Załącznik VI

1. CEL I ZAKRES

Składniki pochodzenia zwierzęcego w paszach oznacza się metodą mikroskopii świetlnej lub łańcuchową reakcją polimerazy (PCR), zgodnie z przepisami określonymi w niniejszym załączniku.

Te dwie metody umożliwiają wykrycie występowania składników pochodzenia zwierzęcego w premiksach, materiałach paszowych i mieszankach paszowych. Nie umożliwiają one jednak obliczenia ilości takich składników w premiksach, materiałach paszowych i mieszankach paszowych. W przypadku obu metod granica wykrywalności wynosi poniżej 0,1 % (w/w).

Metoda PCR umożliwia określenie grupy taksonomicznej składników pochodzenia zwierzęcego obecnych w premiksach, materiałach paszowych i mieszankach paszowych.

Metody te stosuje się do kontroli stosowania zakazów ustanowionych w art. 7 ust. 1 rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 999/2001 (

45

), w załączniku IV do tego rozporządzenia oraz w art. 11 ust. 1 rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1069/2009 (

46

).

W zależności od rodzaju badanej paszy metody te mogą być stosowane, w ramach jednego protokołu operacyjnego, samodzielnie albo wspólnie, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi, ustanowionymi przez laboratorium referencyjne UE ds. białek zwierzęcych w paszach (EURL-AP) i opublikowanymi na jego stronie internetowej (

47

).

2. METODY

2.1.

Metoda mikroskopii świetlnej

2.1.1.

Zasada

Składniki pochodzenia zwierzęcego, które mogą być obecne w premiksach, materiałach paszowych i mieszankach paszowych przesłanych do analizy, są identyfikowane na podstawie typowych i mikroskopowo identyfikowalnych cech charakterystycznych, np. włókien mięśniowych i innych cząstek tkanki mięsnej, chrząstki, kości, rogów, włosów, szczeciny, fragmentów kutykuli bezkręgowców, elementów układu tchawkowego insektów, produktów z krwi, globulek mleka, kryształów laktozy, piór, skorup jaj, ości ryb i łusek.

Badania mikroskopowe przeprowadza się po przygotowaniu próbek poprzez sedymentację.

Próbki poddaje się sedymentacji w następujący sposób:

a) w celu wykrycia składników pochodzenia zwierzęcego innych niż pochodzących z bezkręgowców lądowych – pojedyncza sedymentacja przy użyciu tetrachloroetylenu, jak określono w pkt 2.1.3.4.3;

b) w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych – podwójna sedymentacja przy użyciu eteru naftowego/tetrachloroetylenu, jak określono w pkt 2.1.3.4.4.

2.1.2.

Odczynniki i sprzęt

2.1.2.1. Odczynniki

2.1.2.1.1. Odczynnik zagęszczający

— Tetrachloroetylen (gęstość 1,62).

— Eter naftowy, temperatura wrzenia: 40–60 °C (masa właściwa 0,65).

2.1.2.1.2. Odczynnik barwiący

— Roztwór czerwieni alizarynowej (rozcieńczyć 2,5 ml 1 M kwasu chlorowodorowego w 100 ml wody i dodać do tego roztworu 200 mg czerwieni alizarynowej).

2.1.2.1.3. Środki zamykające

— Ług (NaOH 2,5 %, w/v lub KOH 2,5 %, w/v)

— Glicerol (nierozcieńczony, lepkość: 1 490 cP) lub środek zamykający o równoważnych właściwościach do przygotowania nietrwałych preparatów mikroskopowych.

— Norland ® Optical Adhesive 65 (lepkość: 1 200 cP) lub żywica o równoważnych właściwościach do przygotowania trwałych preparatów mikroskopowych.

2.1.2.1.4. Środki zamykające o właściwościach barwiących

— Płyn Lugola (rozpuścić 2 g jodku potasu w 100 ml wody i dodać 1 g jodu, często wstrząsając).

— Odczynnik cystynowy (2 g octanu ołowiu, 10 g NaOH/100 ml wody).

— Odczynnik Fehlinga (sporządzony przed użyciem z równych części (1/1) roztworów podstawowych A i B: roztwór A: rozpuścić 6,9 g pentahydratu siarczanu miedzi(II) w 100 ml wody; roztwór B: rozpuścić 34,6 g tetrahydratu winianu potasowo-sodowego i 12 g NaOH w 100 ml wody).

