tej mieszaniny do próbki.

Uwaga: Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną.

3.24. Bufor cytrynianowy, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20:

Rozpuścić 19,61 g cytrynianu sodu (pkt 3.8), 5 ml tiodiglikolu (pkt 3.9), 1 g fenolu (pkt 3.3) i 16,50 ml HCl (pkt 3.7) w około 800 ml wody. Dostosować pH do 2,20. Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.25. Bufory elucyjne, przygotowane zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (pkt 4.9)

3.26. Odczynnik ninhydrynowy, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (pkt 4.9)

3.27. Wzorcowe roztwory aminokwasów. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C.

3.27.1. Podstawowy roztwór wzorcowy aminokwasów (3.16.1)

Każdy o stężeniu c = 2,5 μmol/ml, w kwasie chlorowodorowym.

Mogą być otrzymane w handlu.

3.27.2. Podstawowy roztwór wzorcowy kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, c = 1,25 μmol/ml

Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (pkt 3.16.2) i 0,2265 g sulfonu metioniny (pkt 3.16.3) w buforze cytrynianowym (pkt 3.24) w kolbie miarowej o pojemności 1 l i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez 12 miesięcy. Roztworu nie stosuje się, jeżeli podstawowy roztwór wzorcowy (pkt 3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny.

3.27.3. Podstawowy roztwór wzorcowy wzorca wewnętrznego, np. norleucyny, c = 20 μmol/ml

Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (pkt 3.13) w buforze cytrynianowym (pkt 3.24) w kolbie miarowej i uzupełnić kolbę do objętości 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez sześć miesięcy.

3.27.4. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do użycia z hydrolizatami, c = 5 nmol/50 μl kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny i c = 10 nmol/50 μl pozostałych aminokwasów. Rozpuścić 2,2 g chlorku sodu (pkt 3.10) w zlewce o pojemności 100 ml z 30 ml buforu cytrynianowego (pkt 3.24). Dodać 4,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego aminokwasów (pkt 3.27.1), 4,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny (pkt 3.27.2) i, jeżeli jest stosowany, 0,50 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3). Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18).

Przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (pkt 3.24) i zmieszać.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez trzy miesiące.

Zob. również objaśnienia pkt 9.1.

3.27.5. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do stosowania z hydrolizatami przygotowanymi w sposób określony w pkt 5.3.3.1 i do użycia z ekstraktami (pkt 5.2). Roztwór kalibracyjny przygotowuje się w sposób określony w pkt 3.27.4, z pominięciem chlorku sodu.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez trzy miesiące.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Kolba okrągłodenna o pojemności 100 lub 250 ml z chłodnicą zwrotną

4.2. Butelka ze szkła borokrzemowego o pojemności 100 ml z nakrętką pokrytą gumą/teflonem (np. Duran, Schott) do stosowania w suszarce

4.3. Suszarka z wentylacją wymuszoną i możliwością regulacji temperatury z dokładnością większą niż ± 2 oC

4.4. Pehametr (dokładność do trzech miejsc po przecinku)

4.5. Filtr membranowy (0,22 μm)

4.6. Wirówka

4.7. Rotacyjna wyparka próżniowa

4.8. Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.9. Analizator aminokwasów lub wyposażenie do HPLC z kolumną jonowymienną, przystawką do ninhydryny, postkolumnową derywatyzacją i detektorem fotometrycznym.

Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny jest przeprowadzany przez pompy o stabilności przepływu ± 0,5 % zarówno w czasie testowania kalibracyjnych roztworów, jak i analizy próbek.

W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadowalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie do objętości około 5 ml, które wykonuje się po hydrolizie i przed dostosowaniem pH. Odparowywanie należy prowadzić w warunkach próżni w temperaturze nie wyższej niż 40 °C.

5. Sposób postępowania

5.1.

Przygotowanie próbki

Zmielić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgoci przed zmieleniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 °C, albo przez liofilizację. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed zmieleniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12).

5.2.

Oznaczanie wolnych aminokwasów

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby stożkowej i dodać 100,0 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (pkt 3.21). Wytrząsać mieszaninę przez 60 minut, używając mechanicznej wytrząsarki lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10,0 ml supernatantu do zlewki o objętości 100 ml.

Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (pkt 3.22) i kontynuować mieszanie z użyciem mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przefiltrować lub odwirować supernatant w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o objętości 100 ml, dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18), przenieść do kolby o miarowej odpowiedniej pojemności, z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić roztworem buforowym do pełnej objętości tej kolby (pkt 3.24).

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, dodać 1,00 ml wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić roztworem buforowym (pkt 3.24) do pełnej objętości kolby.

Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w 5.4.

Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 °C.

5.3.

Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów

5.3.1.

Utlenianie

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do:

— kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (pkt 4.1) do hydrolizy otwartej (pkt 5.3.2.3) lub

— kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (pkt 4.1), jeżeli wymagane jest niskie stężenie sodu (pkt 5.3.3.1), lub

— butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (pkt 4.2) (w przypadku hydrolizy zamkniętej pkt 5.3.2.4).

Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu, a poziom wilgotności nie może przekraczać 100 mg.

Umieścić kolbę lub butelkę w lodowej łaźni wodnej i schłodzić do temperatury 0 °C, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (pkt 3.23) i zamieszać, używając szklanej szpatułki z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę/butelkę wraz ze szpatułką, stosując hermetyczną powłokę, umieścić wraz z lodową łaźnią wodną w lodówce o temperaturze 0 °C i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g pirosiarczynu sodu (pkt 3.4).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.1.

5.3.2.

Hydroliza

5.3.2.1. Hydroliza próbek utlenionych

Do utlenionej próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.3.1 dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (pkt 3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia i szpatułki.

W zależności od sposobu przeprowadzonej hydrolizy postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydroliza próbek nieutlenionych

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby okrągłodennej o pojemności 100 lub 250 ml (pkt 4.1) lub do butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (pkt 4.2). Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (pkt 3.20) i zmieszać z próbką. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hydroliza otwarta

Do kolby z mieszaniną, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, dodać 3 szklane koraliki i gotować, utrzymując stan wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę 5 ml buforu cytrynianowego (pkt 3.24). Odłączyć kolbę i schłodzić w łaźni lodowej.

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.2.4. Hydroliza zamknięta

Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, w suszarce (pkt 4.3) w temperaturze 110 °C. W czasie pierwszej godziny hydrolizy, aby uniknąć gwałtownego wzrostu ciśnienia (w wyniku powstawania substancji gazowych) i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia nakrętką. Po godzinie dokręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (pkt 4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę w lodowej łaźni wodnej. Pozostawić do schłodzenia.

W zależności od sposobu dostosowania pH (pkt 5.3.3) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (pkt 3.24).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.3.

Dostosowanie pH

W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (pkt 4.9) na sód pH dostosowuje się w sposób określony w pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2.

5.3.3.1. Dla systemów chromatograficznych (pkt 4.9) wymagających niskiego stężenia sodu

Wskazane jest zastosowanie podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3), gdy wykorzystywane są analizatory aminokwasów wymagające niskiego stężenia sodu (w przypadku gdy należy zredukować objętość kwasu).

W tym przypadku dodać 2,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem.

Dodać 2 krople 1-oktanolu (pkt 3.15) do hydrolizatu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

Stosując wyparkę rotacyjną (pkt 4.7), zmniejszyć w warunkach próżni i w temperaturze 40 °C objętość do 5–10 ml. Jeżeli objętość zostanie przypadkowo zredukowana poniżej 5 ml, hydrolizat należy wyrzucić i powtórzyć analizę.

Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18) i postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.3.2. Dla pozostałych analizatorów aminokwasów (pkt 4.9)

Pobrać hydrolizaty otrzymane w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4 i częściowo je zneutralizować poprzez ostrożne dodanie 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.17) i jednoczesne mieszanie, przy czym należy zwrócić uwagę, aby temperatura roztworu była niższa niż 40 °C.

Dostosować pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (pkt 3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (pkt 3.18). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.4.

Roztwór próbki do analizy chromatograficznej

Przenieść ilościowo hydrolizat o dostosowanym pH (pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2) z użyciem buforu cytrynianowego (pkt 3.24) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem (pkt 3.24).

Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) i uzupełnić buforem cytrynianowym (pkt 3.24) do pełnej objętości kolby. Dokładnie wymieszać.

Przejść do analizy chromatograficznej (pkt 5.4).

Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 °C.

5.4.

Chromatografia

Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (pkt 5.2) lub hydrolizat (pkt 5.3.4) do temperatury pokojowej. Wstrząsnąć mieszaniną i przefiltrować jej odpowiednią ilość przez filtr membranowy 0,22 μm (pkt 4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest poddawany chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (pkt 4.9).

Dozowanie wykonuje się ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby na kolumnę nanieść takie same ilości roztworów z dokładnością ± 0,5 % zarówno w przypadku analizy wzorców, jak i badanych próbek, z wyjątkiem gdy jest stosowany wzorzec wewnętrzny, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był jak najbardziej zbliżony do tego w roztworze wzorcowym.

Zasadniczo częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są rozcieńczane buforem cytrynianowym (pkt 3.24), tak aby powierzchnia piku wzorca odpowiadała od 30 do 200 % powierzchni piku badanej próbki aminokwasu.

Analiza chromatograficzna aminokwasów będzie różnić się nieznacznie w zależności od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność oddzielenia od siebie aminokwasów oraz od składników reagujących z ninhydryną. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny musi dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dodawanych na kolumnę.

W czasie analizy chromatograficznej opisany poniżej stosunek pik – dolina odnosi się do przypadku, gdy jest analizowany roztwór równomolowy oznaczanego aminokwasu. Roztwór równomolowy aminokwasu musi zawierać co najmniej 30 % maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, co można dokładnie zmierzyć z użyciem analizatora aminokwasów (pkt 4.9).

Dla oddzielenia treoniny od seryny stosunek pik – dolina niższego z pokrywających się aminokwasów na chromatografie nie może przekraczać 2:10 (w przypadku gdy oznaczane są tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna, niewystarczające oddzielenie od sąsiednich pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie). Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10.

System musi zapewniać oddzielenie lizyny od „artefaktów lizyny” i od ornityny.

6. Obliczanie wyników

Powierzchnię pików próbki i wzorca mierzy się dla każdego pojedynczego aminokwasu i obliczana jest zawartość aminokwasu (X) w g/kg próbki.

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, wyrażenie należy pomnożyć przez:

powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu

powierzchnia piku kalibracyjnego roztworu wzorcowego

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy

masa molowa oznaczanego aminokwasu

stężenie wzorca w μmol/ml

masa próbki w g (przeliczona na masę oryginalnej próbki w przypadku podsuszania lub odtłuszczania)

hydrolizat ogółem w ml (pkt 5.3.4) lub obliczona całkowita objętość w ml rozcieńczonego ekstraktu (pkt 6.1)

Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, ale są obliczane jak cystyna (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), przy zastosowaniu M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale jest obliczana jak metionina, z zastosowaniem M metioniny: 149,21 g/mol.

Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, przy czym dla obliczeń stosowana jest taka sama wartość M.

6.1. Całkowitą objętość rozcieńczonych ekstraktów (F) w przypadku oznaczania zawartości wolnych aminokwasów (pkt 5.2) oblicza się według następującego wzoru:

objętość końcowego ekstraktu

7. Ocena metody

W 1990 r. przeprowadzono międzynarodowe badanie porównawcze metody z użyciem czterech pasz (mieszanki paszowej dla świń, mieszanki paszowej dla brojlerów, koncentratu białkowego i premiksu).

Uwaga:

Metoda została przebadana podczas drugiego międzynarodowego badania porównawczego w 2003 r., z wykorzystaniem ślepych, pobranych dwukrotnie próbek paszy dla brojlerów do tuczu końcowego, paszy startowej dla brojlerów, kukurydzy, mączki rybnej i mączki drobiowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w normie EN ISO 13903.

W tabelach w niniejszym punkcie podano wyniki badania porównawczego z 1990 r. po odrzuceniu wartości odstających oraz odchyleń przeciętnych i standardowych:

Średnie wielkości w g/kg

Materiał referencyjny

Aminokwas

Treonina

Cystyna/cysteina

Metionina

Lizyna

Mieszanka paszowa dla świń

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Mieszanka paszowa dla brojlerów

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Koncentrat białkowy

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Premiks

58,42

n = 16

— 90,21

n = 16

98,03

n = 16

n = liczba uczestniczących laboratoriów

7.1.

Powtarzalność

Powtarzalność wyrażona jako „odchylenie standardowe w ramach laboratorium” badania porównawczego przedstawionego w tabeli powyżej jest przedstawiona w poniższych tabelach:

Współczynnik zmienności (%) dla powtarzalności (CVr)

Materiał referencyjny

Aminokwas

Treonina

Cystyna/cysteina

Metionina

Lizyna

Mieszanka paszowa dla świń

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Mieszanka paszowa dla brojlerów

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Koncentrat białkowy

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Premiks

2,2

n = 16

— 2,4

n = 16

2,1

n = 16

n = liczba uczestniczących laboratoriów

7.2.

Odtwarzalność

Wyniki odchylenia standardowego między laboratoriami otrzymane w wyniku przeprowadzenia omawianego powyżej porównawczego badania są przedstawione w poniższej tabeli:

Współczynnik zmienności (%) dla odtwarzalności (CVR)

Materiał referencyjny

Aminokwas

Treonina

Cystyna/cysteina

Metionina

Lizyna

Mieszanka paszowa dla świń

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Mieszanka paszowa dla brojlerów

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Koncentrat białkowy

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Premiks

4,3

n = 16

- 6,9

n = 16

6,7

n = 16

n = liczba uczestniczących laboratoriów

8. Stosowanie materiałów odniesienia

Prawidłowe stosowanie metody weryfikuje się przez wykonywanie powtórnych pomiarów certyfikowanych materiałów odniesienia, jeżeli takie są dostępne. Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych kalibracyjnych roztworów aminokwasów.

9. Objaśnienia

9.1. Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów końcowe stężenia kalibracyjnych roztworów aminokwasów wzorcowych (zob. pkt 3.27.4 i 3.27.5) oraz hydrolizatu (zob. pkt 5.3.4) należy traktować jako przykładowe.

Zakres liniowej odpowiedzi aparatu należy sprawdzić dla wszystkich aminokwasów.

Roztwór wzorcowy jest rozcieńczany buforem cytrynianowym, tak aby otrzymać powierzchnię piku o średnim zasięgu.

9.2. Jeżeli do analizy hydrolizatów jest wykorzystywany wysoko sprawny chromatograf cieczowy, należy zoptymalizować warunki doświadczalne analizy zgodnie z zaleceniami producenta.

9.3. Przy stosowaniu tej metody do mieszanek paszowych lub premiksów zawierających więcej niż 1 % chlorków (koncentraty, mieszanki paszowe mineralne, mieszanki paszowe uzupełniające) wyniki oznaczania metioniny mogą być zaniżone i należy stosować specjalne postępowanie.

10. Kryteria wydajności

Zestawienie wyników (z wyjątkiem tyrozyny) pochodzących z dwóch porównań międzylaboratoryjnych (z 1990 r. przedstawionych w pkt 7 powyżej i z 2005 r. opisanych w normie EN/ISO 13903) daje następujące kryteria powtarzalności i odtwarzalności. Wartości uzyskane w tych dwóch badaniach międzylaboratoryjnych mogą nie mieć zastosowania do zakresów stężeń i matryc innych niż podane.

10.1.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki w tym samym laboratorium i przez tego samego analityka nie może przekraczać:

— 6 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku glicyny, alaniny, lizyny, proliny, kwasu glutaminowego, izoleucyny i histydyny;

— 8 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku treoniny, fenyloalaniny, metioniny, kwasu asparaginowego i leucyny;

— 10 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku argininy i waliny;

— 12 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu seryna;

— 15 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu cystyna (cysteina).

10.2.

Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach lub przez różnych analityków nie może przekraczać:

— 15 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku glicyny, alaniny i treoniny;

— 20 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku lizyny, proliny, fenyloalaniny, metioniny i kwasu asparaginowego;

— 22 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku kwasu glutaminowego i leucyny;

— 27 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu arginina;

— 32 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu izoleucyna;

— 35 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku waliny i seryny;

— 40 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu histydyna;

— 50 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu cystyna (cysteina).

F. OZNACZANIE TRYPTOFANU

Metody analizy, które należy stosować do oznaczania tryptofanu:

— EN ISO 13904 Pasze – Oznaczanie zawartości tryptofanu;

— metoda analizy opisana w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego i wolnego tryptofanu w paszach. Metoda nie wyróżnia form D i L.

2. Sposób przeprowadzenia metody

W celu oznaczenia całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym z użyciem nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do 110 °C przez 20 godzin. Po hydrolizie dodawany jest wzorzec wewnętrzny.

W celu oznaczenia wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w warunkach lekko kwaśnych w obecności wzorca wewnętrznego.

Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczany metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

3. Odczynniki

3.1. Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub o równoważnej jakości (przewodność < 10 μS/cm).

3.2. Substancja wzorcowa: tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu

3.3. Substancja wzorcowa wewnętrzna: α-metylo-tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu

3.4. Wodorotlenek baru, oktahydrat (należy uważać, aby nie wystawiać Ba(OH)2.8 H2O na nadmierne działanie powietrza, aby uniknąć tworzenia się BaCO3, który mógłby utrudniać oznaczenie) (zob. objaśnienia pkt 9.3)

3.5. Wodorotlenek sodu

3.6. Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %

3.7. Kwas chlorowodorowy, ρ20 1,19 g/ml

3.8. Metanol do HPLC

3.9. Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C

3.10. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l

Rozpuścić 40,0 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 l wodą (pkt 3.1).

3.11. Kwas chlorowodorowy, c = 6 mol/l:

Odmierzyć 492 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.12. Kwas chlorowodorowy, c = 1 mol/l:

Odmierzyć 82 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.13. Kwas chlorowodorowy, c = 0,1 mol/l:

Odmierzyć 8,2 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.14. Kwas ortofosforowy, c = 0,5 mol/l:

Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą (pkt 3.1).

3.15. Stężony roztwór tryptofanu (pkt 3.2), c = 2,50 μmol/ml:

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (pkt 3.2) w kwasie chlorowodorowym (pkt 3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (pkt 3.13). Przechowywać w temperaturze -18 °C nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.16. Stężony roztwór wzorca wewnętrznego, c = 2,50 μmol/ml:

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g α-metylo-tryptofanu (pkt 3.3) w kwasie chlorowodorowym (pkt 3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (pkt 3.13). Przechowywać w temperaturze -18 °C nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.17. Kalibracyjny roztwór wzorcowy tryptofanu i wzorca wewnętrznego:

Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (pkt 3.16). Rozcieńczyć wodą (pkt 3.1) i metanolem (pkt 3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10–30 %) jak w końcowym hydrolizacie.

Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania.

3.18. Kwas octowy

3.19. 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanol

3.20. Etanoloamina w (w/w) > 98 %

3.21. Roztwór 1 g 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w 100 ml metanolu (pkt 3.8)

3.22. Faza ruchoma do HPLC: 3,00 g kwasu octowego (pkt 3.18) + 900 ml wody (pkt 3.1) + 50,0 ml roztworu (pkt 3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w metanolu (pkt 3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00 z użyciem etanoloaminy (pkt 3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (pkt 3.1).

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Wyposażenie HPLC z detektorem spektrofluorometrycznym

4.2. Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważna

4.3. Pehametr

4.4. Kolba z polipropylenu o pojemności 125 ml, z szeroką szyjką i nakrętką

4.5. Filtr membranowy, 0,45 μm

4.6. Autoklaw, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7. Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.8. Wstrząsarka

5. Sposób postępowania

5.1.

Przygotowanie próbek

5.2.

Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w 5.1 do kolby stożkowej. Dodać 100,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut z użyciem wytrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml supernatantu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.14). Dostosować pH do 3 z użyciem wodorotlenku sodu (pkt 3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (pkt 3.8), aby uzyskać stężenie od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (objętość zbliżona do objętości kalibracyjnego roztworu wzorcowego (pkt 3.17)).

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i ekstrakty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty można przechowywać w temperaturze 5 °C nie dłużej niż przez 3 dni.

5.3.

Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat)

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby z polipropylenu (pkt 4.4). Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (pkt 3.4) i 10 ml wody. Wymieszać przy użyciu wstrząsarki (pkt 4.8) lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia z użyciem 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i zamknąć luźno kolbę. Przenieść kolbę do autoklawu (pkt 4.6) z wrzącą wodą i parować przez 30 do 60 minut. Zamknąć autoklaw i autoklawować w temperaturze 110 (± 2) °C przez 20 godzin.

Przed otwarciem autoklawu obniżyć temperaturę nieco poniżej 100 °C. W celu uniknięcia krystalizacji Ba(OH)2.8 H2O dodać do ciepłej mieszaniny 30 ml wody o temperaturze pokojowej. Łagodnie wstrząsać lub mieszać. Dodać 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (pkt 3.16). Studzić naczynia w łaźni wodnej lub lodowej przez 15 minut.

