Załącznik VI

C.26.

BADANIE INHIBICJI WZROSTU GATUNKU LEMNA

1. METODA

Niniejsza metoda odpowiada TG 221 OECD (2006) (1). Wśród organów UE panuje powszechna zgoda co do tego, że badanie Lemna jest odpowiednią alternatywą dla badania na glonach w przypadku mocno zabarwionych substancji (2) (3).

1.1. WSTĘP

Niniejsza metoda badawcza służy do oceny toksyczności substancji w stosunku do roślin słodkowodnych gatunku Lemna (rzęsy wodnej). Jest ona oparta o istniejące wytyczne (4)(5)(6)(7)(8)(9), lecz zawiera modyfikacje tychże metod, uwzględniające najnowsze badania i konsultacje w sprawie szeregu podstawowych kwestii. Proponowana metoda została potwierdzona za pomocą międzynarodowej próby pierścieniowej (10).

Niniejsza metoda badawcza opisuje gatunki Lemna

gibba i Lemna minor, z których obydwa zostały szeroko zbadane i są przedmiotem przywołanych wyżej norm. Taksonomia gatunków Lemna jest trudna, gdyż komplikuje ją istnienie wielu różnych fenotypów. Choć w przypadku Lemna może występować genetyczna zmienność pod względem reakcji na czynniki toksyczne, to obecnie istnieje niewystarczająca ilość danych na temat tego źródła zmienności, tak aby zalecić określony klon do użycia z niniejszą metodą badawczą. Należy zwrócić uwagę, że badanie nie jest przeprowadzane aksenicznie, lecz na poszczególnych etapach w trakcie procedury badawczej podejmowane są kroki, aby ograniczyć zanieczyszczenie innymi organizmami do minimum.

Opisano szczegóły badania z odnawianiem (badanie półstatyczne i przepływowe) i bez odnawiania (badanie statyczne) roztworu testowego. W zależności od celów badania oraz od wymagań regulacyjnych zaleca się, aby rozważyć zastosowanie metody półstatycznej i przepływowej, np. dla substancji, które są szybko tracone z roztworu na skutek ulatniania się, fotodegradacji, wytrącania się lub biodegradacji. Dalsze wskazówki podano w (11).

1.2. DEFINICJE

Do celów niniejszej metody badawczej użyto następujących definicji i skrótów:

Biomasa: jest to ciężar suchej masy substancji żywej obecnej w populacji. W niniejszym badaniu zwykle mierzy się surogaty biomasy, takie jak liczba lub powierzchnia liści, a przez to użycie określenia „biomasa” odnosi się również do tych surogatowych miar.

Chloroza: jest to żółknienie tkanki liści.

Klon: jest to organizm lub komórka powstała z pojedynczego osobnika przez rozmnażanie bezpłciowe. Osobniki z tego samego klonu są zatem genetycznie identyczne.

Kolonia: oznacza skupisko macierzystych lub pochodnych liści (zwykle 2 do 4) przyczepionych do siebie nawzajem. Niekiedy określana jest mianem rośliny.

ECx

: jest to stężenie substancji testowej rozpuszczonej w pożywce, które powoduje redukcję wzrostu Lemna o x % (np. 50 %) w danym okresie ekspozycji (który należy wyraźnie podać, jeśli odbiega od pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby jednoznacznie oznaczyć wartość EC wynikającą z szybkości wzrostu lub uzysku, do szybkości wzrostu używa się symbolu „ErC” a do uzysku symbolu „EyC”, po którym następuje użyta zmienna pomiarowa, np. ErC (liczba liści).

Badanie przepływowe: jest to badanie, w którym roztwory testowe są wymieniane w sposób ciągły.

Liść: jest to indywidualna/pojedyncza „liściopodobna” struktura rośliny rzęsy wodnej. Jest to najmniejsza jednostka, tj. osobnik, zdolna do rozmnażania się.

Garbatość: oznacza liście o zgarbionym lub spuchniętym wyglądzie.

Wzrost: jest to przyrost zmiennej pomiarowej, jak np. liczba liści, ciężar masy suchej, ciężar masy wilgotnej lub powierzchnia liści, w ciągu okresu badania.

Szybkość wzrostu (średnia właściwa szybkość wzrostu): jest to logarytmiczny przyrost biomasy w ciągu okresu ekspozycji.

Najmniejszy obserwowany poziom stężenia (LOEC): jest to najniższe stężenie testowe, przy którym obserwuje się, że substancja ma statystycznie istotny redukujący wpływ na wzrost (przy p < 0,05) w porównaniu do próby kontrolnej, w danym czasie ekspozycji. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą mieć szkodliwy skutek równy lub większy niż te, które są obserwowane przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, to należy podać pełne wyjaśnienie, w jaki sposób LOEC (a stąd NOEC) zostało wybrane.