— Tetrametylobenzydyna/nadtlenek wodoru (rozpuścić 1 g 3,3’,5,5’ tetrametylobenzydyny (TMB) w 100 ml kwasu octowego lodowatego i 150 ml wody. Przed użyciem zmieszać 4 części tego roztworu TMB z 1 częścią 3 % nadtlenku wodoru).

2.1.2.1.5. Odczynniki chemiczne do płukania

— Etanol ≥ 96 % (techniczny).

— Aceton (techniczny).

2.1.2.1.6. Odczynnik bielący

— Handlowy roztwór podchlorynu sodowego (9–14 % aktywnego chloru).

2.1.2.2. Sprzęt

— Waga analityczna ważąca z dokładnością do 0,001 g.

— Sprzęt do rozdrabniania: nóż lub młynek wirnikowy. Jeżeli stosowany jest młynek wirnikowy, sita do młynka ≤ 0,5 mm są zakazane.

— Sita o kwadratowych oczkach o szerokości 0,25 mm i 1 mm. Z wyjątkiem wstępnego przesiewu próbki średnica sit nie powinna przekraczać 10 cm, aby uniknąć strat materiałów. Kalibracja sit nie jest wymagana.

— Szklany stożkowy rozdzielacz o pojemności 250 ml z kranem z teflonu lub szkła szlifowanego u podstawy stożka. Średnica otworu kranu musi wynosić ≥ 4 mm. Alternatywnie, wyłącznie w przypadku pojedynczej sedymentacji przy użyciu tetrachloroetylenu, można użyć zlewki osadowej ze stożkowym dnem, pod warunkiem że laboratorium wykazało, iż poziomy wykrywalności są równoważne z poziomami uzyskanymi przy użyciu szklanego rozdzielacza.

Rozdzielacz

— Mikroskop stereoskopowy umożliwiający powiększenie końcowe w zakresie co najmniej 6,5x–40x.

— Mikroskop złożony, z jasnym polem widzenia, umożliwiający powiększenie końcowe w zakresie co najmniej 100x–400x. Dodatkowo można wykorzystać światło spolaryzowane i kontrast interferencyjno-różniczkowy.

— Standardowe szkło laboratoryjne.

— Sprzęt do przygotowania preparatów mikroskopowych: podstawowe szkiełka mikroskopowe, szkiełka podstawowe z wgłębieniem, szkiełka nakrywkowe (20x20 mm), pincety, cienka łopatka.

— Suszarka laboratoryjna.

— Wirówka.

— Bibuła filtracyjna: filtr celulozowy jakościowy (rozmiar porów 4–11 μm).

2.1.3.

Pobieranie i przygotowywanie próbek

2.1.3.1. Pobieranie próbek

Należy użyć reprezentatywnej próbki, pobranej zgodnie z załącznikiem I.

2.1.3.1.1. Suszenie próbek

Próbki o wilgotności > 14 % muszą być przed obróbką wysuszone zgodnie z załącznikiem III.

2.1.3.1.2. Wstępny przesiew próbki

w celu zebrania informacji na temat możliwego zanieczyszczenia środowiskowego pasz zaleca się wstępne przesianie pasz granulowanych i ziarnistych przez sito o oczkach 1 mm, a następnie przygotowanie i analizę dwóch uzyskanych frakcji, które należy traktować jako odrębne próbki, i przedstawienie wyników dotyczących tych dwóch frakcji.

2.1.3.2. Niezbędne środki ostrożności

W celu uniknięcia w laboratorium zanieczyszczenia krzyżowego wszelki sprzęt wielokrotnego użytku należy starannie czyścić przed użyciem. Części rozdzielacza muszą być demontowane przed czyszczeniem. Części rozdzielacza oraz szkło laboratoryjne należy wstępnie wymyć ręcznie, a następnie wymyć w zmywarce. Sita czyści się z użyciem szczotki o twardym syntetycznym włosiu. Po przesianiu substancji tłuszczowej, np. mączki rybnej, zaleca się ostateczne czyszczenie sit acetonem i sprężonym powietrzem.

2.1.3.3. Przygotowanie próbek składających się z tłuszczu lub oleju

Do przygotowania próbek składających się z tłuszczu stosuje się następujący protokół:

— jeżeli tłuszcz znajduje się w stanie stałym, należy go ogrzewać w suszarce aż do uzyskania postaci płynnej.

— Pipetą przenieść 40 ml tłuszczu lub oleju z dna próbki do probówki wirówkowej.

— Próbkę wiruje się przez 10 minut przy 4 000 obr./min.