Następnie dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.14). Utrzymując naczynie w zimnej łaźni, zobojętnić z użyciem HCl (pkt 3.11), mieszając, i dostosować pH do 3,0 z HCl (pkt 3.12). Dodać ilość metanolu konieczną do uzyskania stężenia od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości koniecznej dla chromatografii (np. 100 ml). Dodanie metanolu nie może powodować wytrącania.

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i hydrolizaty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy hydrolizatów tego samego dnia, można je przechowywać w temperaturze 5 °C nie dłużej niż przez 3 dni.

5.4.

Oznaczanie HPLC

Poniższe parametry elucji izokratycznej podano jako przykładowe; inne parametry mogą być stosowane, pod warunkiem że ich zastosowanie doprowadzi do otrzymania równoważnych wyników (zob. również objaśnienia pkt 9.1 i 9.2):

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.2):

125 mm x 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważna kolumna

Temperatura kolumny:

temperatura pokojowa

Faza ruchoma (pkt 3.22):

3,00 g kwasu octowego (pkt 3.18) + 900 ml wody (pkt 3.1) +50,0 ml roztworu (pkt 3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w metanolu (pkt 3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00 z użyciem etanoloaminy (pkt 3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (pkt 3.1)

Prędkość przepływu:

1 ml/min

Całkowity czas analizy:

około 34 min

Długość fali przy detekcji:

wzbudzenie: 280 nm, emisja: 356 nm

Dozowana objętość:

20 μl

6. Obliczanie wyników

Oblicza się zawartość tryptofanu (X) w g na 100 g próbki.

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy (pkt 3.17)

powierzchnia piku tryptofanu, ekstraktu (pkt 5.2) lub hydrolizatu (pkt 5.3)

objętość w ml (2 ml) stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (pkt 3.17)

stężenie w μmol/ml (= 2,50) stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (pkt 3.17)

objętość w ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16) dodanego przy ekstrakcji (pkt 5.2) (= 5,00 ml) lub do hydrolizatu (pkt 5.3) (= 2,00 ml)

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, ekstrakt (pkt 5.2) lub hydrolizat (pkt 5.3)

powierzchnia piku tryptofanu, kalibracyjny roztwór wzorcowy (pkt 3.17)

objętość w ml (= 2,00 ml) stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16) dodanego do kalibracyjnego roztworu wzorcowego (pkt 3.17)

masa próbki w g (skorygowana względem masy wyjściowej, jeżeli była suszona lub odtłuszczana)

masa molowa tryptofanu (= 204,23 g/mol)

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % względem najwyższego wyniku.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W UE przeprowadzono porównanie międzylaboratoryjne (czwarte badanie porównawcze), w którym trzy próbki były analizowane przez maksymalnie 12 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 1

Pasza dla świń

Próbka 2

Pasza dla świń uzupełniona L-tryptofanem

Próbka 3

Koncentrat paszowy dla świń

Średnia [g/kg]

2,42

3,40

4,22

sr [g/kg]

0,05

0,08

r [g/kg]

0,14

0,22

CVr [%]

1,9

1,6

1,9

SR [g/kg]

0,15

0,20

0,09

R [g/kg]

0,42

0,56

0,25

CVR [%]

6,3

6,0

2,2

L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki

n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona)

sr = odchylenie standardowe powtarzalności

SR = odchylenie standardowe odtwarzalności

r = powtarzalność

R = odtwarzalność

CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w %

CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

W innym porównaniu międzylaboratoryjnym przeprowadzonym w UE (trzecie badanie porównawcze) dwie próbki były analizowane przez maksymalnie 13 laboratoriów w celu sprawdzenia metody ekstrakcji wolnego tryptofanu. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 4

Mieszanka pszenicy i soi

Próbka 5

Mieszanka pszenicy i soi (= próbka 4) z dodatkiem tryptofanu (0,457 g/kg)

Średnia [g/kg]

0,391

0,931

sr [g/kg]

0,005

0,012

r [g/kg]

0,014

0,034

CVr [%]

1,34

SR [g/kg]

0,018

0,048

R [g/kg]

0,050

0,134

CVR [%]

4,71

5,11

L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki

n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona)

sr = odchylenie standardowe powtarzalności

SR = odchylenie standardowe odtwarzalności

r = powtarzalność

R = odtwarzalność

CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w %

CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

W kolejnym badaniu porównawczym przeprowadzonym w UE cztery próbki były analizowane przez maksymalnie 7 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy tryptofanu. Wyniki są podane poniżej. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie).

Próbka 1

Mieszanka paszowa dla świń (CRM 117)

Próbka 2

Niskotłuszczowa mączka rybna

(CRM 118)

Próbka 3

Mączka sojowa

(CRM 119)

Próbka 4

Odtłuszczone mleko w proszku

(CRM 120)

Średnia [g/kg]

2,064

8,801

6,882

5,236

sr [g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r [g/kg]

0,059

0,283

0,249

0,112

CVr [%]

1,04

1,15

1,30

0,76

SR [g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R [g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CVR [%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki

n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona)

sr = odchylenie standardowe powtarzalności

SR = odchylenie standardowe odtwarzalności

r = powtarzalność

R = odtwarzalność

CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w %

CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

9. Objaśnienia

9.1. Lepszy rozdział tryptofanu i α-metylo-tryptofanu może nastąpić przy uwzględnieniu szczególnych warunków chromatograficznych.

Elucja izokratyczna po gradientowym czyszczeniu kolumny:

Kolumna do chromatografii cieczowej:

125 mm x 4 mm, C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna

Temperatura kolumny:

32 °C

Faza ruchoma:

A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V+V)

B: metanol

Program czyszczenia gradientowego:

0 min 100 % A

0 % B

15 min 100 % A

0 % B

17 min 60 % A

40 % B

19 min 60 % A

40 % B

21 min 100 % A

0 % B

33 min 100 % A

0 % B

Prędkość przepływu:

1,2 ml/min

Całkowity czas analizy:

około 33 min

9.2. Analiza chromatograficzna będzie się zmieniać w zależności od typu HPLC i materiału użytego do wypełnienia kolumny. Wybrany system musi umożliwić uzyskanie oddzielającej linii bazowej pomiędzy tryptofanem i wzorcem wewnętrznym. Ponadto ważne jest, aby produkty degradacji zostały dobrze oddzielone od tryptofanu i wzorca wewnętrznego. Hydrolizaty bez wzorca wewnętrznego należy poddać analizie w celu sprawdzenia linii bazowej stosownie do wzorca wewnętrznego względem zanieczyszczeń. Ważne jest, aby czas analizy był wystarczająco długi dla elucji wszystkich produktów degradacji, w przeciwnym razie ostatnie eluujące piki na chromatogramie mogą zakłócać kolejną analizę.

W zakresie badanych stężeń układ chromatograficzny musi zapewniać liniową odpowiedź. Liniową odpowiedź należy mierzyć przy stałym (normalnym) stężeniu wzorca wewnętrznego i zmieniających się stężeniach tryptofanu. Ważne jest, aby wielkość pików tryptofanu i wzorca wewnętrznego zawierała się w liniowym zakresie układu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Jeżeli piki tryptofanu lub wzorca wewnętrznego są zbyt małe lub zbyt duże, analizę należy powtórzyć przy zmienionej wielkości próbki lub jej objętości końcowej.

9.3.

Wodorotlenek baru

Fakt, że wodorotlenek baru z czasem jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia, wpływa na nieklarowność roztworu do oznaczania HPLC, która może być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu.

G. OZNACZANIE SUROWEGO OLEJU I TŁUSZCZU

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości surowych olejów i tłuszczów w paszach.

Zastosowanie dwóch sposobów postępowania opisanych poniżej zależy od rodzaju i składu paszy oraz celu prowadzenia analizy.

W celu oznaczenia surowych olejów i tłuszczów w nasionach i owocach oleistych, a także w paszy, w której zawartość olejów/tłuszczów surowych jest wyższa niż 15 %, ekstrakcję należy przeprowadzić metodą A, a ponowną ekstrakcję – metodą B (pkt 5.3).

1.1. Postępowanie A – Bezpośrednio ekstrahowane surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia roślinnego, z wyjątkiem tych, które zostały objęte zakresem postępowania B.

1.2. Postępowanie B – Całkowite surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego i wszystkich mieszanek paszowych. Jest stosowane do wszystkich materiałów, z których oleje i tłuszcze nie mogą być w całości wyekstrahowane bez uprzedniej hydrolizy (np. gluten, drożdże, białka ziemniaczane i produkty przetworzone np. poprzez ekstruzję, płatkowanie i ogrzewanie).

1.3.

Interpretacja wyników

We wszystkich przypadkach, w których wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B jest wyższy od wyniku otrzymanego przy zastosowaniu postępowania A, wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B należy traktować jako wartość prawdziwą.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1.

Postępowanie A

Próbka jest poddawana ekstrakcji eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest oddestylowany, a pozostałość jest suszona i ważona.

2.2.

Postępowanie B

Próbka jest ogrzewana kwasem chlorowodorowym. Mieszanina jest oziębiana i filtrowana. Pozostałość jest przemywana i suszona, a następnie poddawana oznaczaniu przy zastosowaniu postępowania A.

3. Odczynniki

3.1. Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C. Wartość bromowa musi być niższa niż 1, a pozostałość po odparowaniu niższa niż 2 mg/100 ml.

3.2. Siarczan sodu bezwodny

3.3. Kwas chlorowodorowy, c = 3 mol/l

3.4. Pomocniczy materiał filtracyjny, np. Kieselgur, Hyflo-supercel

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Aparat ekstrakcyjny. Jeżeli aparat jest wyposażony w syfon (aparat Soxhleta), prędkość skraplania musi wynosić około 10 cykli na godzinę. Jeżeli aparat nie ma syfonu, wówczas prędkość skraplania musi wynosić około 10 ml na minutę.

4.2. Gilzy ekstrakcyjne, niezawierające substancji rozpuszczalnych w eterze naftowym, o porowatości odpowiadającej wymaganiom określonym w pkt 4.1

4.3. Suszarka – suszarka próżniowa z możliwością ustawienia temperatury suszenia na 75 ± 3 °C lub suszarka nawiewna z możliwością ustawienia temperatury na 100 ± 3 °C

5. Sposób postępowania

5.1. Postępowanie A (zob. pkt 8.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, przenieść do gilzy ekstrakcyjnej (pkt 4.2) i przykryć beztłuszczowym zwitkiem waty bawełnianej.

Umieścić gilzę w aparacie ekstrakcyjnym (pkt 4.1) i ekstrahować przez sześć godzin eterem naftowym (pkt 3.1). Zebrać ekstrakt eterowy do suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki kamienia pumeksowego (

Oddestylować rozpuszczalnik. Suszyć pozostałość, umieszczając kolbę w suszarce (pkt 4.3) na półtorej godziny. Schłodzić w eksykatorze i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy olejów i tłuszczów (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg).

5.2.

Postępowanie B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki (zob. pkt 8.2), umieścić w zlewce o pojemności 400 ml lub w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml i dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.3) oraz kawałki kamienia pumeksowego. Przykryć zlewkę szkłem zegarkowym lub dopasować kolbę stożkową z chłodnicą zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do spokojnego wrzenia w małym płomieniu palnika lub na płycie grzejnej i utrzymywać wrzenie przez godzinę. Nie dopuszczać do osadzania się produktu na ścianach pojemnika.

Schłodzić i dodać pomocniczy materiał filtracyjny (pkt 3.4) w ilości zapobiegającej jakimkolwiek stratom oleju i tłuszczu podczas filtracji. Przefiltrować przez zwilżoną, beztłuszczową podwójną bibułę filtracyjną. Przemywać pozostałość zimną wodą do uzyskania obojętnego filtratu. Sprawdzić, czy filtrat nie zawiera śladów olejów lub tłuszczów. Ich obecność wskazuje na konieczność przeprowadzenia przed hydrolizą ekstrakcji eterem naftowym, przy zastosowaniu postępowania A.

Umieścić na szkle zegarkowym podwójną bibułę filtracyjną z pozostałością i suszyć przez 1,5 godziny w suszarce nawiewnej (pkt 4.3) w temperaturze 100 ± 3 °C.

Umieścić podwójną bibułę filtracyjną zawierającą suchą pozostałość w gilzie ekstrakcyjnej (pkt 4.2) i przykryć zwitkiem beztłuszczowej waty bawełnianej. Umieścić gilzę w aparacie ekstrakcyjnym (pkt 4.1) i postępować w sposób określony w pkt 5.1 akapity drugi i trzeci.

5.3.

Postępowanie A i ponowna ekstrakcja metodą B

W celu oznaczenia surowych olejów i tłuszczów w nasionach i owocach oleistych, a także w paszy, w której zawartość surowych olejów/tłuszczów jest wyższa niż 15 %, ekstrakcję należy przeprowadzić metodą A, a ponowną ekstrakcję – metodą B.

Oznacza to, że po ekstrakcji eterem naftowym (postępowanie A) pozostałość lub część pozostałości ponownie ekstrahuje się kwasem chlorowodorowym (procedura B). Zawartość surowych olejów i tłuszczów jest sumą wyniku postępowania A i B.

6. Wyrażanie wyników

Masę pozostałości wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie może przekraczać:

— 0,2 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości surowych olejów i tłuszczów niższej niż 5 %,

— 4,0 % względem najwyższego wyniku dla zawartości od 5 do 10 %,

— 0,4 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości wyższej niż 10 %.

8. Objaśnienia

8.1. Dla produktów o wysokiej zawartości olejów i tłuszczów, które są trudne do rozdrobnienia lub w przypadku których trudno jest uzyskać jednorodną zredukowaną próbkę badaną, postępować w sposób podany poniżej.

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 20 g próbki i zmieszać z co najmniej 10 g bezwodnego siarczanu sodu (pkt 3.2). Ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.1) w sposób określony w pkt 5.1. Otrzymany ekstrakt uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (pkt 3.1) i zmieszać. Pobrać 50 ml roztworu i przenieść do małej, suchej i zważonej kolby zawierającej kawałki kamienia pumeksowego. Oddestylować rozpuszczalnik, suszyć i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapit ostatni.

Usunąć rozpuszczalnik z pozostałości po ekstrakcji w gilzie, rozdrobnić pozostałość na 1 mm cząstki, ponownie umieścić w gilzie (nie dodawać siarczanu sodu) i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapity drugi i trzeci.

Zawartość olejów i tłuszczów obliczyć jako udział procentowy w próbce, według następującego wzoru:

gdzie:

masa w gramach pozostałości po pierwszej ekstrakcji (podwielokrotność ekstraktu)

masa w gramach pozostałości po drugiej ekstrakcji

8.2. Dla niektórych produktów (np. o niskiej zawartości olejów i tłuszczów) badaną próbkę można zwiększyć.

8.3. W przypadku karmy dla zwierząt domowych o wysokiej zawartości wody może wystąpić potrzeba zmieszania jej przed hydrolizą i ekstrakcją z bezwodnym siarczanem sodu, z zastosowaniem postępowania B.

8.4. W przypadku postępowania określonego w pkt 5.2 do przemywania pozostałości po filtracji skuteczniejsze może być użycie wody gorącej zamiast zimnej.

8.5. W przypadku niektórych pasz może być konieczne przedłużenie czasu suszenia wynoszącego 1,5 godziny. Należy jednak unikać nadmiernego suszenia, gdyż może to prowadzić do zaniżania wyników. Można również stosować kuchenki mikrofalowe.

H. OZNACZANIE WŁÓKNA SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości nietłuszczowych związków organicznych, które nie rozpuszczają się ani w środowisku kwaśnym, ani zasadowym i które zwyczajowo określa się mianem włókna surowego.

Metoda ta nie ma zastosowania w przypadku lignocelulozy i węgla roślinnego (cząstki zbyt drobne).

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę, w razie konieczności odtłuszczoną, poddaje się działaniu wrzących roztworów kwasu siarkowego i wodorotlenku potasu o odpowiednim stężeniu. Pozostałość jest rozdzielana przez filtrację na filtrze ze szkła spiekanego, przemywana, suszona, ważona i spopielana w temperaturze od 475 do 500 °C. Ubytek masy po spopielaniu odpowiada zawartości włókna surowego w badanej próbce.

3. Odczynniki

3.1. Kwas siarkowy, c = 0,13 mol/l

3.2. Substancja przeciwpieniąca (np. n-oktanol)

3.3. Pomocniczy materiał filtracyjny (Celit 545 lub równoważny), wyprażony w temperaturze 500 °C przez cztery godziny (pkt 8.6)

3.4. Aceton

3.5. Eter naftowy o temperaturze wrzenia od 40 do 60 °C

3.6. Kwas chlorowodorowy, c = 0,5 mol/l

3.7. Roztwór wodorotlenku potasu, c = 0,23 mol/l

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Urządzenie grzewcze do mineralizacji kwasem siarkowym i roztworem wodorotlenku potasu, wyposażone w podstawkę mocującą tygiel filtracyjny (pkt 4.2) i rurkę odprowadzającą z kranem służącą do odprowadzenia cieczy i próżni, ewentualnie ze sprzężonym powietrzem. Codziennie przed użyciem podgrzewa się urządzenie, przemywając je wrzącą wodą przez pięć minut.

4.2. Tygiel filtracyjny z filtrem ze szkła spiekanego o porach od 40 do 90 μm. Przed pierwszym użyciem ogrzewać przez kilka minut w temperaturze 500 °C i schłodzić (pkt 8.6).

4.3. Cylinder o pojemności co najmniej 270 ml z chłodnicą zwrotną, przystosowany do gotowania

4.4. Suszarka z termostatem

4.5. Piec muflowy z termostatem

4.6. Urządzenie do ekstrakcji składające się z podstawki mocującej tygiel filtracyjny (pkt 4.2) i rurki odprowadzającej z kranem, służącej do odprowadzenia cieczy i próżni

4.7. Pierścienie łączące, służące do połączenia urządzenia grzewczego (pkt 4.1) z tyglem filtracyjnym (pkt 4.2) i cylindrem (pkt 4.3) oraz do dołączenia zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6) i tygla

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g przygotowanej próbki do tygla (pkt 4.2) (zob. objaśnienia 9.1, 9.2 i 9.3) i dodać 1 g pomocniczego materiału filtracyjnego (pkt 3.3).

Połączyć urządzenie grzewcze (pkt 4.1) z tyglem filtracyjnym (pkt 4.2), a następnie dołączyć cylinder (pkt 4.3) do tygla. Wlać 150 ml wrzącego kwasu siarkowego (pkt 3.1) do cylindra połączonego z tyglem i, w razie potrzeby, dodać kilka kropli substancji przeciwpieniącej (pkt 3.2).

Doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez dokładnie 30 minut.

Otworzyć kran rurki odprowadzającej (pkt 4.1) i w warunkach próżni filtrować kwas siarkowy przez tygiel filtracyjny i przemywać pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami wrzącej wody, upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Zamknąć ujście kranu i wlać 150 ml wrzącego roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.7) do cylindra połączonego z tyglem i dodać kilka kropli substancji przeciwpieniącej (pkt 3.2). Doprowadzić ciecz do punktu wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez 30 minut. Przefiltrować i powtórzyć procedurę przemywania wykorzystaną w odniesieniu do kwasu siarkowego.

Po ostatnim przemyciu i wysuszeniu odłączyć tygiel i jego zawartość i podłączyć go do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6). W warunkach próżni przemywać pozostałość w tyglu trzema kolejnymi porcjami 25 ml acetonu (pkt 3.4), upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Wysuszyć tygiel do stałej masy w suszarce o temperaturze 130 °C. Po każdym suszeniu schłodzić w eksykatorze i niezwłocznie zważyć. Umieścić tygiel w piecu muflowym i spopielać do stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 2 mg) w temperaturze od 475 do 500 °C przez co najmniej 30 minut.

Przed ważeniem, po każdym ogrzewaniu, najpierw schłodzić w piecu, a następnie w eksykatorze.

Przeprowadzić test ślepej próby bez próbki. Ubytek masy po spopielaniu nie może przekraczać 4 mg.

6. Obliczanie wyników

Procentową zawartość włókna surowego w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

masa próbki w g

ubytek masy po spopieleniu w trakcie oznaczania, w g

ubytek masy po spopieleniu w trakcie próby ślepej, w g

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 0,6 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości włókna surowego niższej niż 10 %,

— 6 % względem wyższego wyniku, dla zawartości włókna surowego równej lub wyższej niż 10 %.

8. Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach nie może przekraczać:

— 1,0 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości włókna surowego niższej niż 10 %,

— 10 % względem wyższego wyniku, dla zawartości włókna surowego równej lub wyższej niż 10 %.

9. Objaśnienia

9.1. Pasze zawierające więcej niż 10 % tłuszczu surowego przed analizą należy odtłuścić eterem naftowym (pkt 3.5). Podłączyć tygiel filtracyjny (pkt 4.2) wraz z jego zawartością do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6), zastosować próżnię i przemyć pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego, upewniając się, że pozostałość jest sucha. Podłączyć tygiel wraz z jego zawartością do urządzenia grzewczego (pkt 4.1) i postępować w sposób określony w pkt 5.