Zmienne pomiarowe: są to dowolnego typu zmienne, które mierzy się, aby wyrazić punkt końcowy badania przy użyciu jednej lub więcej różnych zmiennych odpowiedzi. W niniejszej metodzie zmiennymi pomiarowymi są: liczba liści, powierzchnia liści, ciężar masy świeżej i ciężar masy suchej.

Monokultura: jest to kultura z jednym gatunkiem rośliny.

Martwica: jest to umarła (tj. biała lub nasiąknięta wodą) tkanka listna.

Nieobserwowany wpływ stężenia (NOEC): jest to stężenie testowe bezpośrednio poniżej LOEC.

Fenotyp: są to obserwowalne cechy organizmu zdeterminowane przez współoddziaływanie jego genów z jego środowiskiem.

Zmienne odpowiedzi: są to zmienne służące do oszacowywania toksyczności, uzyskane na podstawie zmierzonych zmiennych opisujących biomasę za pomocą różnych metod obliczania. W przypadku niniejszej metody zmiennymi odpowiedzi są: szybkości wzrostu i uzysk, które otrzymuje się ze zmiennych pomiarowych, takich jak liczba liści, powierzchnia liści, ciężar masy świeżej lub ciężar masy suchej.

Badanie półstatyczne (z odnawianiem): jest to badanie, w którym roztwór testowy jest okresowo wymieniany w określonych odstępach czasu w trakcie badania.

Badanie statyczne: jest to metoda badania bez odnawiania roztworu testowego w trakcie badania.

Punkt końcowy badania: opisuje ogólny czynnik, który będzie ulegał zmianie pod wpływem testowej substancji chemicznej w stosunku do próby kontrolnej, jako cel badania. W niniejszej metodzie punktem końcowym badania jest inhibicja wzrostu, którą można wyrazić za pomocą różnych zmiennych odpowiedzi opartych o jedną lub więcej zmiennych pomiarowych.

Pożywka: jest to kompletne syntetyczne podłoże hodowlane, na którym rośliny wzrastają, gdy są wyeksponowane na działanie substancji testowej. Substancja testowa zwykle jest rozpuszczona w pożywce.

Uzysk: jest to wartość zmiennej pomiarowej wyrażająca biomasę na końcu okresu ekspozycji minus wartość zmiennej pomiarowej na początku okresu ekspozycji.

1.3. ZASADA BADANIA

Wzrastającym wykładniczo kulturom roślinnym rodzaju Lemna umożliwia się wzrastać w postaci monokultur przy różnych stężeniach substancji testowej w ciągu okresu siedmiu dni. Celem badania jest ilościowe określenie związanych z substancją oddziaływań na wegetatywny wzrost w ciągu tego okresu, na podstawie ocen wybranych zmiennych pomiarowych. Główną zmienną pomiarową jest liczba liści. Mierzy się również co najmniej jedną inną zmienną pomiarową (całkowitą powierzchnię liści, ciężar masy suchej lub świeżej), gdyż niektóre substancje mogą wpływać o wiele bardziej na inne zmienne pomiarowe niż ilość liści. Aby określić ilościowo skutki związane z substancją, wzrost w roztworach testowych porównuje się do wzrostu w próbach kontrolnych i wyznacza się stężenie powodujące inhibicję wzrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako ECx (np. EC50).

Punktem końcowym badania jest inhibicja wzrostu wyrażona jako logarytmiczny przyrost zmiennej pomiarowej (średnia właściwa szybkość wzrostu) w ciągu okresu ekspozycji. Na podstawie średnich właściwych szybkości wzrostu zarejestrowanych w serii roztworów testowych wyznacza się stężenie powodujące inhibicję szybkości wzrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako ErCx (np. ErC50).

Dodatkową zmienną odpowiedzi użytą w niniejszej metodzie badawczej jest uzysk, który może być potrzebny do spełnienia określonych wymagań regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on zdefiniowany jako zmienne pomiarowe na końcu okresu ekspozycji minus zmienne pomiarowe na początku okresu ekspozycji. Na podstawie uzysku zarejestrowanego w serii roztworów testowych oblicza się stężenie powodujące inhibicję uzysku o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako EyCx (np. EyC50).

Ponadto można statystycznie określić najniższe stężenie zaobserwowanego skutku (LOEC) oraz stężenie braku obserwowanego skutku (NOEC).