— Jeżeli tłuszcz jest zestalony po odwirowaniu, należy go ogrzewać w suszarce aż do uzyskania postaci płynnej.

— Wirowanie należy powtórzyć przez 5 minut przy 4 000 obr./min.

— Małą łyżką lub łopatką laboratoryjną przenieść połowę zdekantowanych zanieczyszczeń na szkiełka mikroskopowe w celu zbadania. Jako środek zamykający zaleca się glicerynę.

— Pozostałe zanieczyszczenia wykorzystuje się do przygotowania osadu w sposób opisany w pkt 2.1.3.4.3 tiret pierwsze.

Ten sam protokół, z wyjątkiem tiret pierwszego i czwartego, stosuje się do przygotowania próbek składających się z oleju.

2.1.3.4. Przygotowanie próbek innych niż tłuszczu lub oleju

2.1.3.4.1. Pobieranie podpróbek i rozdrabnianie: z co najmniej 50 g próbki należy utworzyć podpróbkę do analizy, a następnie rozdrobnić.

2.1.3.4.2. Przygotowanie surowca: należy przygotować co najmniej 5 g porcję rozdrobnionej podpróbki. Należy ją przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje.

2.1.3.4.3. Pojedyncza sedymentacja przy użyciu tetrachloroetylenu w celu wykrycia składników pochodzenia zwierzęcego innych niż pochodzących z bezkręgowców lądowych.

— Ekstrakcja i przygotowanie osadu:

porcję rozdrobnionej podpróbki o masie 10 g (z dokładnością do 0,01 g) umieszcza się w rozdzielaczu lub zlewce osadowej ze stożkowym dnem i dodaje się 50 ml tetrachloroetylenu. Porcję umieszczoną w rozdzielaczu ogranicza się do 3 g w przypadku mączki rybnej lub innych czystych produktów zwierzęcych, składników mineralnych lub premiksów, które wytwarzają więcej niż 10 % osadu. Mieszaniną należy wstrząsać energicznie przez co najmniej 30 sekund i ostrożnie dodać kolejne 50 ml tetrachloroetylenu, zmywając wewnętrzną powierzchnię rozdzielacza, aby usunąć wszelkie przylegające cząstki. Otrzymaną mieszaninę należy pozostawić na co najmniej 5 minut przed oddzieleniem osadu poprzez otwarcie kranu.

W przypadku użycia zlewki osadowej ze stożkowym dnem mieszaninę należy energicznie mieszać przez co najmniej 15 sekund, a wszelkie cząstki przylegające do ścianek zlewki należy ostrożnie zmyć z wewnętrznej powierzchni, stosując co najmniej 10 ml czystego tetrachloroetylenu. Mieszaninę należy pozostawić na 3 minuty, a następnie mieszać ponownie przez 15 sekund, a wszelkie cząstki przylegające do ścianek zlewki należy ostrożnie zmyć z wewnętrznej powierzchni, stosując co najmniej 10 ml czystego tetrachloroetylenu. Otrzymaną mieszaninę należy pozostawić na co najmniej 5 minut, a następnie usunąć płynną frakcję poprzez staranną dekantację, przy czym należy uważać, aby nie utracić części osadu.

Osad należy zebrać na bibule filtracyjnej umieszczonej w lejku, aby umożliwić oddzielenie pozostałego trójchloroetylenu, unikając osadzania się tłuszczu w osadzie. Osad należy osuszyć. Zaleca się następnie zważyć osad (z dokładnością do 0,001 g) w celu kontroli etapu sedymentacji. Na koniec osad należy przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje, chyba że przesiewania nie uznaje się za konieczne.

— Ekstrakcja i przygotowanie flotatu:

po odzyskaniu osadu metodą opisaną powyżej, w rozdzielaczu powinny pozostać dwie fazy: faza płynna składająca się z tetrachloroetylenu oraz faza stała utworzona z materiału flotacyjnego. Ta faza stała jest flotatem i należy ją odzyskać poprzez całkowite odlanie tetrachloroetylenu z rozdzielacza przez otwarcie kranu. Poprzez odwrócenie rozdzielacza flotat przenosi się na dużą płytkę Petriego i suszy powietrzem w okapie wyciągowym. Należy go przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje.

— Stosowanie odczynników barwiących:

w celu ułatwienia poprawnej identyfikacji składników pochodzenia zwierzęcego, podczas przygotowania próbki laborant może używać odczynników barwiących zgodnie z wytycznymi wydanymi przez EURL-AP i opublikowanymi na jego stronie internetowej.