9.2. Pasze zawierające tłuszcze, które nie mogą być bezpośrednio ekstrahowane eterem naftowym (pkt 3.5), odtłuścić w sposób określony w pkt 8.1 i ponownie odtłuścić po gotowaniu z kwasem. Po gotowaniu z kwasem, a następnie przemyciu podłączyć tygiel wraz z jego zawartością do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6) i przemyć trzykrotnie 30 ml porcjami acetonu, a następnie trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego. Przefiltrować do sucha w warunkach próżni i postępować w sposób określony w pkt 5, rozpoczynając od postępowania z wodorotlenkiem potasu.

9.3. Jeżeli pasza zawiera więcej niż 5 % węglanów, wyrażonych jako węglan wapnia, podłączyć tygiel (pkt 4.2) z odważoną próbką do urządzenia grzewczego (pkt 4.1). Przemyć próbkę trzykrotnie 30 ml porcjami kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6). Po dodaniu każdej porcji kwasu pozostawić próbkę na około minutę przed filtrowaniem. Przemyć 30 ml wody i postępować w sposób określony w pkt 5.

9.4. Jeżeli używana jest aparatura stojąca (kilka tygli podłączonych do jednego urządzenia grzewczego), nie należy wykonywać dwóch pojedynczych oznaczeń tej samej próbki w tej samej serii.

9.5. Jeżeli po gotowaniu filtrowanie roztworu kwasowego i zasadowego jest trudne, przepuścić sprężone powietrze przez rurkę podłączaną do urządzenia grzewczego i następnie kontynuować filtrowanie.

9.6. Temperatura spopielania nie może być wyższa niż 500 °C ze względu na wytrzymałość szklanego tygla filtracyjnego. Postępować w taki sposób, aby uniknąć szoku termicznego podczas ogrzewania i schładzania.

I. OZNACZANIE CUKRÓW

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości cukrów redukujących i całkowitej zawartości cukrów po inwersji, wyrażonych jako glukoza lub w razie potrzeby jako sacharoza, z zastosowaniem współczynnika 0,95. Metodę stosuje się do mieszanek paszowych. Dla innych pasz stosuje się specjalne metody. W razie potrzeby laktozę należy mierzyć oddzielnie, uwzględniając ją w obliczeniach.

Metoda ta ma być stosowana do oznaczania zawartości cukrów w celu obliczania wartości energetycznej paszy.

W przypadku gdy zawartość cukrów ma być oznaczona do innych celów, można zastosować inne metody analizy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Cukry ekstrahuje się w rozcieńczonym etanolu. Otrzymany roztwór klaruje się roztworami Carreza I i Carreza II. Po wyeliminowaniu etanolu zawartość cukrów przed i po inwersji oznacza się metodą Luff-Schoorla.

3. Odczynniki

3.1. Etanol, roztwór 40 % (v/v), gęstość: 0,948 g/ml przy temperaturze 20 °C, obojętny wobec fenoloftaleiny

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe (CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4. Roztwór 0,1 % (w/v) oranżu metylowego

3.5. Kwas chlorowodorowy, 4 mol/l

3.6. Kwas chlorowodorowy, 0,1 mol/l

3.7. Roztwór wodorotlenku sodu, 0,1 mol/l

3.8. Odczynnik Luff-Schoorla:

Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (pkt 3.8.2) do roztworu węglanu sodu (pkt 3.8.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (pkt 3.8.1) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować.

Sprawdzić stężenie otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), zob. pkt 5.4 akapit ostatni. Wartość pH roztworu musi wynosić około 9,4.

3.8.1. Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi Cu SO4 5H2O, wolnego od żelaza, w 100 ml wody.

3.8.2. Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego, C6H8O7•H2O w 50 ml wody.

3.8.3. Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w około 300 ml ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia.

3.9. Roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 mol/l

3.10. Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody. Gotować trzy minuty, pozostawić do schłodzenia, a jeżeli to konieczne, dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego.

3.11. Kwas siarkowy, 3 mol/l

3.12. 30 % roztwór jodku potasu (w/v)

3.13. Granulki kamienia pumeksowego gotowane w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.14. 3-metylobutan-1-ol

4. Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min

5. Sposób postępowania

5.1.

Ekstrakcja próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 200 ml etanolu (pkt 3.1) i mieszać w tumblerze przez godzinę. Dodać 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2) i mieszać przez ok. 30 sekund. Dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3) i ponownie mieszać przez minutę. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (pkt 3.1), zhomogenizować i przefiltrować. Pobrać 200 ml filtratu i odparować do około połowy objętości w celu usunięcia większości etanolu. Przenieść ilościowo pozostałość po odparowaniu do kolby miarowej o pojemności 200 ml z użyciem ciepłej wody, schłodzić, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zhomogenizować i, jeżeli to konieczne, przefiltrować. Roztwór ten będzie użyty do oznaczenia zawartości cukrów redukujących i, po inwersji, całkowitej zawartości cukrów.

5.2.

Oznaczanie cukrów redukujących

Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy w próbce.

5.3.

Oznaczanie całkowitej zawartości cukru po inwersji

Używając pipety, pobrać 50 ml roztworu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Dodać kilka kropli roztworu oranżu metylowego (pkt 3.4) i następnie, ciągle mieszając, dodawać ostrożnie kwas chlorowodorowy (pkt 3.5) aż do zmiany barwy cieczy na mocno czerwoną. Dodać 15 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6) i zanurzyć kolbę we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Szybko schłodzić do temperatury około 20 °C i dodać 15 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.7). Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą i zhomogenizować. Pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy lub, w stosownych przypadkach, sacharozy, mnożąc przez współczynnik 0,95.

5.4.

Miareczkowanie metodą Luff-Schoorla

Odmierzyć pipetą 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.8) i przenieść do kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml; dodać dokładnie 25 ml klarownego roztworu cukru. Dodać dwie granulki kamienia pumeksowego (pkt 3.13), ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około dwóch minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby Erlenmeyera. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około pięciu minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.12) i od razu po tej czynności (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.11). Miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (pkt 3.9) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (pkt 3.10) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.8) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.12) i 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.11), bez gotowania.

6. Obliczanie wyników

Wykorzystując tabelę, określić ilość glukozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w ml tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Postępowanie specjalne

7.1. W przypadku pasz bogatych w melasę i innych pasz, które nie są szczególnie jednorodne, odważyć 20 g próbki i umieścić z 500 ml wody w kolbie miarowej o pojemności 1 l. Mieszać przez godzinę w tumblerze. Sklarować roztworami Carreza I (pkt 3.2) i II (pkt 3.3) w sposób określony w pkt 5.1, z użyciem czterokrotnie większych ilości każdego odczynnika. Uzupełnić kolbę do objętości 80 % etanolem (v/v).

Zhomogenizować i przefiltrować. Usunąć etanol w sposób określony w pkt 5.1. Jeżeli nie ma dekstrynizowanej skrobi, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą destylowaną.

7.2. W przypadku melasy i materiałów paszowych bogatych w cukier i prawie wolnych od skrobi (np. chleb świętojański, suszone krajane buraki ćwikłowe itp.), odważyć 5 g próbki, umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml, dodać 200 ml wody destylowanej, mieszać w tumblerze przez godzinę lub, jeśli to konieczne, dłużej. Roztwór klarować roztworami Carreza I (3.2) i II (pkt 3.3) w sposób określony w pkt 5.1. Uzupełnić do pełnej objętości kolby zimną wodą, zhomogenizować i przefiltrować. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3 w celu określenia całkowitej zawartości cukrów.

8. Objaśnienia

8.1. Aby zapobiec powstawaniu piany, wskazane jest dodanie (niezależnie od objętości) około 1 ml 3-metylobutan-1-olu (pkt 3.14) przed gotowaniem z odczynnikiem Luff-Schoorla.

8.2. Różnica pomiędzy zawartością całkowitą cukrów po inwersji, wyrażonych jako glukoza, a zawartością cukrów redukujących, wyrażonych jako glukoza, pomnożona przez 0,95 daje procentową zawartość sacharozy.

8.3. Aby oznaczyć zawartość cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, można zastosować dwie następujące metody:

8.3.1. Dla szacunkowych obliczeń pomnożyć zawartość laktozy oznaczoną inną metodą przez 0,675 i uzyskany wynik odjąć od zawartości cukrów redukujących.

8.3.2. Aby dokładnie obliczyć zawartość cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, ta sama próbka musi być użyta do dwóch końcowych oznaczeń. Jedną analizę przeprowadza się na części roztworu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1, drugą na części roztworu otrzymanego podczas oznaczania laktozy metodą służącą do jej oznaczania (po fermentacji innych rodzajów cukrów i sklarowaniu).

W obu przypadkach ilość cukru jest oznaczana metodą Luff-Schoorla i przeliczana na mg glukozy. Jedna wartość jest odejmowana od drugiej, a różnica jest wyrażana jako udział procentowy w próbce.

Przykład

Dwie pobrane objętości odpowiadają próbce o masie 250 mg dla każdego oznaczenia.

W pierwszym przypadku zużyte zostało 17 ml roztworu tiosiarczanu sodu o stężeniu 0,1 mol/l, co odpowiada 44,2 mg glukozy, w drugim przypadku 11 ml odpowiada 27,6 mg glukozy.

Różnica wynosi 16,6 mg glukozy.

Zawartość cukrów redukujących (z wyłączeniem laktozy), w przeliczeniu na glukozę, wynosi zatem:

Tabela wartości dla 25 ml odczynnika Luff-Schoorla

ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, podgrzewanie przez dwie minuty, gotowanie przez 10 minut

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glukoza, fruktoza, cukry inwertowane

C6 H12 O6

Laktoza

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

różnica

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

J. OZNACZANIE LAKTOZY

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości laktozy w paszach zawierających ponad 0,5 % laktozy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Cukry są rozpuszczane w wodzie. Roztwór jest poddawany fermentacji w obecności drożdży Saccharomyces cerevisiae, które nie rozkładają laktozy. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu zawartość laktozy w filtracie jest oznaczana metodą Luff-Schoorla.

3. Odczynniki

3.1. Zawiesina Saccharomyces cerevisiae: 25 g świeżych drożdży umieścić w 100 ml wody. Zawiesinę przechowywać w lodówce nie dłużej niż przez tydzień od jej sporządzenia.

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3 COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe (CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4. Odczynnik Luff-Schoorla:

Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (pkt 3.4.2) do roztworu węglanu sodu (pkt 3.4.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (pkt 3.4.1) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować. Sprawdzić stężenie otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Wartość pH roztworu musi wynosić około 9,4.

3.4.1. Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi Cu SO4 5H2O wolnego od żelaza w 100 ml wody.

3.4.2. Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego C6H8O7 • H2O w 50 ml wody.

3.4.3. Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w około 300 ml ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia.

3.5. Granulki kamienia pumeksowego gotowane w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.6. 30 % roztwór jodku potasu (w/v)

3.7. Kwas siarkowy, 3 mol/l

3.8. Roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 mol/l

3.9. Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody. Gotować trzy minuty, pozostawić do schłodzenia, a jeżeli to konieczne, dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego.

4. Aparatura i sprzęt

Łaźnia wodna z termostatem umożliwiającym utrzymanie temperatury od 38 do 40 °C.

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać od 25 do 30 ml wody. Wstawić kolbę do wrzącej łaźni wodnej na 30 minut, a następnie ostudzić do temperatury około 35 °C. Dodać 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1) i zhomogenizować. Pozostawić kolbę na dwie godziny w łaźni wodnej o temperaturze od 38 do 40 °C. Schłodzić do temperatury około 20 °C.

Dodać 2,5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2) i mieszać przez 30 sekund, następnie dodać 2,5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3) i ponownie mieszać przez 30 sekund. Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą, zmieszać i przefiltrować. Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml filtratu, który powinien zawierać od 40 do 80 mg laktozy, i umieścić go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml. W miarę potrzeby uzupełnić do objętości 25 ml wodą.

W ten sam sposób przeprowadzić próbę ślepą z 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1). Oznaczyć zawartość laktozy według Luff-Schoorla, w następujący sposób: dodać 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.4) i dwie granulki kamienia pumeksowego (pkt 3.5). Ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około dwóch minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby Erlenmeyera. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około pięciu minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.6) i niezwłocznie (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.7). Miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (pkt 3.8) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (pkt 3.9) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.4) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.6) i 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.7), bez gotowania.

6. Obliczanie wyników

Wykorzystując załączoną tabelę, określić ilość laktozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w ml tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l.

Wynik wyrazić jako udział procentowy bezwodnej laktozy w próbce.

7. Objaśnienia

1. W przypadku produktów zawierających ponad 40 % cukrów fermentujących dodać więcej niż 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1).

2. W paszach o obniżonej zawartości laktozy (np. w mleku dla kotów) laktozę przekształca się we fruktozę, która nie jest całkowicie sfermentowana w ciągu 2 godzin, co daje wyższe lub fałszywie pozytywne wyniki (ponieważ pozostałości fruktozy pozostają w ekstrakcie).

Tabela wartości dla 25 ml odczynnika Luff-Schoorla

ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, podgrzewanie przez dwie minuty, gotowanie przez 10 minut

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glukoza, fruktoza, cukry inwertowane

C6 H12 O6

Laktoza

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

różnica

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

K. OZNACZANIE SKROBI

- METODA POLARYMETRYCZNA -

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości skrobi i wysokocząsteczkowych produktów jej degradacji w paszach w celu sprawdzenia zgodności z zadeklarowaną wartością energetyczną (przepisy zawarte w załączniku VII) oraz rozporządzeniem (WE) nr 767/2009.

Metoda ta ma być stosowana do oznaczania zawartości skrobi w celu obliczania wartości energetycznej paszy.

W przypadku gdy zawartość skrobi ma być oznaczona do innych celów, można zastosować inne metody analizy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Metoda składa się z dwóch oznaczeń. W pierwszym oznaczeniu próbka jest traktowana rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się polarymetrycznie skręcalność optyczną roztworu.

W drugim oznaczeniu próbka jest ekstrahowana 40 % etanolem. Po zakwaszeniu filtratu kwasem chlorowodorowym, sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się skręcalność optyczną, tak jak w pierwszym oznaczeniu.

Różnica pomiędzy dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, daje zawartość skrobi w próbce.

3. Odczynniki

3.1. Kwas chlorowodorowy, roztwór 25 % (w/w), gęstość: 1,126 g/ml

3.2. Kwas chlorowodorowy, roztwór 1,13 % (w/v)

Stężenie należy sprawdzić poprzez miareczkowanie przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu 0,1 mol/l w obecności czerwieni metylowej 0,1 % (w/v) w 94 % (v/v) etanolu. Do neutralizacji 10 ml potrzeba 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.5. Etanol, roztwór 40 % (v/v), gęstość: 0,948 g/ml w temperaturze 20 °C

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 250 ml ze szlifem szklanym i chłodnicą zwrotną

4.2. Polarymetr lub sacharymetr

5. Sposób postępowania

5.1.

Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm.

5.2. Oznaczanie całkowitej skręcalności optycznej (P lub S) (zob. objaśnienia 7.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g rozdrobnionej próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.2), wstrząsnąć do równomiernego rozprowadzenia badanej próbki i dodać następną porcję 25 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2). Kolbę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Aby zapobiec aglomeracji, przez pierwsze trzy minuty nieprzerwanie i energicznie wstrząsać kolbą. Ilość wody w łaźni wodnej musi być wystarczająca, aby pozostała ona w stanie wrzenia, kiedy kolba zostanie do niej włożona. Nie należy wyjmować kolby z wody w trakcie wstrząsania. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z łaźni wodnej, dodać 30 ml zimnej wody i natychmiast schłodzić do temperatury 20 °C.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.3) i wstrząsać przez ok. 30 sekund. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.4) i ponownie wstrząsać przez ok. 30 sekund. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać i przefiltrować. W przypadku gdy filtrat nie jest idealnie klarowny (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczanie z użyciem większej ilości roztworów Carreza I i II, np. 10 ml.

Zmierzyć skręcalność optyczną roztworu w 200 mm rurce przy zastosowaniu polarymetru lub sacharymetru.

5.3.

Oznaczanie skręcalności optycznej (P’ lub S’) substancji rozpuszczonych w 40 % etanolu

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml i dodać około 80 ml etanolu (3.5) (zob. objaśnienia 7.2). Pozostawić kolbę na godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie sześciokrotnie energicznie wytrząsnąć kolbą, tak aby badana próbka została dobrze zmieszana z etanolem. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (pkt 3.5), zmieszać i przefiltrować.

Pobrać pipetą 50 ml filtratu (co jest równe 2,5 g próbki) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 2,1 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) i energicznie wstrząsnąć. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera i kolbę tę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Po dokładnie 15 minutach wyjąć kolbę Erlenmeyera z łaźni, przenieść zawartość do kolby miarowej o pojemności 100 ml, spłukując kolbę Erlenmeyera niewielką ilością zimnej wody, i schłodzić do temperatury 20 °C.

Sklarować z użyciem roztworów Carreza I (pkt 3.3) i Carreza II (pkt 3.4), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać, przefiltrować i zmierzyć skręcalność optyczną w sposób określony w pkt 5.2 akapity drugi i trzeci.

6. Obliczanie wyników

Zawartość skrobi (w %) oblicza się według następujących wzorów:

6.1.

Pomiary z użyciem polarymetru

całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych

P’

skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczonych w 40 % (V/V) etanolu

skręcalność właściwa czystej skrobi. Wartości liczbowe przyjęte dla tego współczynnika są następujące:

+ 185,9°

skrobia ryżowa

+ 185,7°

skrobia ziemniaczana

+ 184,6°

skrobia kukurydziana

+ 182,7°

skrobia pszenna

+ 181,5°

skrobia jęczmienna

+ 181,3°

skrobia owsiana

+ 184,0°

inne typy skrobi i jej mieszaniny w mieszankach paszowych

6.2.

Pomiary z użyciem sacharymetru

całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych

skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych substancji rozpuszczonych w 40 % (v/v) etanolu

masa w g sacharozy w 100 ml wody ulegająca skręcalności optycznej 100 stopni sacharymetrycznych podczas pomiaru z użyciem rurki o długości 200 mm

16,29 g dla sacharymetrów francuskich

26,00 g dla sacharymetrów niemieckich

20,00 g dla sacharymetrów połączonych

skręcalność właściwa czystej skrobi (zob. pkt 6.1)

6.3.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości skrobi niższej niż 40 % i 1 % względem zawartości skrobi równej lub wyższej niż 40 %.

7. Objaśnienia

7.1. Jeżeli próbka zawiera więcej niż 6 % węglanów, w przeliczeniu na węglan wapnia, należy rozłożyć je przy użyciu odpowiedniej ilości rozcieńczonego kwasu siarkowego przed określeniem całkowitej skręcalności optycznej.

7.2. W przypadku produktów o dużej zawartości laktozy, takich jak serwatka w proszku lub mleko odtłuszczone w proszku, postępować w następujący sposób: po dodaniu 80 ml etanolu (pkt 3.5) dopasować chłodnicę zwrotną do kolby i kolbę tę zanurzyć w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 30 minut. Pozostawić do schłodzenia i kontynuować analizę w sposób określony w pkt 5.3.

7.3. Następujące materiały paszowe – w przypadku obecności w znacznych ilościach w paszy – powodują interferencje podczas określania zawartości skrobi metodą polarymetryczną i mogą wpływać na otrzymywanie nieprawidłowych wyników:

— produkty z buraków cukrowych, takie jak wysłodki buraczane, melasa buraczana, wysłodki buraczane melasowane, wywar melasowy z buraków (cukrowych), cukier (buraczany),

— miazga (pulpa, wysłodki) cytrusowa,

— siemię lniane, wytłoki z siemienia lnianego, siemię lniane ekstrahowane,

— nasiona rzepaku, makuch rzepakowy, ekstrahowane nasiona rzepaku, łuski nasion rzepaku,

— nasiona słonecznika, ekstrahowane nasiona słonecznika, nasiona słonecznika częściowo łuskane, ekstrahowane,

— wytłoki z kopry, kopra ekstrahowana,

— miazga (pulpa) ziemniaczana,

— drożdże odwodnione,

— produkty bogate w inulinę, a w szczególności krajanka i mączka z karczochów jerozolimskich,

— skwarki,

— produkty sojowe.

W takich przypadkach można zastosować metodę analizy przewidzianą w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 121/2008 (

). Metoda ta może być również stosowana w paszy zawierającej mniej niż 1 % skrobi.

L. OZNACZANIE POPIOŁU SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości popiołu surowego w paszach.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest spopielana w temperaturze 550 °C, a pozostałość jest ważona.