1.4. INFORMACJE O SUBSTANCJI TESTOWEJ

Należy dysponować metodą analityczną o należytej czułości do ilościowego oznaczenia substancji w pożywce.

Informacje o substancji testowej, które mogą być przydatne w ustaleniu warunków badania obejmują wzór strukturalny, czystość, rozpuszczalność w wodzie, trwałość w wodzie i świetle, pKa, Kow, ciśnienie pary oraz podatność na biodegradację. Rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary mogą posłużyć do obliczenia stałej prawa Henry’ego, która wskaże, czy możliwe są znaczące straty substancji testowej w ciągu okresu badania. Pomoże to stwierdzić, czy powinny zostać podjęte szczególne kroki w celu ograniczenia takich strat. Gdy dane o rozpuszczalności i trwałości substancji testowej są niepewne, zaleca się, aby ocenić je w warunkach badania, przy uwzględnieniu pożywki wzrostowej, temperatury i warunków oświetlenia, które mają być zastosowane w badaniu.

Gdy szczególnie ważna jest kontrola pH pożywki, np. gdy bada się metale lub substancje, które są hydrolitycznie nietrwałe, zaleca się dodanie bufora do pożywki wzrostowej (zob. akapit pierwszy w sekcji 1.7.4). Dalsze wskazówki dotyczące badania substancji o własnościach fizykochemicznych, które utrudniają ich badanie, podano w (11).

1.5. SUBSTANCJA ODNIESIENIA

Jako sposób sprawdzenia procedury badawczej można zbadać substancję(-e) odniesienia, taką jak 3,5-dwuchlorofenol używany w międzynarodowej próbie pierścieniowej (10). Wskazane jest testowanie substancji odniesienia co najmniej dwa razy do roku lub gdy badanie jest wykonywane z mniejszą częstotliwością, równolegle z określaniem toksyczności substancji testowej.

1.6. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne, czas podwojenia liczby liści w próbie kontrolnej musi być mniejszy niż 2,5 dnia (60 godz.), co odpowiada w przybliżeniu siedmiokrotnemu wzrostowi w ciągu siedmiu dni oraz średniej właściwej szybkości wzrostu wynoszącej 0,275 d–1. Gdy używa się pożywki i badanie przeprowadzane jest w warunkach opisanych w niniejszej metodzie badawczej, kryterium to można spełnić stosując warunki badania statycznego (8). Przewiduje się również, że kryterium to będzie możliwe do spełnienia w warunkach badania półstatycznego i przepływowego. Obliczenie czasu podwojenia przedstawiono w sekcji 2.1.

1.7. OPIS METODY

1.7.1. Przyrząd

Cały sprzęt mający kontakt z pożywkami musi być wykonany ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Naczynia szklane używane do celów hodowli kultur i badania powinny być wolne od zanieczyszczeń chemicznych, które mogłyby zostać wypłukane do pożywki oraz powinny być sterylne. Naczynia badawcze powinny mieć dostateczną szerokość, tak aby liście różnych kolonii w naczyniach kontrolnych urosły bez zachodzenia na siebie na koniec badania. Nie ma znaczenia, czy korzenie dotykają dna naczyń badawczych, lecz zaleca się minimalną głębokość 20 mm i minimalną objętość 100 ml w każdym naczyniu badawczym. Wybór naczyń badawczych nie ma szczególnie ważnego znaczenia, o ile spełnione są te wymagania. Odpowiednie okazały się szklane zlewki, naczyńka krystalizacyjne lub szalki Petriego o odpowiednich wymiarach. Naczynia badawcze muszą być przykryte, tak aby ograniczyć do minimum parowanie i przypadkowe zanieczyszczenie, przy jednoczesnym umożliwieniu niezbędnej wymiany powietrza. Odpowiednie naczynia badawcze, a w szczególności pokrywy, nie powinny dopuszczać do zacienienia lub zmian charakterystyki widmowej światła.

Kultury i naczynia badawcze nie powinny być trzymane razem. Najlepiej można to zapewnić, używając oddzielnych klimatycznych komór wzrostowych, inkubatorów lub pomieszczeń. Oświetlenie i temperatura muszą być regulowane i utrzymywane na stałym poziomie (zob. sekcja 1.7.8).