W przypadku użycia do barwienia osadu roztworu czerwieni alizarynowej stosuje się następujący protokół:

— wysuszony osad przenieść do szklanej probówki i dwukrotnie przepłukać stosując około 5 ml etanolu (za każdym razem stosować wstrząsarkę przez 30 s, rozpuszczalnik pozostawić na około 1 min 30 s do osadzenia i następnie go odlać).

— Osad wybielić przez dodanie co najmniej 1 ml roztworu podchlorynu sodowego. Pozwolić na przebieg reakcji przez 10 minut. Probówkę napełnić wodą, poczekać 2–3 minuty na osadzenie się osadu, a wodę z zawieszonymi cząstkami delikatnie odlać.

— Osad przepłukać jeszcze dwukrotnie około 10 ml wody (za każdym razem stosować wstrząsarkę przez 30 s, pozostawić do osadzenia i odlać wodę).

— Dodać 2 do 10 kropli roztworu czerwieni alizarynowej, a następnie mieszaninę wymieszać wstrząsarką. Pozwolić na przebieg reakcji przez 30 s i dwukrotnie przepłukać zabarwiony osad stosując około 5 ml etanolu, a następnie przepłukać go raz acetonem (za każdym razem stosować wstrząsarkę przez 30 s, rozpuszczalnik pozostawić na około 1 min do osadzenia i następnie go odlać).

— Zabarwiony osad należy osuszyć.

2.1.3.4.4. Podwójna sedymentacja przy użyciu eteru naftowego/tetrachloroetylenu w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych.

Wszystkie czynności wykonuje się w szklanym stożkowym rozdzielaczu o pojemności 250 ml, jak opisano w pkt 2.1.2.2 tiret czwarte.

— Porcję 10 g (z dokładnością do 0,01 g) zmielonej podpróbki należy przenieść do rozdzielacza i najpierw poddać pojedynczej sedymentacji przy użyciu tetrachloroetylenu, jak opisano w pkt 2.1.3.4.3, w tym odzyskowi osadu na bibule filtracyjnej umieszczonej na rozdzielaczu. Osad ten można wykorzystywać jak osad uzyskany przy zastosowaniu metody z pkt 2.1.3.4.3.

— Niewielką ilość tetrachloroetylenu odsączonego wraz z osadem należy przenieść do cylindra pomiarowego. Otwierając kran rozdzielacza, cylinder pomiarowy należy napełnić dalej do uzyskania 30 ml tetrachloroetylenu. Po osiągnięciu tej objętości należy zamknąć kran.

— Zebraną ilość tetrachloroetylenu zastępuje się dodaniem do rozdzielacza 30 ml eteru naftowego o temperaturze wrzenia 40–60 °C. Zawartość rozdzielacza należy dokładnie wymieszać w celu uzyskania mieszaniny eteru naftowego (30 %) i tetrachloroetylenu (70 %) (o gęstości ok. 1,26 g.cm-3). Pozostawić materiał do osadzenia przez 10 minut. Wydzielą się dwie nowe frakcje: drugi osad i flotat końcowy (< 1,26 g.cm-3). Drugi osad należy odzyskać na płytce Petriego (lub bibule filtracyjnej umieszczonej na rozdzielaczu) poprzez otwarcie kranu do momentu gdy w rozdzielaczu pozostanie tylko niewielka ilość mieszaniny rozpuszczalników i flotatu końcowego. Pozostałą ciecz i flotat końcowy należy zebrać oddzielnie na bibułę filtracyjną umieszczoną na rozdzielaczu. Ścianę rozdzielacza należy spłukać strumieniem eteru naftowego w celu zebrania całego materiału z flotatu końcowego. Flotat końcowy należy pozostawić do wyschnięcia. Flotat końcowy należy przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych, chyba że przesiewania nie uznaje się za konieczne.

2.1.4.

Badanie mikroskopowe

2.1.4.1. Przygotowanie preparatów

Preparaty mikroskopowe przygotowuje się z osadu i, w zależności od wyboru laboranta, z flotatu albo z surowca. W stosownych przypadkach, wyłącznie w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych, należy również przygotować preparaty z flotatu końcowego uzyskanego zgodnie z opisem w pkt 2.1.3.4.4. Należy przygotować dwie uzyskane frakcje (drobną i gruboziarnistą). Naważki z frakcji rozprowadzone w preparatach muszą być reprezentatywne dla całej frakcji.