3. Odczynniki

20 % roztwór azotanu amonu (w/v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Płyta grzejna

4.2. Elektryczny piec muflowy z termostatem

4.3. Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spalań, prostokątne (ok. 60 × 40 × 25 mm) lub okrągłe (średnica: 60–75 mm, wysokość: 20–40 mm).

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki (2,5 w przypadku substancji pęczniejących) i umieścić w tyglu do spalań, który został podgrzany do temperatury 550 °C, schłodzony i wytarowany. Tygiel postawić na płycie grzejnej i ogrzewać stopniowo aż do zwęglenia substancji. Spopielić zgodnie z pkt 5.1 lub 5.2.

5.1. Wstawić tygiel do skalibrowanego pieca muflowego o temperaturze ustawionej na 550 °C. Utrzymywać w tej temperaturze aż do uzyskania popiołu o barwie białej, jasnoszarej lub czerwonawej, w którym nie widać cząstek zawierających węgiel. Umieścić tygiel w eksykatorze, pozostawić do schłodzenia i niezwłocznie zważyć.

5.2. Wstawić tygiel do skalibrowanego pieca muflowego o temperaturze ustawionej na 550 °C. Spopielać przez 3 godziny. Umieścić tygiel w eksykatorze, pozostawić do schłodzenia i niezwłocznie zważyć. Ponownie spopielać przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy popiołu (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg).

6. Obliczanie wyników

Masę pozostałości obliczyć, odejmując tarę.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Objaśnienia

7.1.

Substancje, które trudno się spopielają, należy wstępnie spopielać co najmniej przez trzy godziny, schłodzić, a następnie dodać do nich – ostrożnie, w taki sposób, aby nie spowodować strat popiołu i tworzenia się zbryleń – kilka kropli 20 % roztworu azotanu amonu lub wody. Po wysuszeniu kontynuować zwęglanie w piecu. Powtarzać czynności w razie potrzeby aż do całkowitego spopielenia.

7.2. W przypadku substancji, które trudno poddają się postępowaniu określonemu w pkt 7.1, postępuje się w następujący sposób: po spopielaniu przez trzy godziny popiół umieścić w ciepłej wodzie i przefiltrować przez mały, bezpopiołowy filtr. Spopielić filtr z zawartością w tyglu. Filtrat umieścić w schłodzonym tyglu, odparować do wyschnięcia, spopielić i zważyć.

7.3. W przypadku olejów i tłuszczów należy dokładnie odważyć próbkę o masie 25 g i umieścić ją w tyglu o odpowiedniej wielkości. Zwęglić, przenosząc płomień na substancję skrawkiem sączka bezpopiołowego. Po spaleniu pozostałość zwilżyć jak najmniejszą ilością wody. Wysuszyć i spopielać w sposób określony w pkt 5.

M. OZNACZANIE POPIOŁU NIEROZPUSZCZALNEGO W KWASIE CHLOROWODOROWYM

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości substancji mineralnych nierozpuszczalnych w kwasie chlorowodorowym w paszach. W zależności od rodzaju próbki stosuje się dwie metody.

1.1.

Metoda A: mająca zastosowanie do organicznych materiałów paszowych i do większości mieszanek paszowych;

1.2.

Metoda B: mająca zastosowanie do mieszanek paszowych i mieszanin mineralnych oraz do mieszanek paszowych zawierających substancje nierozpuszczalne w kwasie chlorowodorowym w ilości wyższej niż 1 %, co sprawdza się, stosując wcześniej metodę A.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1.

Metoda A: próbka jest spopielana, popiół gotowany w kwasie chlorowodorowym, a nierozpuszczalna pozostałość jest filtrowana i ważona.

2.2.

Metoda B: próbka jest traktowana kwasem chlorowodorowym. Roztwór się filtruje, pozostałość spopiela i z otrzymanym popiołem postępuje się w sposób opisany w metodzie A.

3. Odczynniki

3.1. Kwas chlorowodorowy, 3 mol/l

3.2. 20 % roztwór kwasu trichlorooctowego (w/v)

3.3. 1 % roztwór kwasu trichlorooctowego (w/v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Płyta grzejna

4.2. Elektryczny piec muflowy z termostatem

4.3. Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spalań, prostokątne (ok. 60 × 40 × 25 mm) lub okrągłe (średnica: 60–75 mm, wysokość: 20–40 mm)

4.4. Filtry bezpopiołowe

5. Sposób postępowania

5.1.

Metoda A:

Spopielić próbkę metodą opisaną w odniesieniu do oznaczania popiołu surowego. Popiół uzyskany w wyniku zastosowanej analizy może być także wykorzystany do badania.

Popiół przenieść do zlewki o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Powoli doprowadzić do wrzenia i gotować ostrożnie przez 15 minut. Przefiltrować ciepły roztwór przez sączek bezpopiołowy i przemywać pozostałość gorącą wodą, aż reakcja z kwasem przestanie być widoczna. Wysuszyć filtr zawierający pozostałość i spopielić go w wytarowanym tyglu w temperaturze nie niższej niż 550 °C i nie wyższej niż 700 °C. Ochłodzić w eksykatorze i zważyć.

5.2.

Metoda B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki i umieścić w zlewce o pojemności od 250 do 400 ml. Dodać kolejno 25 ml wody i 25 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1), wymieszać i odczekać, aż roztwór przestanie się burzyć. Dodać kolejne 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Odczekać do ulotnienia się gazu, następnie umieścić zlewkę we wrzącej łaźni wodnej i trzymać ją tam przez co najmniej 30 minut, w celu całkowitej hydrolizy skrobi. Ciepły roztwór przefiltrować przez sączek bezpopiołowy i przemyć go 50 ml ciepłej wody (zob. objaśnienia pkt 7). Filtr z pozostałością umieścić w tyglu do spalań, wysuszyć i spopielać w temperaturze nie niższej niż 550 °C i nie wyższej niż 700 °C. Popiół przenieść do zlewki o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Kontynuować czynności opisane w pkt 5.1 akapit drugi.

6. Obliczanie wyników

Masę pozostałości obliczyć, odejmując tarę. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Objaśnienia

Jeżeli filtracja ma trudny przebieg, zaleca się powtórne przeprowadzenie analizy, zastępując 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) 50 ml roztworu 20 % (w/v) kwasu trichlorooctowego (pkt 3.2) i przemywając filtr ciepłym 1 % roztworem kwasu trichlorooctowego (pkt 3.3).

N. OZNACZANIE CAŁKOWITEJ ZAWARTOŚCI FOSFORU

Fosfor całkowity ma być oznaczany z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 15510 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, kobaltu, molibdenu i ołowiu z zastosowaniem ICP-AES lub

— metody analizy przewidzianej w normie EN 15621 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, siarki, żelaza, cynku, miedzi, manganu i kobaltu po mineralizacji ciśnieniowej metodą ICP-AES lub

— metody fotometrycznej, jak opisano poniżej.

METODA FOTOMETRYCZNA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania całkowitej zawartości fosforu w paszy. Metoda ta jest w szczególności odpowiednia do analizy paszy o niskiej zawartości fosforu. W niektórych przypadkach (produkty bogate w fosfor) dopuszcza się stosowanie metody grawimetrycznej.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana poprzez suche spalanie (w przypadku pasz organicznych) lub przez rozpuszczenie kwasem (w przypadku związków mineralnych i pasz płynnych), a następnie wprowadzana do kwaśnego roztworu. Roztwór jest traktowany odczynnikiem molibdenowanadowym. Gęstość optyczna utworzonego żółtego roztworu jest mierzona w spektrofotometrze przy 430 nm.

3. Odczynniki

3.1. Węglan wapnia

3.2. Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,10 g/ml (ok. 6 mol/l)

3.3. Kwas azotowy, ρ20 = 1,045 g/ml

3.4. Kwas azotowy, ρ20 = od 1,38 do 1,42 g/ml

3.5. Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml

3.6. Odczynnik molibdenowanadowy: zmieszać 200 ml roztworu heptamolibdenianu amonu (pkt 3.6.1), 200 ml roztworu metawanadanu amonu (pkt 3.6.2) i 134 ml kwasu azotowego (pkt 3.4) w kolbie miarowej o pojemności 1 l. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą.

3.6.1. Roztwór heptamolibdenianu amonu: rozpuścić w gorącej wodzie 100 g heptamolibdenianu amonu (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Dodać 10 ml amoniaku (o gęstości 0,91 g/ml) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.6.2. Roztwór metawanadanu amonu: 2,35 g metawanadanu amonu NH4VO3 rozpuścić w 400 ml gorącej wody. Stale mieszając, dodawać powoli 20 ml rozcieńczonego kwasu azotowego (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.7. Roztwór wzorcowy fosforu o stężeniu 1 mg/ml: rozpuścić 4,387 g diwodorofosforanu potasu KH2PO4w wodzie. Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spopielania

4.2. Elektryczny piec muflowy z termostatem nastawionym na temperaturę 550 °C

4.3. Kolba Kjeldahla o pojemności 250 ml

4.4. Kolby i pipety miarowe

4.5. Spektrofotometr

4.6. Probówki o średnicy około 16 mm i pojemności od 25 do 30 ml z korkami stopniowanymi do średnicy 14,5 mm

5. Sposób postępowania

5.1.

Przygotowanie roztworu

W zależności od rodzaju próbki przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2.

5.1.1.

Zwykły sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, co najmniej 1 g próbki. Umieścić badaną próbkę w kolbie Kjeldahla, dodać 20 ml kwasu siarkowego (3.5), wstrząsnąć do całkowitego nasycenia kwasem i nie dopuścić do przyklejania cząstek do ścianek kolby, podgrzać i utrzymywać w temperaturze wrzenia przez 10 minut. Nieznacznie schłodzić, dodać 2 ml kwasu azotowego (pkt 3.4), ostrożnie podgrzać, ponownie nieznacznie schłodzić i dodać nieco więcej kwasu azotowego (pkt 3.4), a następnie ponownie doprowadzić do wrzenia. Powtarzać te czynności aż do uzyskania bezbarwnego roztworu. Schłodzić, dodać trochę wody, zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukać kolbę Kjeldahla gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.2.

Próbki zawierające substancje organiczne, wolne od diwodorofosforanów magnezu i wapnia

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 2,5 g próbki i umieścić w tyglu do spopielania. Zmieszać dokładnie próbkę badaną z 1 g węglanu wapnia (pkt 3.1). Spopielać w piecu w temperaturze 550 °C do uzyskania popiołu o białej lub szarej barwie (niewielka ilość węgla drzewnego nie ma znaczenia). Przenieść popiół do zlewki o pojemności 250 ml. Dodać 20 ml wody i kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2) aż do zaprzestania pienienia się. Następnie dodać kolejne 10 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2). Umieścić zlewkę na łaźni piaskowej i odparować do wyschnięcia, aby uczynić krzemionkę nierozpuszczalną. Pozostałość rozpuścić w 10 ml kwasu azotowego (pkt 3.3) i gotować na łaźni piaskowej lub płycie grzejnej przez 5 minut, nie doprowadzając do zupełnego odparowania cieczy. Zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukując kilkakrotnie zlewkę gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, zhomogenizować i przefiltrować.

5.2.

Wywołanie zabarwienia i pomiar gęstości optycznej

Rozcieńczyć podwielokrotną część filtratu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2 do uzyskania stężenia fosforu nie większego niż 40 μg/ml. Umieścić 10 ml tego roztworu w probówce (pkt 4.6) i dodać 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6). Homogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 °C. Zmierzyć gęstość optyczną w spektrofotometrze przy 430 nm w stosunku do roztworu otrzymanego przez dodanie 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6) do 10 ml wody.

5.3.

Krzywa wzorcowa

Z roztworu wzorcowego (pkt 3.7) przygotować roztwory zawierające odpowiednio 5, 10, 20, 30 i 40 μg fosforu w 1 ml. Pobrać 10 ml każdego z tych roztworów i dodać do nich po 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6). Zhomogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 °C. Zmierzyć gęstość optyczną w sposób określony w pkt 5.2. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając wartości gęstości optycznej w stosunku do odpowiadających jej ilości fosforu. W zakresie stężeń od 0 do 40 μg/ml krzywa jest liniowa.

6. Obliczanie wyników

Określić zawartość fosforu w badanej próbce z zastosowaniem krzywej wzorcowej.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 3 % względem wyższego wyniku, dla zawartości fosforu niższej niż 5 %,

— 0,15 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości fosforu równej lub wyższej niż 5 %.

O. OZNACZANIE CHLORU Z CHLORKÓW

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości chloru w chlorkach, które są rozpuszczalne w wodzie, umownie wyrażanego jako chlorek sodu. Metodę tę stosuje się do wszystkich pasz.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Chlorki są rozpuszczane w wodzie. Jeżeli badany produkt zawiera substancje organiczne, roztwór jest klarowany. Po nieznacznym zakwaszeniu kwasem azotowym chlorki strąca się w postaci chlorku srebra przy użyciu roztworu azotanu srebra. Nadmiar azotanu srebra jest miareczkowany roztworem tiocyjanianu amonu według metody Volharda.

3. Odczynniki

3.1. Roztwór tiocyjanianu amonu 0,1 mol/l

3.2. Roztwór azotanu srebra 0,1 mol/l

3.3. Nasycony roztwór siarczanu amonu i żelaza (NH4)Fe(SO4)2

3.4. Kwas azotowy, gęstość: 1,38 g/ml

3.5. Eter dietylowy

3.6. Aceton

3.7. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3COO)2·2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.8. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4Fe(CN)6·3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.9. Węgiel aktywny, wolny od chlorków i nieabsorbujący chlorków

4. Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min

5. Sposób postępowania

5.1.

Przygotowanie roztworu

Zależnie od rodzaju próbki, przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3.

W tym samym czasie przeprowadzić próbę ślepą, pomijając analizowaną próbkę.

5.1.1.

Próbki niezawierające substancji organicznej

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, nie więcej niż 10 g próbki zawierającej nie więcej niż 3 g chloru w postaci chlorków. Odważkę umieścić z 400 ml wody o temperaturze około 20 °C w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Mieszać przez 30 minut w tumblerze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.2.

Próbki zawierające substancje organiczne, z wyłączeniem produktów wymienionych w pkt 5.1.3

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i wraz z 1 g węgla aktywnego umieścić w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody o temperaturze około 20 °C i 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.7), mieszać przez 30 sekund i dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.8). Mieszać przez 30 minut w tumblerze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.3.

Pasze po obróbce cieplnej, makuchy lniane, mączka lniana, produkty bogate w mączkę lnianą i inne produkty bogate w śluz lub substancje koloidalne (np. dekstrynizowana skrobia)

Przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.2, ale nie filtrować. Zdekantować (w razie potrzeby odwirować), pobrać 100 ml płynnego supernatantu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 200 ml. Zmieszać z acetonem (pkt 3.6) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym rozpuszczalnikiem, zhomogenizować i przefiltrować.

5.2.

Miareczkowanie

W zależności od przewidywanej zawartości chlorku przenieść pipetą do kolby Erlenmeyera od 25 do 100 ml filtratu, otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3. Podwielokrotna część nie może zawierać więcej niż 150 mg chloru (Cl). Rozcieńczyć w razie potrzeby wodą do objętości nie mniejszej niż 50 ml, dodać 5 ml kwasu azotowego (pkt 3.4), 2 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu i żelaza (pkt 3.3) i dwie krople roztworu tiocyjanianu amonu (pkt 3.1) przeniesionego z zastosowaniem biurety wypełnionej do znaku 0. Stosując biuretę, przenieść roztwór azotanu srebra (pkt 3.2), tak aby nadmiar wyniósł 5 ml. Dodać 5 ml eteru dietylowego (pkt 3.5) i mocno wstrząsać do skoagulowania się osadu. Nadmiar azotanu srebra miareczkować roztworem tiocyjanianu amonu (pkt 3.1) aż do uzyskania czerwonobrązowego odcienia utrzymującego się przez minutę.

6. Obliczanie wyników

Ilość chlorku (X), wyrażonego jako udział procentowy chlorku sodu, oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

objętość w ml dodanego roztworu azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l

objętość w ml użytego do miareczkowania roztworu tiocyjanianu amonu o stężeniu 0,1 mol/l

masa w g próbki w podwielokrotnej części

Jeżeli próba ślepa wykaże, że roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l został zużyty, odjąć jego objętość od objętości (V1 – V2).

7. Objaśnienia

7.1. Można także zastosować miareczkowanie potencjometryczne lub amperometryczne.

7.2. W przypadku produktów bardzo bogatych w oleje i tłuszcze najpierw odtłuścić je eterem dietylowym lub eterem naftowym.

7.3. W przypadku mączki rybnej miareczkowanie można prowadzić metodą Mohra.

P. OZNACZANIE WĘGLANÓW

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości węglanów, umownie wyrażanych jako węglan wapnia, w paszy, z wyjątkiem paszy, w której występuje węglan żelaza.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Węglany rozkłada się kwasem chlorowodorowym. Powstały dwutlenek węgla zbiera się do rurki pomiarowej, a jego objętość jest porównywana z objętością uwolnioną ze znanej ilości węglanu wapnia w tych samych warunkach.

3. Odczynniki

3.1. Kwas chlorowodorowy, gęstość 1,10 g/ml.

3.2. Czysty węglan wapnia.

3.3. Kwas siarkowy o stężeniu ok. 0,05 mol/l, zabarwiony czerwienią metylową.

4. Aparatura i sprzęt

Aparat Scheiblera-Dietricha (zob. schemat w dodatku) lub równoważne aparaty (kalcymetr).

5. Sposób postępowania

W zależności od zawartości węglanów w próbce zważyć próbkę do badania o masie:

a) 0,5 g w przypadku produktów zawierających od 50 do 100 % węglanów, wyrażanych jako węglan wapnia;

b) 1 g w przypadku produktów zawierających od 40 do 50 % węglanów, wyrażanych jako węglan wapnia;

c) 2 do 3 g w przypadku innych produktów.

Do badanej próbki dodaje się kwas chlorowodorowy (pkt 3.1 powyżej) w celu rozkładu wszystkich występujących węglanów. Objętość dwutlenku węgla jest mierzona za pomocą aparatu Scheiblera-Dietricha lub równoważnego aparatu (kalcymetru) i porównuje się ją z objętością dwutlenku węgla wytworzoną przez 0,5 g czystego węglanu wapnia (pkt 3.2 powyżej).

Wszystkie oznaczania przeprowadza się w tych samych warunkach, aby uniknąć korekt z tytułu różnic temperatury i ciśnienia. Oznaczanie najlepiej przeprowadzić w pomieszczeniu z regulacją temperatury.

Procedurę z wykorzystaniem aparatu Scheiblera-Dietricha opisano szczegółowo w dodatku.

6. Obliczenia

Wyrażoną jako czysty węglan wapnia zawartość węglanów oblicza się według następującego wzoru:

X =

V × 100

V1 × 2 m

gdzie:

zawartość w % (w/w) węglanów w próbce wyrażona jako węglan wapnia

ilość CO2 w ml uwolniona z badanej próbki

ilość CO2 w ml uwolniona z 0,5 g CaCO3

masa w gramach badanej próbki.

7. Objaśnienia

7.1. Jeżeli stosowany jest aparat Scheiblera-Dietricha, a próbka waży więcej niż 2 g, należy najpierw umieścić 15 ml wody destylowanej w kolbie (element 4 na schemacie w dodatku poniżej) i zmieszać przed rozpoczęciem badania, dodając kwas chlorowodorowy (pkt 3.1 powyżej). W teście kontrolnym należy użyć takiej samej objętości wody destylowanej.

7.2. Jeżeli objętość zastosowanego aparatu różni się od objętości aparatu Scheiblera-Dietricha, należy dopasować porcje badanej próbki i substancji kontrolnej i odpowiednio obliczyć wyniki.

Dodatek

Szczegółowa procedura z wykorzystaniem aparatu Scheiblera-Dietricha

Badaną próbkę umieścić w specjalnej kolbie (element 4 na schemacie) aparatu wyposażonej w małą rurkę wykonaną z nietłukącego się szkła zawierającą 10 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1 powyżej) i podłączyć kolbę do aparatu. Przekręcić kranik trójdrożny (element 5 na schemacie) tak, aby rurka pomiarowa (element 1 na schemacie) miała połączenie z otoczeniem. Przy pomocy przesuwnej rurki (element 2 na schemacie) wypełnionej zabarwionym kwasem siarkowym (pkt 3.3 powyżej), połączonej z rurką pomiarową (element 1 na schemacie) doprowadzić poziom cieczy do znaku zero, który wyznaczony jest na podziałce. Przekręcić kranik trójdrożny (element 5 na schemacie) tak, aby połączyć rurki (elementy 1 i 3 na schemacie) i sprawdzić, czy poziom cieczy doprowadzony został do znaku 0.

Przechylając specjalną kolbę (element 4 na schemacie), powoli wlewać kwas chlorowodorowy (pkt 3.1 powyżej) do badanej próbki. Wyrównać ciśnienie, obniżając przesuwną rurkę (element 2 na schemacie). Potrząsać specjalną kolbą (element 4 na schemacie), dopóki nie ustanie wydzielanie dwutlenku węgla.