1.7.2. Badany organizm

Organizmem użytym do niniejszego badania jest Lemna gibba lub Lemna minor. Krótkie opisy gatunków rzęsy wodnej, których użyto do badania toksyczności, zamieszczono w dodatku 1. Materiał roślinny można uzyskać z kolekcji kultur, z innego laboratorium lub z terenu. Jeżeli rośliny są zebrane z terenu, to przed użyciem należy je trzymać przez co najmniej osiem tygodni w kulturze w tej samej pożywce, co użyta do badania. Miejsca w terenie wykorzystane do zebrania początkowych kultur muszą być wolne od wyraźnych źródeł zanieczyszczenia. Jeżeli uzyskane są one z innego laboratorium lub z kolekcji kultur, to powinny być trzymane w podobny sposób przez co najmniej trzy tygodnie. W sprawozdaniu należy zawsze podać źródło materiału roślinnego oraz gatunek i klon (jeśli jest znany) użyty do badania.

Należy użyć monokultur, które są w sposób widoczny wolne od zanieczyszczenia innymi organizmami, takimi jak glony i pierwotniaki. Zdrowe rośliny L. minor składać się będą z kolonii zawierających od dwóch do pięciu liści, podczas gdy zdrowe kolonie L. gibba mogą zawierać do siedmiu liści.

Jakość i jednorodność roślin użytych do badania będzie mieć znaczący wpływ na jego wynik i dlatego powinny one być wybierane ze starannością. Należy używać młodych, szybko rosnących roślin bez widocznych zmian chorobowych lub odbarwienia (chlorozy). O dobrej jakości kultur świadczy duża częstość występowania kolonii zawierających co najmniej dwa liście. Duża liczba pojedynczych liści oznacza stres środowiskowy, np. ograniczenie składników odżywczych i materiału roślinnego z takich kultur nie należy używać do badania.

1.7.3. Hodowla

Aby zmniejszyć częstotliwość utrzymania kultur (np. gdy przez pewien okres nie planuje się badań nad Lemna), kultury można utrzymywać w warunkach zmniejszonego oświetlenia i obniżonej temperatury (4–10 °C). Szczegóły dotyczące hodowli kultury podano w dodatku 2. Wyraźne oznaki zanieczyszczenia glonami lub innymi organizmami wymagać będą powierzchniowej sterylizacji podpróbki liści Lemna, a następnie przeniesienia jej do świeżej pożywki (zob. dodatek 2). W takim przypadku pozostałą zanieczyszczoną kulturę należy odrzucić.

Co najmniej siedem dni przed badaniem, dostateczną ilość kolonii przenosi się aseptycznie do świeżej sterylnej pożywki i przez 7–10 dni hoduje się kulturę w warunkach badania.

1.7.4. Pożywka

Dla Lemna minor i Lemna gibba zalecane są różne pożywki, jak opisano poniżej. Należy dokładnie rozważyć włączenie bufora pH do pożywki (MOPS (kwasu 4-morfolinopropanosulfonowego, nr CAS 1132–61–2; nr EINECS 214–478–5) w pożywce L. minor oraz NaHCO3 w pożywce L. gibba), gdy podejrzewa się, że mógłby on reagować z substancją testową i wpłynąć na wyrażenie jej toksyczności. Dopuszczalna jest również pożywka Steinberga (12), o ile spełnione są kryteria ważności.

Do hodowli kultur i badania L. minor zalecana jest modyfikacja pożywki wzrostowej Lemna według normy szwedzkiej (SIS). Skład tej pożywki podano w dodatku 3.

Do hodowli kultur i badania L. gibba zaleca się pożywkę wzrostową 20X AAP, opisaną w dodatku 3.

Pożywka Steinberga, opisana w dodatku 3, jest również odpowiednia dla L. minor, lecz może być także użyta do L. gibka, o ile spełnione są kryteria ważności.

1.7.5. Roztwory testowe

Roztwory testowe sporządza się zazwyczaj przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Roztwory podstawowe substancji testowej sporządza się zwykle przez rozpuszczenie substancji w pożywce wzrostowej.

Najwyższe badane stężenie substancji zwykle nie powinno przekraczać rozpuszczalności tej substancji w wodzie w warunkach badania. Należy jednak zauważyć, że gatunki Lemna unoszą się na powierzchni i mogą być wyeksponowane na substancje, które gromadzą się na granicy faz woda-powietrze (jak np. substancje słabo rozpuszczalne w wodzie lub hydrofobowe bądź substancje powierzchniowo czynne). W takiej sytuacji ekspozycja będzie wynikać z substancji innej niż będąca w roztworze i stężenia próbne mogą, w zależności od charakterystyki substancji testowej, przekroczyć rozpuszczalność w wodzie. W przypadku substancji o niskiej rozpuszczalności w wodzie może być konieczne sporządzenie stężonego roztworu podstawowego lub dyspersji substancji przy użyciu rozpuszczalnika organicznego lub dyspergatora. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich substancji. Użycie pomocniczych rozpuszczalników lub dyspergatorów nie powinno powodować fitotoksyczności. Na przykład, do powszechnie używanych rozpuszczalników, które nie powodują fitotoksyczności w stężeniach do 100 μl·l–1 należy aceton i dwumetyloformamid. Jeżeli użyty jest rozpuszczalnik lub dyspergator, to w sprawozdaniu należy podać jego końcowe stężenie, które powinno być utrzymane na minimalnym poziomie (≤ 100 μl·l–1) i we wszelkich zabiegach i próbach kontrolnych powinno być zachowane takie samo stężenie rozpuszczalnika i dyspergatora. Dalsze wskazówki na temat użycia dyspergatorów podano w (11).