Należy przygotować wystarczającą liczbę preparatów w celu zapewnienia pełnej realizacji protokołu badawczego określonego w pkt 2.1.4.2.

Preparaty mikroskopowe montuje się przy użyciu odpowiedniego środka zamykającego zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej. Preparaty należy przykryć szkiełkami nakrywkowymi.

2.1.4.2. Diagram obserwacji w celu wykrycia cząstek zwierzęcych w mieszankach paszowych, materiałach paszowych i premiksach.

Preparaty mikroskopowe bada się zgodnie z diagramami obserwacji przedstawionymi na schematach 1 i 2.

Przy użyciu mikroskopu złożonego przeprowadza się obserwację mikroskopową osadu i, w zależności od wyboru laboranta, flotatu lub surowca. Dodatkowo w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych należy również przeprowadzić obserwację flotatu końcowego uzyskanego zgodnie z opisem w pkt 2.1.3.4.4 przedstawionym na schemacie 3. W przypadku frakcji gruboziarnistych poza mikroskopem złożonym można dodatkowo użyć mikroskopu stereoskopowego. Każdy preparat należy obserwować w całości, stosując różne powiększenia. Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące sposobu korzystania z diagramów są szczegółowo określone w standardowej procedurze operacyjnej ustalonej przez EURL-AP i opublikowanej na jego stronie internetowej.

Należy ściśle przestrzegać minimalnej liczby preparatów, jakie zgodnie z diagramami obserwacji należy obserwować na każdym etapie, chyba że cały podzielony na frakcje materiał nie pozwala osiągnąć wymaganej liczby preparatów, na przykład w przypadku, gdy nie uzyskano osadu. Nie można stosować więcej niż 6 preparatów na jedno oznaczenie do rejestrowania liczby cząstek stałych.

Jeżeli sporządza się dodatkowe preparaty na flotacie lub na surowcu z zastosowaniem bardziej specyficznego środka zamykającego o właściwościach barwiących, określonego w pkt 2.1.2.1.4, aby dokładniej scharakteryzować struktury (np. pióra, włosy, cząstki tkanki mięsnej lub krwi), które wykryto w preparatach przygotowanych przy pomocy innych środków zamykających, określonych w pkt 2.1.2.1.3, liczba cząstek stałych jest liczona na podstawie liczby preparatów na jedno oznaczenie, nieprzekraczającej 6, z uwzględnieniem dodatkowych preparatów z bardziej specyficznym środkiem zamykającym. Dodatkowych preparatów przygotowanych z flotatu końcowego uzyskanego zgodnie z opisem w pkt 2.1.3.4.4 w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych nie uwzględnia się przy identyfikacji innych gatunków (kręgowców lądowych i ryb).

W celu ułatwienia identyfikacji rodzaju oraz pochodzenia cząstek laborant może wykorzystać narzędzia pomocnicze, takie jak systemy wspomagające podejmowanie decyzji, biblioteki obrazów oraz próbki referencyjne.

Schemat 1

Diagram obserwacji po pojedynczej sedymentacji przy użyciu tetrachloroetylenu w celu wykrycia cząstek zwierzęcych innych niż pochodzące z bezkręgowców lądowych w mieszankach paszowych, materiałach paszowych i premiksach na potrzeby pierwszego oznaczenia

Schemat 2

Diagram obserwacji po pojedynczej sedymentacji przy użyciu tetrachloroetylenu w celu wykrycia cząstek zwierzęcych innych niż pochodzące z bezkręgowców lądowych w mieszankach paszowych, materiałach paszowych i premiksach na potrzeby drugiego oznaczenia

Schemat 3

Diagram obserwacji po podwójnej sedymentacji przy użyciu eteru naftowego/tetrachloroetylenu w celu wykrycia składników pochodzących z bezkręgowców lądowych w mieszankach paszowych, materiałach paszowych i premiksach

2.1.4.3. Liczba oznaczeń

Oznaczenia wykonuje się na różnych podpróbkach o masie po 50 g każda.

Jeżeli w wyniku pierwszego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 1 lub, w stosownych przypadkach, schemacie 3 nie wykryto żadnej cząstki zwierzęcej, dodatkowe oznaczanie nie jest konieczne, a wynik analizy przekazuje się, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.1.