Przywrócić ciśnienie, doprowadzając ciecz w rurkach do tego samego poziomu (elementy 1 i 2 na schemacie). Po kilku minutach, kiedy ustali się objętość gazu, wykonać odczyt.

Przeprowadzić test kontrolny w tych samych warunkach, używając 0,5 g węglanu wapnia (pkt 3.2 powyżej).

APARAT SCHEIBLERA-DIETRICHA DO OZNACZANIA CO2

(wymiary w mm)

ZAŁĄx

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI POZIOMU DOPUSZCZONYCH DODATKÓW W PASZACH

A. OZNACZANIE WITAMINY A

Witamina A ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17547 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie zawartości witaminy A, E i D (

) – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z oczyszczaniem (HPLC) za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub fluorescencyjnego, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy A (retinolu) w paszy. Metoda pozwala na oznaczenie witaminy A obejmującej wszystkie formy alkoholowe trans-retinolu i wszystkie jej izomery cis. Zawartość witaminy A jest wyrażana w jednostkach międzynarodowych (IU) na kg. Jedna IU odpowiada aktywności 0,300 μg wszystkich form alkoholowych trans-witaminy A lub 0,344 μg wszystkich form octanowych trans-witaminy A lub 0,550 μg wszystkich form palmitynianowych trans-witaminy A.

Granica oznaczalności metody wynosi 2 000 IU witaminy A/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana w etanolowym roztworze wodorotlenku potasu, a witamina A ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy A jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub detektora fluorescencyjnego. Parametry chromatograficzne zostały tak dobrane, że nie zachodzi rozdział pomiędzy wszystkimi formami alkoholowymi trans-witaminy A i jej izomerami cis.

3. Odczynniki

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia 40–60 °C

3.3. Metanol

3.4. Roztwór wodorotlenku potasu, c = 50 g/100 ml

3.5. Roztwór askorbinianu sodu, c = 10 g/100 ml (zob. objaśnienia pkt 7.7)

3.6. Siarczek sodu, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1. Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, ß = 120 g/l (dla x = 9) (zob. objaśnienia pkt 7.8)

3.7. Roztwór fenoloftaleiny, c = 2 g/100 ml w etanolu (pkt 3.1)

3.8. 2-propanol

3.9. Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.10. Azot wolny od tlenu

3.11. Wszystkie formy octanowe trans-witaminy A, ekstra czyste, o certyfikowanej aktywności, np. 2,80 × 106 IU/g

3.11.1. Roztwór podstawowy wszystkich form octanowych trans-witaminy A: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg octanu witaminy A (pkt 3.11) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (pkt 3.8) i uzupełnić do pełnej objętości tym samym rozpuszczalnikiem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 1 400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość oznacza się w sposób określony w pkt 5.6.3.1.

3.12. Wszystkie formy palmitynianowe trans-witaminy A, ekstra czyste, o certyfikowanej aktywności, np. 1,80 × 106 IU/g

3.12.1. Roztwór podstawowy wszystkich form palmitynianowych trans-witaminy A: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 80 mg palmitynianu witaminy A (pkt 3.12) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (pkt 3.8) i uzupełnić do pełnej objętości tym samym rozpuszczalnikiem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 1 400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość oznacza się w sposób określony w pkt 5.6.3.2.

3.13. 2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (BHT) (zob. objaśnienia pkt 7.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Próżniowa wyparka rotacyjna

4.2. Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1. Kolby płaskodenne lub stożkowe o pojemności 500 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.2.2. Kolby miarowe o wąskich szyjkach o pojemnościach 10, 25, 100 i 500 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.3. Rozdzielacze stożkowe o pojemności 1 000 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.4. Kolby gruszkowe o pojemności 250 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.3. Chłodnica kulkowa o długości płaszcza 300 mm, ze szlifem szklanym, z nasadką do podłączenia gazu

4.4. Sączek karbowany do rozdzielania faz o średnicy 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm lub równoważna (kryterium wydajności: pojedynczy pik dla wszystkich izomerów retinolu w warunkach HPLC)

4.5.2. Detektor UV lub fluorescencyjny, z regulacją długości fali

4.6. Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami o długości drogi optycznej 10 mm

4.7. Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8. Aparat ekstrakcyjny (zob. rys. 1) zawierający:

4.8.1. Szklany cylinder o pojemności 1 l, z szyjką ze szlifem i z korkiem

4.8.2. Nasadkę szklaną ze szlifem z ramieniem i ruchomą nastawną rurką przesuwającą się przez środek nasadki. Nastawna rurka musi mieć zakończenie w kształcie litery U na dole i ujście na górze, tak aby górna warstwa cieczy w cylindrze mogła być przeniesiona do rozdzielacza.

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina A jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1.

Przygotowanie próbki

Zmielić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 1 mm, uważając, aby podczas mielenia nie wydzielało się ciepło. Mielenie musi być przeprowadzone tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić straty witaminy A. Próbki nie należy mielić, jeżeli rozkład wielkości cząstek jest odpowiedni (np. premiksy i dodatki paszowe).

5.2.

Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy A zważyć, z dokładnością do 1 mg, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1). W przypadku niskich stężeń masa próbki może zostać zwiększona w celu uzyskania wystarczającej ilości cząstek w naważce. Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (pkt 3.1), około 100 mg BHT (pkt 3.13), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (pkt 3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (pkt 3.6). Założyć chłodnicę (pkt 4.3) na kolbę i umieścić kolbę w łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (pkt 4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez pięć minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4) przez chłodnicę (pkt 4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając w trakcie powolnego przepływu strumienia azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3.

Ekstrakcja

Przenieść ilościowo, dekantując, zmydlony roztwór, spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3) lub do aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (pkt 3.1) i 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu ekstrakcyjnego. Proporcja wody i etanolu w łąc_zonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1.

Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza (pkt 4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (zob. objaśnienia pkt 7.3) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (pkt 4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie z użyciem 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i dwukrotnie z użyciem 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu 100 ml porcjami wody, ostrożnie mieszając, aby zapobiec powstawaniu emulsji, a następnie, wielokrotnie wstrząsając, powtórzyć przemywanie kolejnymi 100 ml porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (pkt 3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). Aby usunąć suspensję wodną, filtrować przemyty ekstrakt przez suchy karbowany filtr do rozdzielania faz (pkt 4.4) do kolby miarowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.2). Spłukać rozdzielacz i filtr przy użyciu 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), uzupełnić do pełnej objętości kolby eterem naftowym (pkt 3.2) i dobrze zmieszać.

5.3.2.

Ekstrakcja przy użyciu aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (zob. objaśnienia pkt 7.3), zastąpić korek szklanego cylindra (pkt 4.8.1) nasadką ze szlifem (pkt 4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez aplikację ciśnienia azotu dopływającego przez ramię nasadki przenieść eter naftowy z górnej warstwy do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3). Do szklanego cylindra dodać 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), zamknąć i dobrze wstrząsnąć. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza w sposób opisany powyżej. Powtórzyć postępowanie ekstrakcyjne, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), a następnie stosując dwukrotnie porcję 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), i dodać warstwy eteru naftowego do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego w sposób określony w pkt 5.3.1 i postępować w sposób tam określony.

5.4.

Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (pkt 4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na wyparce rotacyjnej (pkt 4.1) przy obniżonym ciśnieniu w temperaturze łaźni nie wyższej niż 40 °C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (pkt 3.10) i zdjąć kolbę z wyparki rotacyjnej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.10) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości (10–100 ml) metanolu (pkt 3.3) (stężenie witaminy A musi wynosić od 5 IU/ml do 30 IU/ml).

5.5.

Oznaczanie HPLC

Witamina A jest rozdzielana na kolumnie w odwróconym układzie faz C18 (pkt 4.5.1), a stężenie jest mierzone z użyciem detektora UV (325 nm) lub detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie: 325 nm; emisja: 475 nm) (pkt 4.5.2).

Zadozować podwielokrotną część roztworu metanolowego (np. 20 μl) otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4 i wymywać fazą ruchomą (pkt 3.9). Obliczyć średnią wysokość (powierzchnię) piku kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (pkt 5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.5.1):

250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważne

Faza ruchoma (pkt 3.9):

mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody np. 980 + 20 (v + v)

Prędkość przepływu:

1–2 ml/min

Detektor (pkt 4.5.2):

detektor UV (325 nm) lub detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 325 nm/emisja: 475 nm)

5.6.

Kalibracja

5.6.1.

Przygotowanie roboczych roztworów wzorcowych

Pobrać pipetą 20 ml podstawowego roztworu octanowej witaminy A (pkt 3.11.1) lub 20 ml podstawowego roztworu palmitynianowej witaminy A (pkt 3.12.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2, lecz bez dodawania BHT. Następnie ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (pkt 3.2). Odparować prawie do sucha 100 ml tego ekstraktu na wyparce rotacyjnej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.10) i ponownie rozpuścić pozostałość w 10,0 ml metanolu (pkt 3.3). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 560 IU witaminy A w 1 ml. Należy oznaczyć dokładną zawartość w sposób określony w pkt 5.6.3.3. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

Przenieść pipetą 2,0 ml tego roboczego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 20 ml, uzupełnić metanolem (pkt 3.3) do pełnej objętości kolby i zmieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego wynosi 56 IU witaminy A na 1 ml.

5.6.2.

Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 5,0 i 10,0 ml rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,8, 5,6, 14,0 i 28,0 IU witaminy A na 1 ml.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną, uwzględniając wyniki kontroli UV (pkt 5.6.3.3).

5.6.3.

Standaryzacja UV roztworów wzorcowych

5.6.3.1. Roztwór podstawowy octanowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego octanowej witaminy A (pkt 3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A w 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu octanowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

5.6.3.2. Roztwór podstawowy palmitynianowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego palmitynianowej witaminy A (pkt 3.12.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A w 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu palmitynianowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

5.6.3.3. Roboczy roztwór wzorcowy witaminy A

Pobrać pipetą 3,0 ml nierozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego witaminy A, przygotowanego w sposób określony w pkt 5.6.1, do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić 2-propanolem (pkt 3.8) do pełnej objętości kolby. Pobrać pipetą 5,0 ml tego roztworu do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy A roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w IU/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.6.2).

Zawartość witaminy A w IU/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w IU/ml witaminy A w roztworze próbki (pkt 5.4)

objętość w ml roztworu próbki (pkt 5.4)

objętość w ml pobranej podwielokrotnej części, o której mowa w pkt 5.4

masa naważki w g

7. Objaśnienia

7.1. W przypadku próbek o niskim stężeniu witaminy A jest wskazane połączenie ekstraktów eteru naftowego dwóch zmydlanych naważek (o masie 25 g każda) w jeden roztwór próbki przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2. Próbka pobrana do analizy nie może zawierać więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3. Jeżeli nie dochodzi do rozdzielenia faz, dodać około 10 ml etanolu (pkt 3.1), aby rozwarstwić emulsję.

7.4. W przypadku oleju z wątroby dorsza i innych czystych tłuszczów czas zmydlania należy przedłużyć do 45–60 minut.

7.5. Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6. Przy zastosowaniu kolumny do chromatografii w normalnym układzie faz możliwe jest oddzielenie izomerów retinolu. W tym wypadku do obliczeń sumuje się jednak wysokości (powierzchnie) pików wszystkich izomerów trans i cis.

7.7. Zamiast roztworu askorbinianu sodu można zastosować około 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8. Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

7.9. W przypadku analizy witaminy A w preparatach mlekozastępczych należy zwrócić szczególną uwagę na:

— zmydlanie (pkt 5.2): ze względu na zawartość tłuszczu w próbce konieczne może być zwiększenie ilości roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4),

— ekstrakcję (pkt 5.3): ze względu na obecność emulsji konieczne może być dostosowanie proporcji wody i etanolu wynoszącej 2:1.

Aby sprawdzić, czy zastosowana metoda analizy daje wiarygodne wyniki w odniesieniu do tej konkretnej matrycy (preparat mlekozastępczy), na dodatkowej naważce należy przeprowadzić test odzysku. Jeżeli stopień odzysku jest niższy niż 80 %, wyniki analizy należy skorygować o odzysk.

8. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego (

)

Premiks

Pasza z premiksem

Mieszanka paszowa mineralna

Pasza białkowa

Pasza dla prosiąt

średnia [IU/kg]

17,02 × 106

1,21 × 106

537 100

151 800

18 070

sr [IU/kg]

0,51 × 106

0,039 × 106

22 080

12 280

682

r [IU/kg]

1,43 × 106

0,109 × 106

61 824

34 384

1 910

CVr [%]

3,0

3,5

4,1

8,1

3,8

sR [IU/kg]

1,36 × 106

0,069 × 106

46 300

23 060

3 614

R [IU/kg]

3,81 × 106

0,193 × 106

129 640

64 568

10 119

CVR [%]

8,0

6,2

8,6

L: liczba laboratoriów

n: liczba pojedynczych wartości

sr: odchylenie standardowe powtarzalności

sR: odchylenie standardowe odtwarzalności

r: powtarzalność

R; odtwarzalność

CVr: współczynnik zmienności powtarzalności

CVR: współczynnik zmienności odtwarzalności

Rysunek 1

Aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

B. OZNACZANIE WITAMINY E

Witamina E ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17547 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie zawartości witaminy A, E i D (

) – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z oczyszczaniem (HPLC) za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub fluorescencyjnego, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy E w paszy. Zawartość witaminy E jest wyrażana w mg octanu DL-α-tokoferolu na kg. 1 mg octanu DL-α-tokoferolu odpowiada 0,91 mg DL-α-tokoferolu (witamina E).

Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg witaminy E/kg. Granica oznaczalności jest osiągalna jedynie przy pomocy detektora fluorescencyjnego. W przypadku detektora UV granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana etanolowym roztworem wodorotlenku potasu, a witamina E jest ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy E jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub detektora fluorescencyjnego.

3. Odczynniki

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia 40–60 °C

3.3. Metanol

3.4. Roztwór wodorotlenku potasu, c = 50 g/100 ml

3.5. Roztwór askorbinianu sodu, c = 10 g/100 ml (zob. objaśnienia pkt 7.7)

3.6. Siarczek sodu, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1. Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, β = 120 g/l (dla x = 9) (zob. objaśnienia pkt 7.8)

3.7. Roztwór fenoloftaleiny, c = 2 g/100 ml w etanolu (pkt 3.1)

3.8. Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.9. Azot wolny od tlenu

3.10. Octan DL-α-tokoferolu ekstra czysty, o certyfikowanej aktywności

3.10.1. Roztwór podstawowy octanu DL-α-tokoferolu: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (pkt 3.1) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg octanu DL-α-tokoferolu (kontrola UV – zob. pkt 5.6.1.3; stabilizacja – zob. objaśnienia pkt 7.4).

3.11. DL-α-tokoferol ekstra czysty, o certyfikowanej aktywności

3.11.1. Roztwór podstawowy DL-α-tokoferolu: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferolu (pkt 3.11) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (pkt 3.1) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg DL-α-tokoferolu (kontrola UV – zob. pkt 5.6.2.3; stabilizacja – zob. objaśnienia pkt 7.4).

3.12. 2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (BHT) (zob. objaśnienia pkt 7.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Obrotowa wyparka warstwowa

4.2. Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1. Kolby płaskodenne lub stożkowe o pojemności 500 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.2.2. Kolby miarowe o wąskich szyjkach o pojemnościach 10, 25, 100 i 500 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.3. Rozdzielacze stożkowe o pojemności 1 000 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.4. Kolby gruszkowe o pojemności 250 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.3. Chłodnica kulkowa o długości płaszcza 300 mm, ze szlifem szklanym, z nasadką do podłączenia gazu

4.4. Sączek karbowany do rozdzielania faz o średnicy 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm lub równoważna

4.5.2. Detektor UV lub fluorescencyjny, z regulacją długości fali

4.6. Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami o długości drogi optycznej 10 mm

4.7. Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8. Aparat ekstrakcyjny (zob. rys. 1) zawierający:

4.8.1. Szklany cylinder o pojemności 1 l, z szyjką ze szlifem i z korkiem

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina E jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1.

Przygotowanie próbki

5.2.

Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy E odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1). Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (pkt 3.1), około 100 mg BHT (pkt 3.12), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (pkt 3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (pkt 3.6). Założyć chłodnicę (pkt 4.3) na kolbę i umieścić kolbę na łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (pkt 4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4) przez chłodnicę (pkt 4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając w trakcie powolnego przepływu strumienia azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3.

Ekstrakcja

Przenieść ilościowo, dekantując, zmydlony roztwór, spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3) lub do aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (pkt 3.1) i 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu ekstrakcyjnego. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1.

Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza (pkt 4.2.3)

5.3.2. Ekstrakcja przy użyciu aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego w sposób określony w pkt 5.3.1 i postępować w sposób tam określony.

5.4.

Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (pkt 4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na wyparce rotacyjnej (pkt 4.1) przy obniżonym ciśnieniu w temperaturze łaźni nie wyższej niż 40 °C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (pkt 3.9) i zdjąć kolbę z wyparki rotacyjnej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.9) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości (10–100 ml) metanolu (pkt 3.3) (stężenie DL-α-tokoferolu musi wynosić od 5 do 30 μg/ml).

5.5.

Oznaczanie HPLC

Witamina E jest rozdzielana na kolumnie w odwróconym układzie faz C18 (pkt 4.5.1), a stężenie jest mierzone z użyciem detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie: 295 nm; emisja: 330 nm) lub detektora UV (292 nm) (pkt 4.5.2).

Zadozować podwielokrotną część roztworu metanolowego (np. 20 μl) otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4 i wymywać fazą ruchomą (pkt 3.8). Obliczyć średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (pkt 5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.5.1):

250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.8):

mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody np. 980 + 20 (v + v)

Prędkość przepływu:

1–2 ml/min

Detektor (pkt 4.5.2):

detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 295 nm/ emisja: 330 nm) lub detektor UV (292nm)

5.6.

Kalibracja (octan DL-α-tokoferolu lub DL-α-tokoferol)

5.6.1.

Wzorzec octanu DL-α-tokoferolu

5.6.1.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 25 ml roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2. Następnie ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do pełnej objętości kolby 500 ml eterem naftowym. Odparować prawie do sucha 25 ml tego ekstraktu na wyparce rotacyjnej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.9) i ponownie rozpuścić pozostałość w 25,0 ml metanolu (pkt 3.3). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 45,5 μg DL-α-tokoferolu na ml, co odpowiada 50 μg octanu DL-α-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

5.6.1.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Stężenia nominalne tych roztworów wynoszą odpowiednio 2,5, 5,0, 10,0 i 25,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu, co odpowiada stężeniom 2,28, 4,55, 9,10 i 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

5.6.1.3. Standaryzacja UV roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1)

Rozcieńczyć 5,0 ml roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1) do 25,0 ml etanolem i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (pkt 3.1) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 250 i 320 nm.

Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 284 nm:

Przy tym rozcieńczeniu wartość ekstynkcji musi wynosić od 0,84 do 0,88.

5.6.2.

Wzorzec DL-α-tokoferolu

5.6.2.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 2 ml roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, rozpuścić w metanolu (pkt 3.3) i uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, co odpowiada 44,0 μg octanu DL-α-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

5.6.2.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Stężenia nominalne tych roztworów wynoszą odpowiednio 2,0, 4,0, 8,0 i 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, co odpowiada stężeniom 2,20, 4,40, 8,79 i 22,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu.

5.6.2.3. Standaryzacja UV roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1)

Rozcieńczyć 2,0 ml roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1) do 25,0 ml etanolem i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (pkt 3.1) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 250 i 320 nm. Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 292 nm:

Przy tym rozcieńczeniu wartość ekstynkcji musi wynosić 0,6.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy E roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml (obliczone jako octan DL-α-tokoferolu), odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.6.1.2 lub 5.6.2.2).

Zawartość witaminy E w mg/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w μg/ml witaminy E (jako octan DL-α-tokoferolu) w roztworze próbki (pkt 5.4)

objętość w ml roztworu próbki (pkt 5.4)

objętość w ml pobranej podwielokrotnej części, o której mowa w pkt 5.4

masa naważki w g

7. Objaśnienia

7.1. W przypadku próbek o niskim stężeniu witaminy E wskazane jest połączenie ekstraktów eteru naftowego dwóch zmydlonych naważek (o masie 25 g każda) w jeden roztwór próbki przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2. Próbka pobrana do analizy nie może zawierać więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3. Jeżeli nie dochodzi do rozdzielenia faz, dodać około 10 ml etanolu (pkt 3.1), aby rozwarstwić emulsję.

7.4. Po pomiarze spektrofotometrycznym roztworu octanu DL-α-tokoferolu lub DL-α-tokoferolu, wykonanym odpowiednio w sposób określony w pkt 5.6.1.3 lub 5.6.2.3, dodać około 10 mg BHT (pkt 3.12) do roztworu (pkt 3.10.1 lub 3.10.2) i roztwór przechowywać w lodówce (nie dłużej niż przez 4 tygodnie).

7.5. Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6. Przy zastosowaniu kolumny do chromatografii w normalnym układzie faz możliwe jest oddzielenie α-, β-, γ- i δ-tokoferolu.

7.7. Zamiast roztworu askorbinianu sodu można zastosować około 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8. Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

7,9 Octanowa witamina E ulega bardzo szybkiej hydrolizie w warunkach zasadowych i dlatego jest ona wrażliwa na utlenianie, szczególnie w obecności takich pierwiastków śladowych jak żelazo lub miedź. W przypadku oznaczania witaminy E w premiksach na poziomach wyższych niż 5 000 mg/kg konsekwencją może być degradacja witaminy E. Dlatego też do celów potwierdzenia zaleca się metodę HPLC obejmującą rozkład enzymatyczny witaminy E bez zmydlania zasadą.

8. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego (

)

Premiks

Pasza z premiksem

Mieszanka paszowa mineralna

Pasza białkowa

Pasza dla prosiąt

Średnia [mg/kg]

17 380

1 187

926

315

61,3

sr [mg/kg]

384

45,3

25,2

13,0

2,3

r [mg/kg]

1 075

126,8

70,6

36,4

6,4

CVr [%]

2,2

3,8

2,7

4,1

3,8

sR [mg/kg]

830

65,0

55,5

18,9

7,8

R [mg/kg]

2 324

182,0

155,4

52,9

21,8

CVR [%]

4,8

5,5

6,0

12,7

L: liczba laboratoriów

n: liczba pojedynczych wartości

sr: odchylenie standardowe powtarzalności

sR: odchylenie standardowe odtwarzalności

r: powtarzalność

R: odtwarzalność

CVr: współczynnik zmienności powtarzalności

CVR: współczynnik zmienności odtwarzalności

Rysunek 2

Aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

C) OZNACZANIE PIERWIASTKÓW ŚLADOWYCH: ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

Zawartość żelaza, miedzi, manganu i cynku ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17053 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pierwiastków śladowych, metali ciężkich i innych pierwiastków w paszy metodą ICP-MS (metoda wielopierwiastkowa), lub

— metody analizy przewidzianej w normie EN ISO 6869 Pasze: Oznaczanie zawartości wapnia, miedzi, żelaza, magnezu, manganu, potasu, sodu i cynku. Metoda absorpcyjnej spektrometrii atomowej, lub

— metody atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją w płomieniu (FAAS), jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1) Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości pierwiastków śladowych: żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszy (

). Dolne granice oznaczalności metody wynoszą dla:

— żelaza (Fe): 20 mg/kg,

— miedzi (Cu): 10 mg/kg,

— manganu (Mn): 20 mg/kg,

— cynku (Zn): 20 mg/kg,

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę wprowadza się do roztworu kwasu chlorowodorowego po zniszczeniu ewentualnej substancji organicznej. Pierwiastki śladowe: żelazo, miedź, mangan i cynk są oznaczane, po odpowiednim rozcieńczeniu, z użyciem atomowej spektrometrii absorpcyjnej.

3. Odczynniki

Uwagi wstępne

Do przygotowania odczynników i roztworów używanych w postępowaniu analitycznym stosuje się wodę wolną od oznaczanych kationów, otrzymaną w drodze podwójnej destylacji w destylarce ze szkła borokrzemowego lub kwarcowego lub w wyniku podwójnego traktowania na żywicy jonowymiennej.

Stosować odczynniki o czystości co najmniej analitycznej. Nieobecność oznaczanych pierwiastków należy sprawdzać poprzez próbę ślepą. Odczynniki, jeżeli to konieczne, poddaje się oczyszczeniu przed zastosowaniem.

Zamiast przygotowania wzorcowych roztworów opisanych poniżej dopuszcza się stosowanie innych dostępnych w handlu wzorcowych roztworów, pod warunkiem że mają one gwarancję i zostały sprawdzone przed użyciem.

3.1. Kwas chlorowodorowy (d:1,19 g/ml)

3.2. Kwas chlorowodorowy (6 mol/litr)

3.3. Kwas chlorowodorowy (0,5 mol/litr)

3.4. Kwas fluorowodorowy od 38 do 40 % (v/v), o zawartości żelaza (Fe) niższej niż 1 mg/l i pozostałości po odparowaniu niższej niż 10 mg (jako siarczanu)/l.

3.5. Kwas siarkowy (d: 1,84 g/ml)

3.6. Nadtlenek wodoru (około 100 objętości tlenu (30 % w/w))

3.7. Roztwór wzorcowy żelaza (1 000 μg Fe/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu: rozpuścić 1 g drutu żelaznego w 200 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), dodać 16 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.7.1. Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (100 μg Fe/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.7) wodą w stosunku 1:9

3.8. Roztwór wzorcowy miedzi (1 000 μg Cu/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g sproszkowanej miedzi w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.8.1. Roboczy roztwór wzorcowy miedzi (10 μg Cu/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.8) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą stosunku 1:9

3.9. Roztwór wzorcowy manganu (1 000 μg Mn/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g sproszkowanego manganu w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.9.1. Roboczy roztwór wzorcowy manganu (10 μg Mn/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.9) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą w stosunku 1:9

3.10. Roztwór wzorcowy cynku (1 000 μg Zn/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g cynku w postaci paska lub listka w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.10.1. Roboczy roztwór wzorcowy cynku (10 μg Zn/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.10) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą w stosunku 1:9

3.11. Roztwór chlorku lantanu: rozpuścić 12 g tlenku lantanu w 150 ml wody, dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Piec muflowy z regulacją temperatury i w miarę możliwości z rejestratorem

4.2. Naczynie szklane z odpornego borokrzemowego szkła; zalecane jest stosowanie sprzętu przeznaczonego wyłącznie do oznaczania mikroelementów.

4.3. Spektrofotometr do pomiaru absorpcji atomowej o czułości i precyzji w zakresie prezentowanej metody

5. Sposób postępowania (

)

5.1.

Próbki zawierające substancję organiczną

5.1.1.

Spopielanie i przygotowanie roztworu do analizy

(

)

5.1.1.1. Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 5 do 10 g próbki i umieścić w kwarcowym lub platynowym tyglu (zob. uwaga b)), wysuszyć w suszarce w temperaturze 105 °C i wstawić tygiel do zimnego pieca muflowego (pkt 4.1). Zamknąć piec, (zob. uwaga c)) i stopniowo podwyższać temperaturę do 450–475 °C w czasie około 90 minut. Utrzymywać tę temperaturę od 4 do 16 godzin, np. przez noc, aby usunąć materiał zawierający węgiel, następnie otworzyć piec i pozostawić do schłodzenia (zob. uwaga d)).

Zwilżyć spopielałe pozostałości wodą i przenieść do zlewki o pojemności 250 ml. Przemyć tygiel z użyciem około 5 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) i dodawać kwas powoli i ostrożnie do zlewki (może zajść gwałtowna reakcja w wyniku powstania CO2). Dodawać kroplami kwas chlorowodorowy (pkt 3.1) mieszając do zaniku burzenia się mieszaniny. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając szklanym prętem.

Następnie dodać do pozostałości 15 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), a następnie około 120 ml wody. Zamieszać szklanym prętem, który należy pozostać w zlewce, i przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym. Doprowadzić ostrożnie do wrzenia i pozostawić w tym stanie aż do całkowitego rozpuszczenia popiołu. Przefiltrować przez sączek bezpopiołowy i zebrać filtrat w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Spłukać zlewkę i filtr z użyciem 5 ml gorącego kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i dwukrotnie wrzącą wodą. Uzupełnić kolbę miarową do pełnej objętości wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

5.1.1.2. Jeżeli pozostałość na filtrze jest czarna (węgiel), wstawić z powrotem do pieca i ponownie spopielać w temperaturze od 450 do 475 °C. Spopielanie, które wymaga jedynie kilku godzin (od trzech do pięciu), uważa się za zakończone, gdy popiół ma barwę białą lub białawą. Rozpuścić pozostałość w około 2 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1), odparować do sucha i dodać 5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2). Podgrzać, przefiltrować roztwór do kolby miarowej i uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

Uwagi:

a) Przy oznaczaniu pierwiastków śladowych należy zwrócić szczególną uwagę na ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza cynkiem, miedzią i żelazem. Dlatego sprzęt stosowany podczas przygotowania próbki nie może zawierać tych metali.

W celu zmniejszenia ogólnego ryzyka zanieczyszczenia należy wykonywać oznaczenie w środowisku wolnym od kurzu, dokładnie czyszcząc wyposażenie i myjąc naczynia szklane. Zwłaszcza przy oznaczaniu cynku występuje ryzyko zanieczyszczeń, np. z naczynia szklanego, odczynników, kurzu.

b) Masę próbki, która ma być spopielona, szacuje się na podstawie przybliżonej zawartości pierwiastka śladowego w paszy, w stosunku do czułości stosowanego spektrofotometru. W przypadku pasz ubogich w pierwiastki śladowe może zaistnieć konieczność rozpoczęcia oznaczania od odważenia od 10 do 20 g próbki i sporządzenia roztworu o końcowej objętości 100 ml.

c) Spopielanie należy przeprowadzać w zamkniętym piecu bez dostępu powietrza lub tlenu.

d) Temperatura według wskazań pirometru nie może być wyższa niż 475 °C.

5.1.2.

Spektrofotometryczne oznaczanie

5.1.2.1. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych

Dla każdego z oznaczanych pierwiastków śladowych przygotować, z roboczych roztworów wzorcowych określonych w pkt 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 i 3.10.1, roztwory kalibracyjne o stężeniu kwasu chlorowodorowego około 0,5 mol/l i – w przypadku żelaza, manganu i cynku – chlorek lantanu o stężeniu 0,1 % La (w/v).

Wybrane stężenia pierwiastków śladowych muszą mieścić się w zakresie czułości stosowanego spektrofotometru. W poniższych tabelach podano przykładowy skład typowych zakresów stężeń roztworów kalibracyjnych; w zależności od typu i czułości stosowanego spektrofotometru może zachodzić konieczność wyboru innych stężeń.

Żelazo

μg Fe/ml

0,5

ml roboczego roztworu wzorcowego (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)

0,5

ml HCl (pkt 3.2)

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

Miedź

μg Cu/ml

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)

ml HCl (pkt 3.2)

Mangan

μg Mn/ml

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)

ml HCl (pkt 3.2)

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

Cynk

μg Zn/ml

0,05

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)

0,5

ml HCl (pkt 3.2)

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

5.1.2.2. Przygotowanie roztworu do analizy

W przypadku oznaczania miedzi zazwyczaj może być wykorzystany roztwór przygotowany w sposób określony w pkt 5.1.1. W przypadku konieczności dostosowania jego stężenia do zakresu stężeń roztworów kalibracyjnych pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (pkt 3.3).

Przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu przygotowanego w sposób określony w pkt 5.1.1 do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dodać 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (pkt 3.3) (zob. objaśnienia pkt 8).

5.1.2.3. Próba ślepa

Próbę ślepą przeprowadzić zgodnie z kolejnością wykonywania czynności metody, ale bez użycia materiału próbki. Nie stosować roztworu kalibracyjnego „0” do ślepej próby.

5.1.2.4. Pomiar absorpcji atomowej

Zmierzyć absorpcję atomową roztworów kalibracyjnych i badanego roztworu z użyciem utleniającego płomienia powietrzno-acetylenowego przy następujących długościach fal:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Każdy pomiar przeprowadzić czterokrotnie.

5.2.

Mieszanki paszowe mineralne

Jeżeli próbka nie zawiera substancji organicznych, wcześniejsze spopielanie nie jest konieczne. Postępować w sposób określony w pkt 5.1.1.1, poczynając od akapitu drugiego. Można pominąć etap odparowania z kwasem fluorowodorowym.

6. Obliczanie wyników

Przy zastosowaniu krzywej wzorcowej obliczyć stężenie pierwiastka śladowego w roztworze do analizy i wyrazić wynik w mg pierwiastka śladowego na kg próbki (ppm).

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie może przekraczać:

— 5 mg/kg w wartości bezwzględnej, dla zawartości danego pierwiastka śladowego nie wyższej niż 50 mg/kg,

— 10 % wyższego wyniku, dla zawartości danego pierwiastka śladowego od 50 do 100 mg/kg,

— 10 mg/kg w wartości bezwzględnej, dla zawartości danego pierwiastka śladowego od 100 do 200 mg/kg,

— 5 % wyższego wyniku, dla zawartości danego pierwiastka śladowego wyższej niż 200 mg/kg.

8. Objaśnienia

Obecność znacznych ilości fosforanów może interferować przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku. Takie interferencje należy skorygować przez dodanie chlorku lantanu (pkt 3.11). Jeżeli jednak w próbce stosunek wagowy Ca + Mg/P jest > 2, to dodanie roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) do analizowanego roztworu i roztworów kalibracyjnych może być pominięte.

D) OZNACZANIE HALOFUGINONU

Bromowodorek DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazolin-4-(3H)-onu

Zawartość halofuginonu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości halofuginonu w paszach. Granica oznaczalności wynosi 1 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Po potraktowaniu gorącą wodą halofuginon ekstrahuje się w postaci wolnej zasady w octanie etylu, a następnie rozdziela jako chlorowodorek w wodnym roztworze kwasu. Ekstrakt jest oczyszczany z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej. Zawartość halofuginonu określa się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1. Acetonitryl do HPLC

3.2. Żywica Amberlit XAD-2

3.3. Octan amonu

3.4. Octan etylu

3.5. Kwas octowy lodowaty

3.6. Substancja wzorcowa halofuginonu (bromowodorek DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazolin-4-(3H)-onu, E 764)

3.6.1. Podstawowy roztwór wzorcowy halofuginonu o stężeniu 100 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg halofuginonu (pkt 3.6) do kolby miarowej o pojemności 500 ml, rozpuścić w roztworze buforowym octanu amonu (pkt 3.18), uzupełnić do pełnej objętości kolby roztworem buforowym i wymieszać. Roztwór zachowuje stabilność do trzech tygodni, jeżeli jest przechowywany bez dostępu światła w temperaturze 5 °C.

3.6.2. Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml przenieść kolejno 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego halofuginonu (pkt 3.6.1). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (pkt 3.21) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 μg/ml halofuginonu. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.7. Kwas chlorowodorowy (ρ20 około 1,16 g/ml)

3.8. Metanol

3.9. Azotan srebra

3.10. Askorbinian sodu

3.11. Węglan sodu

3.12. Chlorek sodu

3.13. EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól dwusodowa)

3.14. Woda do HPLC

3.15. Roztwór węglanu sodu, c = 10 g/100 ml

3.16. Roztwór węglanu sodu nasyconego chlorkiem sodu, c = 5 g/100 ml

Rozpuścić 50 g węglanu sodu (pkt 3.11) w wodzie, rozcieńczyć do objętości 1 l i dodać chlorek sodu (pkt 3.12), aż do otrzymania roztworu nasyconego.

3.17. Kwas chlorowodorowy, stężenie około 0,1 mol/l

Rozcieńczyć 10 ml HCI (pkt 3.7) wodą do objętości 1 l.

3.18. Roztwór buforowy octanu amonu, około 0,25 mol/l

Rozpuścić 19,3 g octanu amonu (pkt 3.3) i 30 ml kwasu octowego (pkt 3.5) w wodzie (pkt 3.14) i rozcieńczyć do objętości 1 l.

3.19. Przygotowanie żywicy Amberlit XAD-2

Odpowiednią ilość żywicy (pkt 3.2) przemywać wodą aż do zaniku wszystkich jonów chlorku, co sprawdza się z użyciem azotanu srebra (pkt 3.20) w odrzucanej fazie wodnej. Następnie przemyć żywicę 50 ml metanolu (pkt 3.8), usunąć metanol i przechowywać żywicę w świeżym metanolu.

3.20. Roztwór azotanu srebra około 0,1 mol/l

Rozpuścić 0,17 g azotanu srebra (pkt 3.9) w 10 ml wody.

3.21. Faza ruchoma HPLC

Zmieszać 500 ml acetonitrylu (pkt 3.1) z 300 ml roztworu buforowego octanu amonu (pkt 3.18) i 1 200 ml wody (pkt 3.14). Przy użyciu kwasu octowego (pkt 3.5) dostosować pH do 4,3. Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (pkt 4.8), a następnie odgazować roztwór (np. poprzez zastosowanie ultradźwięków przez 10 minut). Roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc, jeżeli jest przechowywany w zamkniętym naczyniu, bez dostępu światła.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa

4.2. Obrotowa wyparka warstwowa

4.3. Wirówka

4.4. Sprzęt do HPLC z detektorem UV z regulacją długości fali lub z detektorem diodowym

4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej o wymiarach 300 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 10 μm lub równoważna kolumna

4.5. Kolumna szklana o wymiarach 300 mm × 10 mm z kranem i filtrem ze spiekanego szkła

4.6. Filtry z włókna szklanego o średnicy 150 mm

4.7. Filtry membranowe, 0,45 μm

4.8. Filtry membranowe, 0,22 μm

5. Sposób postępowania

Uwaga

Halofuginon w formie wolnej zasady jest niestabilny w roztworach zasadowych i octanu etylu. Nie może pozostawać w octanie etylu dłużej niż przez 30 minut.

5.1.

Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepą próbkę paszy należy przeanalizować w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona halofuginonu i innych substancji interferujących.

5.1.2. Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconej znaną ilością halofuginonu, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Aby wzbogacić na poziomie 3 mg/kg, dodać 300 μl podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.6.1) do 10 g ślepej próbki paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Uwaga:

dla celów niniejszej metody ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności halofuginonu.

5.2.

Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,1 g, 10 g przygotowanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 ml. Dodać 0,5 g askorbinianu sodu (pkt 3.10), 0,5 g EDTA (pkt 3.13), 20 ml wody i zmieszać. Probówkę umieścić na 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodu (pkt 3.15) i zmieszać. Niezwłocznie dodać 100 ml octanu etylu (pkt 3.4) i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) na trzy minuty i obluzować korek. Wirować przez dwie minuty i zdekantować fazę octanu etylu przez filtr z włókna szklanego (pkt 4.6) do rozdzielacza o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję tej próbki drugą porcją 100 ml octanu etylu. Przemywać połączone ekstrakty przez minutę 50 ml roztworu chlorku sodu nasyconego węglanem sodu (pkt 3.16) i usunąć warstwę wodną.

Warstwę organiczną ekstrahować przez minutę 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.17). Dolną kwasową warstwę spuścić do rozdzielacza o pojemności 250 ml. Przez 1,5 minuty powtarzać ekstrakcję warstwy organicznej przy użyciu kolejnej porcji 50 ml kwasu chlorowodorowego i połączyć z ekstraktem uzyskanym z pierwszego procesu. Przemyć połączone ekstrakty kwasu, wirując z 10 ml octanu etylu (pkt 3.4) przez około 10 sekund.

Warstwę wodną przenieść ilościowo do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml i usunąć warstwę organiczną. Znajdujący się jeszcze w roztworze kwasu octan etylu odparować na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.2). Temperatura łaźni wodnej nie może przekraczać 40 °C. W warunkach podciśnienia wynoszącego około 25 mbar i w temperaturze 38 °C cała pozostała część octanu etylu zostanie usunięta w ciągu 5 min.

5.3.

Oczyszczanie

5.3.1.

Przygotowanie kolumny z Amberlitem

Dla każdego ekstraktu próbki przygotować kolumnę XAD-2. Przygotowany Amberlit o masie 10 g (pkt 3.19) umieścić w szklanej kolumnie (pkt 4.5) z metanolem (pkt 3.8). Wprowadzić mały zwitek szklanej waty w górną część warstwy żywicy. Odprowadzić metanol z kolumny, a następnie przemyć żywicę 100 ml wody, zatrzymując proces, gdy ciecz dosięgnie górnej części warstwy żywicy. Pozostawić kolumnę do ustabilizowania na 10 minut przed użyciem. Nie dopuścić do osuszenia kolumny.

5.3.2.

Oczyszczanie próbki

Ekstrakt (pkt 5.2) przenieść ilościowo na górną powierzchnię kolumny z Amberlitem (pkt 5.3.1) i eluować, usuwając eluat. Prędkość elucji nie może przekraczać 20 ml/min. Przemyć kolbę okrągłodenną 20 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.17). Użyć tego kwasu do przemycia kolumny z żywicą. Usunąć pozostałości roztworu kwasu strumieniem powietrza. Wylać popłuczyny. Dodać 100 ml metanolu (pkt 3.8) na kolumnę i pozwolić na elucję od 5 do 10 ml, zbierając eluat w kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml. Pozostawić pozostały metanol na 10 minut w celu ustabilizowania z żywicą, a następnie kontynuować elucję, której prędkość nie może przekraczać 20 ml/min, zbierając eluat do tej samej kolby okrągłodennej. Odparować metanol na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.2), przy czym temperatura wody w łaźni nie może być wyższa niż 40 °C. Za pomocą fazy ruchomej (pkt 3.21) przenieść ilościowo pozostałość do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Uzupełnić do pełnej objętości fazą ruchomą i zmieszać. Podwielokrotna część jest filtrowana przez filtr membranowy (pkt 4.7). Roztwór ten zastosować do oznaczania HPLC (pkt 5.4).