Jeżeli w wyniku pierwszego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 1 wykryto cząstkę zwierzęcą lub cząstki zwierzęce danego rodzaju (tj. kręgowca lądowego lub ryby), a rodzaj wykrytych cząstek potwierdza deklarowaną zawartość próbki, drugie oznaczenie nie jest konieczne. Jeżeli liczba cząstek zwierzęcych danego rodzaju wykrytych podczas pierwszego oznaczenia jest wyższa niż 5, wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.3. W przeciwnym wypadku wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.2.

Jeżeli w wyniku pierwszego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 3 wykryto ponad 5 cząstek zwierzęcych pochodzących z bezkręgowców lądowych, drugie oznaczanie nie jest konieczne, a wynik analizy dla tego rodzaju zwierzęcia przekazuje się, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.3.

We wszystkich innych przypadkach, w tym gdy do laboratorium nie dostarczono żadnej deklaracji zawartości, przeprowadza się drugie oznaczenie z nowej podpróbki. Jeżeli w wyniku drugiego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 2 lub, w stosownych przypadkach, schemacie 3 suma cząstek zwierzęcych danego rodzaju wykrytych podczas dwóch oznaczeń jest wyższa niż 10, wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.3. W przeciwnym wypadku wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując sformułowania określone w pkt 2.1.5.2.

2.1.5.

Przedstawianie wyników

Przekazując wyniki, laboratorium musi podać, jakiego typu materiał poddano analizie (osad, flotat, flotat końcowy czy surowiec). W sprawozdaniu należy wyraźnie wskazać, ile oznaczeń wykonano oraz czy nie przeprowadzono przesiewu frakcji przed sporządzeniem preparatu zgodnie z pkt 2.1.3.4.3 tiret pierwsze akapit trzeci lub pkt 2.1.3.4.4 tiret trzecie.

Sprawozdanie laboratoryjne musi zawierać co najmniej informacje o występowaniu składników pochodzących z kręgowców lądowych i z ryb.

Sprawozdania dotyczące poszczególnych przypadków należy składać w następujący sposób.

2.1.5.1. Nie wykryto żadnych cząstek zwierzęcych danego rodzaju:

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce nie wykryto żadnych cząstek pochodzących z kręgowców lądowych.”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce nie wykryto żadnych cząstek pochodzących z ryb.”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce nie wykryto żadnych cząstek pochodzących z bezkręgowców lądowych.”

2.1.5.2. Od 1 do 5 cząstek zwierzęcych danego rodzaju wykrytych po wykonaniu tylko jednego oznaczenia lub od 1 do 10 cząstek danego rodzaju wykrytych w przypadku dwóch oznaczeń (liczba wykrytych cząstek jest poniżej decyzyjnej wartości granicznej ustanowionej w standardowej procedurze operacyjnej (SOP) ustalonej przez EURL-AP i opublikowanej na jego stronie internetowej):

W przypadku gdy wykonano tylko jedno oznaczenie:

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto nie więcej niż 5 cząstek pochodzących z kręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [kości, chrząstki, mięśnie, sierść, rogi, inne (proszę określić)]. Ta niewielka obecność jest niższa od decyzyjnej wartości granicznej ustalonej dla tej metody mikroskopowej.”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto nie więcej niż 5 cząstek pochodzących z ryb. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [ości, rybie łuski, chrząstki, mięśnie, otolit, skrzela, inne (proszę określić)]. Ta niewielka obecność jest niższa od decyzyjnej wartości granicznej ustalonej dla tej metody mikroskopowej.”

W przypadku gdy wykonano dwa oznaczenia:

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń nie więcej niż 10 cząstek pochodzących z kręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [kości, chrząstki, mięśnie, sierść, rogi, inne (proszę określić)]. Ta niewielka obecność jest niższa od decyzyjnej wartości granicznej ustalonej dla tej metody mikroskopowej.”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń nie więcej niż 10 cząstek pochodzących z ryb. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [ości, rybie łuski, chrząstki, mięśnie, otolit, skrzela, inne (proszę określić)]. Ta niewielka obecność jest niższa od decyzyjnej wartości granicznej ustalonej dla tej metody mikroskopowej.”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń nie więcej niż 10 cząstek pochodzących z bezkręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [fragmenty kutykuli, narządy gębowe, mięśnie, elementy układu tchawkowego, inne (proszę określić)]. Ta niewielka obecność jest niższa od decyzyjnej wartości granicznej ustalonej dla tej metody mikroskopowej.”

Ponadto:

— W przypadku wstępnego przesiewu próbki w sprawozdaniu laboratoryjnym należy określić, w jakiej frakcji (sitowej, granulowanej czy ziarnistej) wykryto cząstki zwierzęce, ponieważ wykrycie cząstek zwierzęcych tylko we frakcji sitowej może wynikać z zanieczyszczenia środowiskowego.