5.4.

Oznaczanie HPLC

5.4.1.

Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (pkt 3.21)

Prędkość przepływu: od 1,5 do 2 ml/min

Długość fali przy detekcji: 243 nm

Dozowana objętość: 40 do 100 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (pkt 3.6.2) o stężeniu 3,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.4.2.

Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.6.2) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Nakreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3.

Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.3.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików halofuginonu.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików halofuginonu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w in μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.4.2).

Zawartość halofuginonu w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w μg/ml halofuginonu w roztworze próbki

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.6.2) zawierającego 6,0 μg/ml.

7.1.1.

Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki jest wzbogacany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu musi być podobna do szacowanej ilości halofuginonu obecnego w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku halofuginonu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.

Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach ± 2 nm;

b) w zakresie pomiędzy 225 a 300 nm widma próbki i wzorca zapisane przy maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 225 do 300 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,5 mg/kg dla zawartości halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3.

Odzysk

W przypadku wzbogaconej próbki ślepej odzysk nie może być mniejszy niż 80 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego osiem laboratoriów przeprowadziło analizę (

) trzech próbek.

Wyniki

Próbka A (ślepa)

Przy odbiorze

Próbka B (mączka)

Próbka C (granulki)

Przy odbiorze

Po dwóch miesiącach

Przy odbiorze

Po dwóch miesiącach

Średnia [mg/kg]

n.w.

2,80

2,42

2,89

2,45

SR [mg/kg]

– 0,45

0,43

0,40

0,42

CVR [%]

– 16

Odzysk [%]

n.w.= nie wykryto

SR= odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR= współczynnik zmienności odtwarzalności (%)

Rec.= odzysk (%)

E) OZNACZANIE ROBENIDYNY

Chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny

Zawartość robenidyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości robenidyny w paszach. Granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę poddaje się ekstrakcji zakwaszonym metanolem. Ekstrakt osusza się, a podwielokrotną część oczyszcza na kolumnie z tlenkiem glinu. Robenidynę z kolumny wymywa się metanolem, zatęża i uzupełnia do odpowiedniej objętości fazą ruchomą. Robenidynę oznacza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1. Metanol

3.2. Zakwaszony metanol

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml umieścić 4,0 ml kwasu chlorowodorowego (ρ20 = 1,18 g/ml), uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.3. Acetonitryl do HPLC

3.4. Sito molekularne

Typ 3 A, granulki 8–12 mesh (granulki z glinokrzemianu krystalicznego 1,6–2,5 mm, średnica porów 0,3 mm).

3.5. Tlenek glinu I stopnia aktywności kwasowej do chromatografii kolumnowej

100 g tlenku glinu umieścić w odpowiednim pojemniku i dodać 2,0 ml wody. Zakorkować i wstrząsać przez około 20 minut. Przechowywać w dobrze zamkniętym pojemniku.

3.6. Roztwór diwodorofosforanu potasu, c = 0,025 mol/l

Rozpuścić 3,40 g diwodorofosforanu potasu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby i wymieszać.

3.7. Roztwór wodorofosforanu disodu, c = 0,025 mol/l

Rozpuścić 3,55 g bezwodnego lub 4,45 g dihydratu, lub 8,95 g dodekahydratu wodorofosforanu disodu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 l, uzupełnić do pełnej objętości kolby i wymieszać.

3.8. Faza ruchoma HPLC

Zmieszać razem:

650 ml acetonitrylu (pkt 3.3),

250 ml wody do HPLC,

50 ml roztworu diwodorofosforanu potasu (pkt 3.6),

50 ml roztworu wodorofosforanu disodu (pkt 3.7).

Filtrować przez filtr 0,22 μm (pkt 4.6) i odgazować roztwór, np. poprzez zastosowanie ultradźwięków przez 10 minut.

3.9. Substancja wzorcowa

Czysta robenidyna: chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny

3.9.1. Podstawowy roztwór wzorcowy robenidyny: 300 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 30 mg substancji wzorcowej robenidyny (pkt 3.9). Rozpuścić w zakwaszonym metanolu (pkt 3.2) w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby tym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.2. Pośredni roztwór wzorcowy robenidyny: 12 μg/ml

Przenieść 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 250 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby fazą ruchomą (pkt 3.8) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.3. Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 i 25,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego robenidyny (pkt 3.9.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 i 6,0 μg/ml robenidyny. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10. Woda do HPLC

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Kolumna szklana

Przygotować kolumnę ze szkła oranżowego o średnicy wewnętrznej od 10 do 15 mm i długości 250 mm, wyposażoną w kran i zbiorniczek o pojemności około 150 ml.

4.2. Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.3. Obrotowa wyparka warstwowa

4.4. Wyposażenie do HPLC z detektorem promieniowania ultrafioletowego z regulacją długości fali lub detektorem diodowym pracującym w zakresie od 250 do 400 nm

4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej: 300 mm x 4 mm, C18 wypełnienie10 μm lub równoważna

4.5. Bibuła filtracyjna z włóknem szklanym (Whatman GF/A lub równoważna)

4.6. Filtry membranowe, 0,22 μm

4.7. Filtry membranowe, 0,45 μm

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Robenidyna jest wrażliwa na światło. Wszystkie czynności należy przeprowadzać z zastosowaniem szkła oranżowego.

5.1.

Wskazówki ogólne

5.1.1. Należy przebadać ślepą próbkę paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera robenidyny ani substancji interferujących.

5.1.2. Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy (pkt 5.1.1) wzbogaconą znaną ilością robenidyny, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 60 mg/kg, przenieść 3,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego robenidyny (pkt 3.9.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Odparować roztwór w strumieniu azotu do około 0,5 ml. Dodać 15 g ślepej próbki paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Uwaga: Na potrzeby tej metody ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności robenidyny.

5.2.

Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 15 g przygotowanej próbki. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.2), zakorkować i wstrząsać przez godzinę na wstrząsarce (pkt 4.2). Roztwór filtrować przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym (pkt 4.5), a filtrat zebrać do kolby stożkowej o pojemności 150 ml. Dodać 7,5 g sita molekularnego (pkt 3.4), zamknąć i wstrząsać przez pięć minut. Natychmiast filtrować przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym. Roztwór zachowuje się do etapu oczyszczania (pkt 5.3).

5.3.

Oczyszczanie

5.3.1.

Przygotowanie kolumny z tlenkiem glinu

Umieścić w dolnym końcu szklanej kolumny (pkt 4.1) zwitek szklanej waty i wbić ją, używając szklanego pręcika. Odważyć 11,0 g przygotowanego tlenku glinu (pkt 3.5) i przenieść do kolumny. Czynność tę należy wykonywać tak, aby ograniczyć do minimum działanie powietrza atmosferycznego. Delikatnie postukać w napełnioną kolumnę od strony dna w celu osadzenia tlenku glinu.

5.3.2.

Oczyszczanie próbki

Używając pipety, przenieść do kolumny 5,0 ml ekstraktu próbki otrzymanego w sposób określony w pkt 5.2. Zakończenie pipety przyłożyć blisko do ścianki kolumny i pozwolić, aby roztwór został wchłonięty przez tlenek glinu. Wymyć robenidynę z kolumny przy użyciu 100 ml metanolu (pkt 3.1) przy prędkości przepływu od 2 do 3 ml na minutę, a eluat zebrać do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.3) odparować roztwór metanolu do sucha, przy zmniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40 °C. Pozostałość ponownie rozpuścić w 3–4 ml fazy ruchomej (pkt 3.8) i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Kolbę przemyć kilkakrotnie 1–2 ml porcjami fazy ruchomej, a popłuczyny wlać do kolby miarowej. Uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Podwielokrotna część jest filtrowana przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.7). Roztwór zastosować do oznaczania HPLC (pkt 5.4).

5.4.

Oznaczanie HPLC

5.4.1.

Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (pkt 3.8)

Prędkość przepływu: 1,5 do 2 ml/min

Długość fali przy detekcji: 317 nm

Dozowana objętość: 20 do 50 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (pkt 3.9.3) zawierający 3,6 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości pików i czasów retencji.

5.4.2.

Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.9.3) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3.

Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.3.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików robenidyny.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików robenidyny roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.4.2).

Zawartość robenidyny (w mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w μg/ml robenidyny w roztworze próbki

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Sprawdzenie tożsamości

7.1.1.

Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki jest wzbogacany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.9.3). Ilość dodanej robenidyny musi być podobna do szacowanej ilości robenidyny w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku robenidyny. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ok. 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.

Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku zarejestrowanego na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm;

b) w zakresie pomiędzy 250 a 400 nm widma próbki i wzorca zapisane przy maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 250 do 400 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest wyższa niż 15 % widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % wyższego wyniku dla zawartości robenidyny powyżej 15 mg/kg.

7.3.

Odzysk

W przypadku wzbogaconej próbki ślepej odzysk nie może być mniejszy niż 85 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego na szczeblu UE, w którym uczestniczyło 12 laboratoriów, przeprowadzono analizę czterech próbek paszy dla drobiu i królików, w postaci mączki lub granulatu. Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Pasza dla drobiu

Pasza dla królików

Mączka

Granulat

Mączka

Granulat

Średnia [mg/kg]

27,00

27,99

43,6

40,1

sr [mg/kg]

1,46

1,26

1,44

1,66

CVr [%]

5,4

4,5

3,3

4,1

SR [mg/kg]

4,36

3,36

4,61

3,91

CVR [%]

16,1

12,0

10,6

9,7

Odzysk [%]

90,0

93,3

87,2

80,2

sr= odchylenie standardowe powtarzalności

CVr= współczynnik zmienności powtarzalności w %

SR= odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR= współczynnik zmienności odtwarzalności w %

F) OZNACZANIE DIKLAZURILU

(±)4-chlorofenylo[2,6-dwuchloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro–3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl

Zawartość diklazurilu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz z potrójnym gradientem (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości diklazurilu w mieszankach paszowych i premiksach (

). Granica wykrywalności wynosi 0,1 mg/kg, granica oznaczalności 0,5 mg/kg. Możliwe jest osiągnięcie niższych granic oznaczalności, ale musi to zostać zwalidowane przez użytkownika.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Po dodaniu wzorca wewnętrznego próbka jest ekstrahowana zakwaszonym metanolem. W przypadku pasz podwielokrotna część ekstraktu zostaje oczyszczona na wkładzie do ekstrakcji fazy stałej C18. Diklazuril jest eluowany z wypełnienia mieszaniną zakwaszonego metanolu i wody. Po odparowaniu pozostałość jest rozpuszczana w DMF/woda. W przypadku premiksów ekstrakt jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana w DMF/woda. Zawartość diklazurilu jest oznaczana za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz z potrójnym gradientem (HPLC) z zastosowaniem detektora UV.

3. Odczynniki

3.1. Woda do HPLC

3.2. Octan amonu

3.3. Wodorosiarczan tetrabutyloamoniowy (TBHS)

3.4. Acetonitryl do HPLC

3.5. Metanol do HPLC

3.6. N, N-dwumetyloformamid (DMF)

3.7. Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Substancja wzorcowa: diklazuril: (±)4-chlorofenylo[2,6-dwuchloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro3,5 -diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl o gwarantowanej czystości

3.8.1. Podstawowy roztwór wzorcowy diklazurilu, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej (pkt 3.8) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc (

3.8.2. Roztwór wzorcowy diklazurilu, 50 μg/ml

Przenieść 5,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9. Substancja wzorcowa wewnętrzna: 2,6-dichloro-α-(4-chlorofenylo)-4-(4,5-dihydro–3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2(3H) -yl) α-metylobenzeno-acetonitryl (diklazuril metylu)

3.9.1. Podstawowy roztwór wzorcowy wzorca wewnętrznego, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej wewnętrznej (pkt 3.9), do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9.2. Roztwór wzorca wewnętrznego, 50 μg/ml

Przenieść 5,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9.3. Roztwór wzorca wewnętrznego dla premiksów, p/1 000 mg/ml (p = zawartość nominalna diklazurilu w premiksie w mg/kg)

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, p/10 mg substancji wzorcowej wewnętrznej do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w DMF (pkt 3.6) w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.7), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.10. Roztwory kalibracyjne

3.10.1. Roztwór kalibracyjny, 1 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 1,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 17 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2. Roztwór kalibracyjny, 2 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 2,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3. Roztwór kalibracyjny, 3 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 3,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.4. Roztwór kalibracyjny, 4 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 4,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 14 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.5. Roztwór kalibracyjny, 5 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 5,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 13 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

UWAGA:

roztwory kalibracyjne (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) obejmują stężenie diklazurilu w paszy wynoszące od 0,5 do 2,5 mg/kg przy stosowaniu obecnego protokołu.

3.11. C18, wkład do ekstrakcji fazy stałej np. Mega Bond Elut, rozmiar: 20 cc, masa sorbentu: 5 000 mg (kondycjonowanie wstępne zgodnie z wytycznymi dostawcy).

3.12. Rozpuszczalnik ekstrakcyjny: zakwaszony metanol

Odmierzyć pipetą 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.7) do 1 000 ml metanolu (pkt 3.5) i wymieszać.

3.13. Faza ruchoma do HPLC

3.13.1. Eluent A: roztwór octan amonu – wodorosiarczan tetrabutyloamoniowy

Rozpuścić 5 g octanu amonu (pkt 3.2) i 3,4 g TBHS (pkt 3.3) w 1 000 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać.

3.13.2. Eluent B: acetonitryl (pkt 3.4)

3.13.3. Eluent C: metanol (pkt 3.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Wytrząsarka mechaniczna

4.2. Sprzęt do HPLC z potrójnym gradientem

4.2.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, Hypersil ODS, wypełnienie 3 μm, 100 mm × 4,6 mm lub równoważna

4.2.2. Detektor UV z regulacją długości fali lub detektor diodowy

4.3. Obrotowa wyparka warstwowa

4.4. Filtr membranowy (np. chemicznie odporny Nylon), 0,45 μm

4.5. Strzykawka jednorazowa, 5 ml

4.6. Rozdzielnik próżni do jednoczesnej próżniowej izolacji

4.7. Łaźnia ultradźwiękowa

5. Sposób postępowania

5.1.

Wskazówki ogólne

5.1.1.

Ślepa próbka paszy

Należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona diklazurilu ani substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności diklazurilu i substancji interferujących.

5.1.2.

Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością diklazurilu, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 1 mg/kg, należy dodać 0,1 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) do 50 g ślepej próbki paszy, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie ponownie kilkakrotnie wymieszać przed przejściem do następnego etapu (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością diklazurilu o masie zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niewzbogaconej.

5.2.

Ekstrakcja

5.2.1.

Mieszanki paszowe

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 50 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (pkt 4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przelać 20 ml podwielokrotnej części supernatantu do odpowiedniego szklanego pojemnika i rozcieńczyć 20 ml wody (pkt 3.1). Przenieść ten roztwór na wkład do ekstrakcji (pkt 3.11) i przepuścić przez niego, stosując rozdzielnik próżni (pkt 4.6). Przepłukać wkład 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i wody (pkt 3.1), 65 + 35 (V + V). Odrzucić zebrane frakcje i eluować związki, stosując 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i wody, 80 + 20 (V + V). Odparować tę frakcję do osuszenia przy zastosowaniu wyparki rotacyjnej (pkt 4.3) w temperaturze 60 °C. Rozpuścić pozostałość w 1,0 ml DMF (pkt 3.6), dodać 1,5 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać. Przefiltrować przez filtr membranowy (pkt 4.4) zamontowany na jednorazowej strzykawce (pkt 4.5). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2.

Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 1 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.3), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (pkt 4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przenieść podwielokrotną część 10 000 /p ml (p = zawartość nominalna diklazurilu w premiksie w mg/kg) supernatantu do kolby okrągłodennej o odpowiedniej pojemności. Odparować do osuszenia, pod obniżonym ciśnieniem, w temperaturze 60 °C przy użyciu wyparki rotacyjnej (pkt 4.3). Ponownie rozpuścić pozostałość w 10,0 ml DMF (pkt 3.6), dodać 15,0 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3.

Oznaczanie HPLC

5.3.1.

Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych lub lepszych wyników.

— Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.2.1): 100 × 4,6 mm, Hypersil ODS, wypełnienie 3 μm, lub równoważna

— Faza ruchoma

— Eluent A (pkt 3.13.1): wodny roztwór octanu amonu i wodorosiarczanu tetrabutyloamoniowego

— Eluent B (pkt 3.13.2): acetonitryl

— Eluent C (pkt 3.13.3): metanol

— Elucja – gradient liniowy

— warunki początkowe: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)

— po 10 minutach elucja gradientowa przez 30 minut do: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)

— następnie płukać eluentem B przez 10 minut

— Prędkość przepływu: 1,5–2 ml/min

— Dozowana objętość: 20 μl

— Długość fali przy detekcji: 280 nm

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.10.2) zawierający 2 μg/ml diklazurilu i wzorca wewnętrznego, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2.

Analiza chromatograficzna roztworów kalibracyjnych

Zadozować dwukrotnie 20 μl roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5), zidentyfikować i zintegrować piki diklazurilu i wzorca wewnętrznego oraz sporządzić krzywą wzorcową na podstawie stosunku średniej wysokości lub powierzchni piku diklazurilu do średniej wysokości lub powierzchni piku wzorca wewnętrznego w odniesieniu do stężenia diklazurilu w roztworach kalibracyjnych (μg/ml).

5.3.3.

Analiza chromatograficzna roztworów próbki

Zadozować dwukrotnie 20 μl roztworu próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) i określić średnią wysokość (powierzchnię) pików diklazurilu i wzorca wewnętrznego.

6. Obliczanie wyników

6.1.

Mieszanki paszowe

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) oblicza się według następującego wzoru:

=lub

gdzie:

— Wysokość(d,s) jest wysokością piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Powierzchnia(d,s) jest powierzchnią piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Wysokość(i,s) jest wysokością piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Powierzchnia(i,s) jest powierzchnią piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— b oznacza punkt przecięcia krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— a oznacza nachylenie krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— m oznacza masę naważki gramach

— V oznacza końcową objętość ekstraktu próbki w mililitrach po ponownym rozpuszczeniu zgodnie z pkt 5.2.1 (tj. 2,5 ml)

6.2.

Premiksy

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) oblicza się według następującego wzoru:

p lub

gdzie:

— Wysokość(d,s) jest wysokością piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Powierzchnia(d,s) jest powierzchnią piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Wysokość(i,s) jest wysokością piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Powierzchnia(i,s) jest powierzchnią piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— b oznacza punkt przecięcia krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— a oznacza nachylenie krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— m oznacza masę naważki gramach

— V oznacza końcową objętość ekstraktu próbki w mililitrach po ponownym rozpuszczeniu zgodnie z pkt 5.2.2 (tj. 25 ml)

— p oznacza zawartość nominalną w mg/kg diklazurilu w premiksie

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.2).

7.1.1.

Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) wzbogaca się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.2). Ilość dodanego diklazurilu musi odpowiadać ilości diklazurilu znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku diklazurilu i piku wzorca wewnętrznego. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku diklazurilu lub piku wzorca wewnętrznego niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.1.2.

Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

b) w zakresie od 230 do 320 nm widma próbki i wzorca zapisane w maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 230 do 320 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch niezależnych pomiarów wykonanych dla dwóch podpróbek nie może przekraczać:

— 30 % względem wyższej wartości, dla zawartości diklazurilu od 0,5 mg/kg do 2,5 mg/kg,

— 0,75 mg/kg dla zawartości diklazurilu od 2,5 mg/kg do 5 mg/kg,

— 15 % względem wyższej wartości, dla zawartości diklazurilu powyżej 5 mg/kg.

7.3.

Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki odzysk musi wynosić co najmniej 80 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

Zorganizowano dwa porównania międzylaboratoryjne. W pierwszym, przeprowadzonym przez inną grupę laboratoriów w 1994 r., zbadano próbki dwóch premiksów (O 100, A 100) i trzy próbki mieszanek paszowych uzupełniających dla drobiu (L1, Z1, K1). Próbkę jednego premiksu wymieszano z matrycą organiczną (O 100), a drugiego – z matrycą nieorganiczną (A 100). Zawartość teoretyczna diklazurilu wynosiła 100 mg/kg. Analizę każdej próbki przeprowadzono raz lub dwukrotnie (bardziej szczegółowe informacje dotyczące pierwszego porównania międzylaboratoryjnego można znaleźć w Journal of AOAC International, tom 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361).