— W przypadku wykrycia jedynie cząstek zwierzęcych, których nie można sklasyfikować ani jako kręgowce lądowe, ani jako ryby (np. włókna mięśniowe), w sprawozdaniu należy wskazać, że wykryto jedynie takie cząstki zwierzęce i że nie można wykluczyć, iż pochodzą one z kręgowców lądowych.

2.1.5.3. Wykryto więcej niż 5 cząstek zwierzęcych danego rodzaju po wykonaniu tylko jednego oznaczenia lub wykryto więcej niż 10 cząstek danego rodzaju w przypadku dwóch oznaczeń:

W przypadku gdy wykonano tylko jedno oznaczenie:

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto więcej niż 5 cząstek pochodzących z kręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [kości, chrząstki, mięśnie, sierść, rogi, inne (proszę określić)].”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto więcej niż 5 cząstek pochodzących z ryb. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [ości, rybie łuski, chrząstki, mięśnie, otolit, skrzela, inne (proszę określić)].”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto więcej niż 5 cząstek pochodzących z bezkręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [fragmenty kutykuli, narządy gębowe, mięśnie, elementy układu tchawkowego, inne (proszę określić)].”

W przypadku gdy wykonano dwa oznaczenia:

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń więcej niż 10 cząstek pochodzących z kręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [kości, chrząstki, mięśnie, sierść, rogi, inne (proszę określić)].”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń więcej niż 10 cząstek pochodzących z ryb. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [ości, rybie łuski, chrząstki, mięśnie, otolit, skrzela, inne (proszę określić)].”

— „Używając mikroskopu świetlnego, w badanej próbce wykryto podczas dwóch oznaczeń więcej niż 10 cząstek pochodzących z bezkręgowców lądowych. Cząstki zostały zidentyfikowane jako … [fragmenty kutykuli, narządy gębowe, mięśnie, elementy układu tchawkowego, inne (proszę określić)].”

Ponadto:

— W przypadku wstępnego przesiewu próbki w sprawozdaniu laboratoryjnym należy określić, w jakiej frakcji (sitowej, granulowanej czy ziarnistej) wykryto cząstki zwierzęce, ponieważ wykrycie cząstek zwierzęcych tylko we frakcji sitowej może wynikać z zanieczyszczenia środowiskowego.

— W przypadku wykrycia jedynie cząstek zwierzęcych, których nie można sklasyfikować ani jako kręgowce lądowe, ani jako ryby (np. włókna mięśniowe), w sprawozdaniu należy wskazać, że wykryto jedynie takie cząstki zwierzęce i że nie można wykluczyć, iż pochodzą one od kręgowców lądowych.

2.2.

PCR

2.2.1.

Zasada

Fragmenty kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) pochodzenia zwierzęcego, które mogą się znajdować w materiałach paszowych i mieszankach paszowych, wykrywa się techniką amplifikacji genów stosując metodę PCR skierowaną na sekwencje DNA charakterystyczne dla określonych gatunków.

Metoda PCR wymaga w pierwszej kolejności etapu ekstrakcji DNA. Otrzymany w ten sposób ekstrakt DNA poddaje się później amplifikacji w celu wykrycia gatunków zwierząt uwzględnianych w badaniu.

2.2.2.

Odczynniki i sprzęt

2.2.2.1. Odczynniki

2.2.2.1.1. Odczynniki stosowane na etapie ekstrakcji DNA

Można stosować wyłącznie odczynniki zatwierdzone przez EURL-AP i wymienione na jego stronie internetowej.

2.2.2.1.2. Odczynniki stosowane na etapie amplifikacji genów

2.2.2.1.2.1. Startery i sondy

Można stosować wyłącznie startery i sondy z sekwencjami oligonukleotydów zatwierdzone przez EURL-AP (

48

).

2.2.2.1.2.2. Master Mix

Można stosować wyłącznie roztwory Master Mix niezawierające odczynników, które mogłyby prowadzić do fałszywych wyników z uwagi na obecność DNA zwierzęcego (

49

).