W drugim porównaniu międzylaboratoryjnym przeanalizowano trzy mieszanki paszowe dla drobiu zawierające diklazuril w stężeniach 0,9 mg/kg (MAT 1), 1,5 mg/kg (MAT 2) i ślepą próbkę paszy (MAT 3) (szczegółowe informacje dotyczące drugiego porównania można znaleźć w sprawozdaniu technicznym JRC (2016) i w Journal of AOAC International, tom 102, nr 2, 2019, s. 646–652). Wyniki obu porównań międzylaboratoryjnych przedstawiono w poniższej tabeli.

Próbka 1 A 100

Próbka 2O 100

Próbka 3 L1

Próbka 4 Z1

Próbka 5 K1

Próbka 6

MAT 1

Próbka 7

MAT 2

Próbka 8

MAT 3

Średnia (mg/kg)

100,8

103,5

0,89

1,15

0,89

1,0

1,5

< LOQ

Sr (mg/kg)

5,88

7,64

0,15

0,02

0,03

0,11

0,07

— CVr (%)

5,83

7,38

17,32

1,92

3,34

11,2

4,5

— SR (mg/kg)

7,59

7,64

0,17

0,11

0,12

0,18

0,21

— CVR (%)

7,53

7,38

18,61

9,67

13,65

18,1

14,3

— Zawartość nominalna (mg/kg)

100

1,0

0,9

1,5

— Źródło (*1)

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Drugie porównanie z 2 015 r.

(*1)

Pierwsze porównanie z 1994 r.: Journal of AOAC International, tom 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361; drugie porównanie z 2015 r.: sprawozdanie techniczne JRC Re-validation of a method for the determination of diclazuril by collaborative study [Ponowna walidacja metody oznaczania diklazurilu w ramach porównania międzylaboratoryjnego] (2016).

L = liczba laboratoriów

n = liczba pojedynczych wartości

Sr = odchylenie standardowe powtarzalności

CVr = współczynnik zmienności powtarzalności

SR = odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności

LOQ = granica oznaczalności

9. Uwagi ogólne

Należy uprzednio wykazać, że reakcja diklazurilu jest liniowa w zakresie mierzonych stężeń.

Przynajmniej w przypadku analizy diklazurilu w mieszankach paszowych o wysokiej zawartości tłuszczu (w tym przypadku przekraczającej 12 % tłuszczu) metodę analityczną można zastąpić innymi metodami opartymi na HPLC, np. metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS), pod warunkiem że metoda alternatywna ma równoważne parametry wydajności (stopień odzysku, precyzja w warunkach powtarzalności i odtwarzalności).

G) OZNACZANIE SOLI SODOWEJ LASALOCIDU

Sól sodowa polieterowego kwasu karboksylowego wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis

Zawartość soli sodowej lasalocidu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora spektrofluometrycznego (fluorescencyjnego), jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości soli sodowej lasalocidu w paszy. Granica wykrywalności wynosi 5 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Sól sodowa lasalocidu jest ekstrahowana z próbki zakwaszonym metanolem i oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy wykorzystaniu detektora spektrofluorometrycznego (fluorescencyjnego).

3. Odczynniki

3.1. Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)

3.2. Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %

3.3. Roztwór kwasu ortofosforowego, c = 20 %

Rozcieńczyć 23,5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.2) wodą do objętości 100 ml.

3.4. 6-metylo-2-heptyloamina(1,5-dimetyloheksyloamina), w (w/w) = 99 %

3.5. Metanol do HPLC

3.6. Kwas chlorowodorowy, gęstość = 1,19 g/ml

3.7. Roztwór buforu fosforanowego, c = 0,01 mol/l

Rozpuścić 1,36 g KH2PO4 (pkt 3.1) w 500 ml wody (pkt 3.11), dodać 3,5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.2) i 10,0 ml 6-metylo-2-heptyloaminy (pkt 3.4). Dostosować pH do 4,0 przy użyciu roztworu kwasu ortofosforowego (pkt 3.3) i rozcieńczyć wodą (pkt 3.11) do objętości 1 000 ml.

3.8. Zakwaszony metanol

Przenieść 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6) do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (pkt 3.5) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.9. Faza ruchoma HPLC: roztwór buforu fosforanowego i metanolu w stosunku 5 + 95 (V +V)

Zmieszać 5 ml roztworu buforu fosforanowego (pkt 3.7) i 95 ml metanolu (pkt 3.5).

3.10. Substancja wzorcowa soli sodowej lasalocidu o gwarantowanej czystości, C34H53O8Na (sól sodowa polieterowego kwasu karboksylowego wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis), E 763.

3.10.1. Podstawowy roztwór wzorcowy soli sodowej lasalocidu, 500 μg/ml

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg soli sodowej lasalocidu (pkt 3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w zakwaszonym metanolu (pkt 3.8), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2. Pośredni roztwór wzorcowy soli sodowej lasalocidu, 50 μg/ml

Przenieść pipetą 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego soli sodowej lasalocidu (pkt 3.10.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3. Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 μg soli sodowej lasalocidu w 1 ml. Roztwory sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.11. Woda do HPLC

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa (lub łaźnia wodna z wytrząsaniem), z możliwością kontroli temperatury

4.2. Filtry membranowe, 0,45 μm

4.3. Zestaw HPLC z systemem dozowania, umożliwiający dozowanie 20 μl

4.3.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, w odwróconym układzie faz C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna

4.3.2. Spektrofluorymetr z regulacją długości fali wzbudzenia i emisji

5. Sposób postępowania

5.1.

Wskazówki ogólne

5.1.1.

Ślepa próbka paszy

W celu przeprowadzenia testu odzysku (pkt 5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy, aby sprawdzić, czy badana pasza nie zawiera soli sodowej lasalocidu i substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana i nie może zawierać lasalocidu sodu ani interferujących substancji.

5.1.2.

Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością soli sodowej lasalocidu, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 100 mg/kg, przenieść 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g paszy użytej do ślepej próbki, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie kilkakrotnie zamieszać i przejść do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością soli sodowej lasalocidu, o masie zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk oblicza się przez odjęcie od próbki wzbogaconej masy próbki niewzbogaconej.

5.2.

Ekstrakcja

5.2.1.

Pasze

Zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 do 10 g próbki do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wyposażonej w korek. Dodać przy użyciu pipety 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.8). Zamknąć luźno korkiem i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) w temperaturze około 40 °C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Pozostawić kolbę na około godzinę, dopóki zawiesina nie opadnie, następnie przefiltrować podwielokrotną część przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.2) do odpowiedniego naczynia. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2.

Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 2 g nierozdrobnionego premiksu do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.8) i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę z zawartością w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) w temperaturze około 40 °C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć do pełnej objętości zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i dokładnie wymieszać. Pozostawić kolbę na godzinę, dopóki zawiesina nie opadnie, następnie przefiltrować podwielokrotną część przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.2). Rozcieńczyć odpowiednią objętość klarownego filtratu przy użyciu zakwaszonego metanolu (pkt 3.8) w celu otrzymania finalnego roztworu do badań zawierającego około 4 μg/ml soli sodowej lasalocidu. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3.

Oznaczanie HPLC

5.3.1.

Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile pozwalają uzyskać równoważne wyniki:

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.3.1):

125 mm × 4 mm, w odwróconym układzie faz C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.9):

Mieszanina roztworu buforu fosforanowego (pkt 3.7) i metanolu (pkt 3.5), 5 + 95 (V + V)

Prędkość przepływu:

1,2 ml/min

Długość fali przy detekcji:

Wzbudzenie: 310 nm

Emisja: 419 nm

Dozowana objętość:

20 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.10.3) zawierający 4,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.3.2.

Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) piku na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3.

Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakty próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików soli sodowej lasalocidu.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) piku otrzymanej po zadozowaniu roztworu próbki (pkt 5.3.3) określić stężenie soli sodowej lasalocidu (w μg/ml), odnosząc się do krzywej kalibracyjnej.

6.1.

Pasze

Zawartość soli sodowej lasalocidu: w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

objętość w ml ekstraktu próbki zgodnie z pkt 5.2.1 (tj. 100)

masa naważki w g

6.2.

Premiksy

Zawartość soli sodowej lasalocidu: w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

objętość w ml ekstraktu próbki zgodnie z pkt 5.2.2 (tj. 250)

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2.2

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Sprawdzenie tożsamości

Metody bazujące na detekcji spektrofluorometrycznej są mniej podatne na interferencje niż metody z zastosowaniem detekcji UV. Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą.

7.1.1.

Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) jest wzbogacany odpowiednią ilością roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.3). Ilość dodanej soli sodowej lasalocidu musi odpowiadać ilości soli sodowej lasalocidu w ekstrakcie próbki. Po uwzględnieniu ilości dodanej soli sodowej lasalocidu i rozcieńczenia ekstraktu zwiększyć się może tylko wysokość piku soli sodowej lasalocidu. Szerokość piku w połowie wysokości musi mieścić się w zakresie ± 10 % oryginalnej szerokości piku niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.2.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 15 % względem wyższej wartości, dla zawartości soli sodowej lasalocidu od 30 mg/kg do 100 mg/kg,

— 15 mg/kg dla zawartości soli sodowej lasalocidu od 100 mg/kg do 200 mg/kg,

— 7,5 % względem wyższej wartości, dla zawartości soli sodowej lasalocidu powyżej 200 mg/kg.

7.3.

Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki paszy odzysk nie może być niższy niż 80 %. W przypadku wzbogaconych próbek premiksów odzysk nie może być niższy niż 90 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego () laboratoriów przeprowadziło analizę 2 premiksów (próbki 1 i 2) oraz 5 pasz (próbki 3–7). Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 1

Premiks dla kurcząt

Próbka 2

Premiks dla indyków

Próbka 3

Śruty dla indyków

Próbka 4

Granulki dla kurcząt

Próbka 5

Pasza dla indyków

Próbka 6

Pasza dla drobiu A

Próbka 7

Pasza dla drobiu B

Średnia [mg/kg]

5 050

16 200

76,5

78,4

92,9

48,3

32,6

sr [mg/kg]

107

408

1,71

2,23

2,27

1,93

1,75

CVr [%]

2,12

2,52

2,24

2,84

2,44

4,00

5,37

sR [mg/kg]

286

883

3,85

7,32

5,29

3,47

3,49

CVR [%]

5,66

5,45

5,03

9,34

5,69

7,18

10,70

Zawartość nominalna [mg/kg]

5 000 (*2)

16 000 (*2)

80 (*2)

105 (*2)

120 (*2)

50 ()

35 ()

(*1)

Analyst nr 120 z 1995 r., s. 2175–2180.

(*2)

Zawartość zadeklarowana przez producenta.

(1) Pasza przygotowana w laboratorium.

L= liczba laboratoriów

n= liczba poszczególnych wyników

sr= odchylenie standardowe powtarzalności

sR= odchylenie standardowe odtwarzalności

CVr= współczynnik zmienności powtarzalności w %

CVR= współczynnik zmienności odtwarzalności w %

H) OZNACZANIE CHLOROWODORKU AMPROLIUM

monochlorowodorek chlorku 1-[(4-amino-2-propylo-5-pirymidynylo)metylo]-2-metylopirydyny

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości amprolium w paszy. Granica wykrywalności wynosi 1 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana mieszaniną metanolu i wody. Po rozcieńczeniu fazą ruchomą i filtrowaniu przez filtr membranowy zawartość amprolium jest oznaczana metodą kationowymiennej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy wykorzystaniu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1. Metanol

3.2. Acetonitryl do HPLC

3.3. Woda do HPLC

3.4. Roztwór diwodorofosforanu sodu, c = 0,1 mol/l

Rozpuścić 13,80 g monohydratu diwodorofosforanu sodu w wodzie (pkt 3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (pkt 3.3) i wymieszać.

3.5. Roztwór nadchloranu sodu, c = 1,6 mol/l

Rozpuścić 224,74 g monohydratu nadchloranu sodu w wodzie (pkt 3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (pkt 3.3) i wymieszać.

3.6. Faza ruchoma do HPLC (zob. objaśnienia pkt 9.1)

Mieszanina acetonitrylu (pkt 3.2), roztworu diwodorofosforanu sodu (pkt 3.4) i roztworu nadchloranu sodu (pkt 3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Przed użyciem przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm (pkt 4.3) i odgazować roztwór (np. przy zastosowaniu łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) co najmniej przez 15 minut).

3.7. Substancja wzorcowa: czyste amprolium, chlorek 1-[(4-amino-2-propylo-5-pirymidynylo)metylo]-2-metylopirydyny, E 750 (zob. pkt 9.2)

3.7.1. Podstawowy roztwór wzorcowy amprolium, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg amprolium (pkt 3.7) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w 80 ml metanolu (pkt 3.1) i umieścić kolbę na 10 minut w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4). Następnie doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Roztwór w temperaturze ≤ 4 °C zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.7.2. Pośredni roztwór wzorcowy amprolium, 50 μg/ml

Przenieść pipetą 5,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym (pkt 3.8) i wymieszać. Roztwór w temperaturze ≤ 4 °C zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.7.3. Roztwory kalibracyjne

Przenieść 0,5, 1,0 i 2,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.2) do kolb miarowych o pojemności 50 ml. Uzupełnić do pełnej objętości fazą ruchomą (pkt 3.6) i wymieszać. Roztwory odpowiadają odpowiednio 0,5, 1,0 i 2,0 μg/ml amprolium. Roztwory sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.8. Rozpuszczalnik ekstrakcyjny

Mieszanina metanolu (pkt 3.1) i wody, 2 + 1 (v + v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Zestaw HPLC z systemem dozowania, umożliwiający dozowanie 100 μl

4.1.1. Kolumna do chromatografii cieczowej o wymiarach 125 mm × 4 mm, wymieniacz kationowy Nucleosil 10 SA, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

4.1.2. Detektor UV z regulacją długości fali lub detektor diodowy

4.2. Filtr membranowy, PTFE, 0,45 μm

4.3. Filtr membranowy, 0,22 μm

4.4. Łaźnia ultradźwiękowa

4.5. Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

5. Sposób postępowania

5.1.

Wskazówki ogólne

5.1.1.

Ślepa próbka paszy

W celu przeprowadzenia testu odzysku (pkt 5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy, aby sprawdzić, czy nie zawiera ona amprolium i substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności amprolium lub substancji interferujących.

5.1.2.

Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością amprolium, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Aby wzbogacić na poziomie 100 mg/kg, dodać 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g paszy przeznaczonej do ślepej próbki, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie kilkakrotnie zamieszać i przejść do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością amprolium, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki wzbogaconej masy próbki niewzbogaconej.

5.2.

Ekstrakcja

5.2.1.

Premiksy (zawartość amprolium < 1 %) i pasza

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 do 40 g próbki, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (pkt 4.5). Rozcieńczyć podwielokrotną część ekstraktu fazą ruchomą (pkt 3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i wymieszać (zob. objaśnienia pkt 9.3). Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (pkt 4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2.

Premiksy (zawartość amprolium ≥ 1 %)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 1 do 4 g premiksu, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (pkt 4.5). Rozcieńczyć podwielokrotną część ekstraktu fazą ruchomą (pkt 3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i wymieszać. Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (pkt 4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3.

Oznaczanie HPLC

5.3.1.

Parametry:

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.1.1):

125 mm × 4 mm, wymieniacz kationowy Nucleosil 10 SA, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.6):

mieszanina acetonitrylu (pkt 3.2), roztworu diwodorofosforanu sodu (pkt 3.4) i roztworu nadchloranu sodu (pkt 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v)

Prędkość przepływu:

0,7 –1 ml/min

Długość fali przy detekcji:

264 nm

Dozowana objętość:

100 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.7.3) zawierający 1,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2.

Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z kalibracyjnych roztworów (pkt 3.7.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych i odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3.

Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików amprolium.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików amprolium roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.3.2).

Zawartość amprolium: w (w mg/kg) próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego w ml (pkt 3.8) zgodnie z pkt 5.2 (tj. 200 ml)

stężenie amprolium w μg/ml w ekstrakcie próbki (5.2)

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1.

Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (pkt 5.2) i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.7.3) zawierającego 2,0 μg/ml.

7.1.1.

Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2) wzbogaca się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.7.3). Ilość dodanego amprolium musi odpowiadać ilości amprolium znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku amprolium. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku amprolium niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.1.2.

Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

b) w zakresie od 210 do 320 nm widma próbki i wzorca zapisane w maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 210 do 320 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 15 % względem wyższej wartości dla zawartości amprolium od 25 mg/kg do 500 mg/kg,

— 75 mg/kg dla zawartości amprolium od 500 do 1 000 mg/kg,

— 7,5 % względem wyższej wartości dla zawartości amprolium powyżej 1 000 mg/kg.

7.3.

Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki odzysk musi wynosić co najmniej 90 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego przeprowadzono analizę trzech pasz dla drobiu (próbki 1–3), mieszanki paszowej mineralnej (próbka 4) i premiksu (próbka 5). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 1 (ślepa próbka paszy)

Próbka 2

Próbka 3

Próbka 4

Próbka 5

Średnia [mg/kg]

– 45,5

188

5 129

25 140

sr [mg/kg]

– 2,26

3,57

178

550

CVr [%]

– 4,95

1,90

3,46

2,20

sR [mg/kg]

– 2,95

11,8

266

760

CVR [%]

– 6,47

6,27

5,19

3,00

Zawartość nominalna [mg/kg]

– 50

200

5 000

25 000

L: liczba laboratoriów

n: liczba pojedynczych wartości

sr: odchylenie standardowe powtarzalności

CVr: współczynnik zmienności powtarzalności

sR: odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR: współczynnik zmienności odtwarzalności

9. Objaśnienia

9.1. Jeżeli próbka zawiera tiaminę, pik tiaminy na chromatogramie ukazuje się na krótko przed pikiem amprolium. W tej metodzie amprolium i tiaminę należy rozdzielić. Jeżeli amprolium i tiamina nie zostaną rozdzielone w kolumnie (pkt 4.1.1) użytej w tej metodzie, zastąpić do 50 % acetonitrylu fazy ruchomej (pkt 3.6) metanolem.

9.2. Według Farmakopei Brytyjskiej widmo roztworu amprolium: (c = 0,02 mol/l) w kwasie chlorowodorowym (c = 0,1 mol/l) wykazuje maksima przy 246 nm i 262 nm. Absorbancja musi wynieść 0,84 przy 246 nm i 0,80 przy 262 nm.

9.3. Ekstrakt zawsze rozcieńcza się fazą ruchomą, gdyż w przeciwnym razie czas retencji piku amprolium może się znacznie przesunąć z uwagi na zmiany siły jonowej.

I) OZNACZANIE NARAZYNY

Zawartość narazyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

J) OZNACZANIE NIKARBAZYNY

Zawartość nikarbazyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN 15782 Pasze – Oznaczanie nikarbazyny – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

K) OZNACZANIE DEKOKWINATU

Zawartość dekokwinatu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN 16162 Pasze – Oznaczanie dekokwinatu metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

L) OZNACZANIE MONENZYNY

Zawartość monenzyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

M) OZNACZANIE SALINOMYCYNY

Zawartość salinomycyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

N) OZNACZANIE SEMDURAMYCYNY

Zawartość semduramycyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody określonej w normie EN 16158 Pasze – Oznaczanie zawartości semduramycyny – Metoda chromatografii cieczowej z zastosowaniem „rozgałęzionego” podejścia analitycznego.

O) NORMY EN

Do celów stosowania art. 34 ust. 2 lit. a) rozporządzenia (UE) 2017/625 istotne są następujące normy EN:

EN ISO 30024 Pasze – Oznaczanie aktywności fitazy

EN 17050 Pasze – Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie jodu w paszach metodą ICP-MS

EN 17550 Pasze: Oznaczanie karotenoidów w mieszankach paszowych dla zwierząt i w premiksach metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja UV (HPLC-UV)

EN 15784 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Bacillus spp.

EN 15785 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Bifidobacterium spp.

EN 15786 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Pediococcus spp.

EN 15787 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Lactobacillus spp. stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15788 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Enterococcus (E. faecium) spp. stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15789 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Saccharomyces cerevisiae stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15510 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, kobaltu, molibdenu i ołowiu z zastosowaniem ICP-AES (do celów analizy dodatków paszowych kobalt i molibden)

EN 15621 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, siarki, żelaza, cynku, miedzi, manganu i kobaltu po mineralizacji ciśnieniowej metodą ICP-AES (do celów analizy kobaltu jako dodatku paszowego)

EN 16159 Pasze – Oznaczanie selenu metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z generowaniem wodorków (HGAAS) po trawieniu z zastosowaniem mikrofal (trawienie 65 % kwasem azotowym(V) i 30 % nadtlenkiem wodoru) (do analizy selenu jako dodatku paszowego)

EN 17053: Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pierwiastków śladowych, metali ciężkich i innych pierwiastków w paszy metodą ICP-MS (metoda wielopierwiastkowa) (do analizy kobaltu, molibdenu i selenu jako dodatków paszowych)

Tekst urzędowy w EUR-Lex. Lexeva pokazuje treść przepisu, nie udziela porad prawnych. Moc prawną ma wyłącznie tekst opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.