2.2.2.1.2.3. Odczynniki odkażające

2.2.2.1.2.3.1. Roztwór kwasu chlorowodorowego (0,1 N).

2.2.2.1.2.3.2. Środek bielący (roztwór podchlorynu sodowego zawierający 0,15 % aktywnego chloru)

2.2.2.1.2.3.3. Odczynniki niewykazujące działania żrącego do odkażania kosztownych urządzeń, takich jak wagi analityczne (np. DNA EraseTM produkowany przez MP Biomedicals)

2.2.2.2. Sprzęt

2.2.2.2.1. Waga analityczna ważąca z dokładnością do 0,001 g

2.2.2.2.2. Sprzęt do rozdrabniania

2.2.2.2.3. Termocykler do przeprowadzania PCR w czasie rzeczywistym,

2.2.2.2.4. Mikrowirówka do mikroprobówek

2.2.2.2.5. Zestaw mikropipet umożliwiających odmierzanie od 1 μl do 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Standardowe wyroby z tworzywa sztucznego stosowane w laboratorium biologii molekularnej: mikroprobówki, końcówki z tworzywa sztucznego do mikropipet, z filtrem, płytki nadające się do termocyklera.

2.2.2.2.7.

Zamrażarki do przechowywania próbek i odczynników

2.2.3.

Pobieranie i przygotowywanie próbek

2.2.3.1. Pobieranie próbek

Należy użyć reprezentatywnej próbki, pobranej zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I.

2.2.3.2. Przygotowanie próbek

Przygotowanie próbek laboratoryjnych do ekstrakcji DNA musi być zgodne z wymaganiami określonymi w załączniku II. Z co najmniej 50 g próbki należy utworzyć podpróbkę do analizy, a następnie rozdrobnić.

Próbki przygotowuje się w pomieszczeniu innym niż przeznaczone do ekstrakcji DNA i reakcji amplifikacji genów zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

Należy przygotować dwie naważki o wadze co najmniej 100 mg każda.

2.2.4.

Ekstrakcja DNA

Ekstrakcję DNA przeprowadza się dla każdej naważki zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej.

Dla każdej serii ekstrakcji należy przygotować dwa kontrolne roztwory ekstrakcyjne zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

— ślepy roztwór ekstrakcyjny,

— dodatni kontrolny roztwór ekstrakcyjny DNA.

2.2.5.

Amplifikacja genów

Amplifikację genów przeprowadza się przy użyciu metod zatwierdzonych dla każdego gatunku wymagającego identyfikacji. Metody te określono w standardowej procedurze operacyjnej ustalonej przez EURL-AP i opublikowanej na jego stronie internetowej. Każdy ekstrakt DNA powinien być analizowany w dwóch różnych rozcieńczeniach w celu oceny inhibicji.

Dwa kontrolne roztwory amplifikacji przygotowuje się dla każdego gatunku docelowego, zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

— dodatni kontrolny roztwór docelowego DNA stosuje się dla każdej płytki lub serii badań PCR,

— kontrolny roztwór odczynnika do amplifikacji (tzw. kontrola negatywna reakcji) stosuje się dla każdej płytki lub serii badań PCR.

2.2.6.

Interpretacja i przedstawianie wyników

Przekazując wyniki laboratorium musi podać co najmniej wagę użytych naważek, zastosowaną metodę ekstrakcji, liczbę wykonanych oznaczeń oraz granicę wykrywalności metody.

Wyniki nie mogą być interpretowane i przekazywane jeżeli dodatni kontrolny roztwór ekstrakcyjny DNA i dodatnie kontrolne roztwory docelowego DNA nie dają dodatnich wyników w odniesieniu do badanego celu, podczas gdy kontrolny roztwór odczynnika do amplifikacji jest ujemny.

W przypadku gdy wyniki otrzymane z dwóch naważek nie są zgodne, należy powtórzyć co najmniej etap amplifikacji genów. Jeżeli laboratorium podejrzewa, że powodem niezgodności mogą być ekstrakty DNA, przeprowadza się ponowną ekstrakcję DNA, a przed interpretacją wyników należy przeprowadzić amplifikację genów.

Ostateczne wyrażenie wyników należy oprzeć na integracji i interpretacji wyników otrzymanych z dwóch naważek zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej.

2.2.6.1. Wynik ujemny

Wynik ujemny przekazuje się w następujący sposób:

W badanej próbce nie wykryto DNA X (gdzie X oznacza gatunek zwierząt lub grupę gatunków zwierząt, które stanowią przedmiot analizy).

2.2.6.2. Wynik dodatni

Wynik dodatni przekazuje się w następujący sposób:

W badanej próbce wykryto DNA X (gdzie X oznacza gatunek zwierząt lub grupę gatunków zwierząt, które stanowią przedmiot analizy).