1.7.6. Grupy badane i kontrolne

W doborze odpowiednich stężeń testowych pomocna będzie uprzednia znajomość toksyczności substancji testowej w stosunku do Lemna, np. z próby wyznaczania zakresu. W ostatecznym badaniu toksyczności powinno zwykle być co najmniej pięć stężeń testowych uporządkowanych w postaci szeregu geometrycznego. Współczynnik rozdziału pomiędzy stężeniami testowymi w miarę możliwości nie powinien przekraczać 3,2, lecz może być zastosowana większa wartość, gdy krzywa stężenie-odpowiedź jest płaska. Jeżeli użyto poniżej pięciu stężeń, należy podać uzasadnienie. Przy każdym stężeniu testowym należy użyć co najmniej trzy replikaty.

Przy ustalaniu zakresu stężeń (w przypadku próby wyznaczania zakresu i/lub ostatecznego badania toksyczności), należy wziąć pod uwagę, co następuje:

— Aby określić ECx, stężenia testowe powinny zawierać w swoim zakresie wartość ECx w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu ufności. Na przykład, jeżeli oszacowuje się EC50, to najwyższe stężenie nie powinno być większe od wartości EC50. Jeżeli wartość EC50 leży poza zakresem stężeń testowych, to związane z tym poziomy ufności będą większe i odpowiednia ocena statystycznego dopasowania modelu może nie być możliwa.

— Jeżeli celem jest oszacowanie LOEC/NOEC, to najniższe stężenie testowe powinno być dostatecznie niskie, aby wzrost nie był znacząco mniejszy niż wzrost grupy kontrolnej. Ponadto najwyższe stężenie testowe powinno być dostatecznie wysokie, aby wzrost był znacząco mniejszy niż w grupie kontrolnej. Jeśli nie jest to spełnione, to badanie będzie musiało zostać powtórzone przy zastosowaniu innego zakresu stężeń (chyba, że najwyższe stężenie równe jest granicznej rozpuszczalności lub maksymalnemu wymaganemu stężeniu granicznemu, np. 100 mg·l–1).

Każde badanie powinno obejmować próby kontrolne obejmujące tę samą pożywkę, liczbę liści i kolonii, warunki środowiskowe i procedury, w postaci naczyń badawczych, lecz bez substancji testowej. Jeżeli użyty jest pomocniczy rozpuszczalnik lub dyspergator, należy objąć dodatkową próbę kontrolną z użyciem rozpuszczalnika/dyspergatora o tym samym stężeniu, co w naczyniach z substancją testową. Liczba replikatowych naczyń kontrolnych (oraz, w stosownym wypadku, naczyń z rozpuszczalnikiem) powinna być co najmniej równa, a najlepiej dwukrotnie większa od liczby naczyń użytych do każdego stężenia testowego.

Jeżeli nie jest wymagane wyznaczenie NOEC, to plan badania można zmienić, zwiększając liczbę stężeń i zmniejszając liczbę replikatów przypadających na stężenie. Jednakże liczba replikatów kontrolnych musi wynosić co najmniej trzy.

1.7.7. Ekspozycja

Kolonie składające się z 2–4 widocznych liści przenosi się z kultury inokulum i losowo przydziela do naczyń badawczych w warunkach aseptycznych. Każde naczynie badawcze powinno zawierać łącznie 9–12 liści. Liczba liści i kolonii powinna być taka sama w każdym naczyniu. Doświadczenie uzyskane z niniejszej metody oraz z danych z próby pierścieniowej wykazało, że użycie trzech replikatów na próbę, z każdym replikatem zawierającym początkowo 9–12 liści, jest wystarczające do wykrycia różnic we wzroście wynoszących w przybliżeniu 4–7 % inhibicji obliczonego na podstawie szybkości wzrostu (10–15 % obliczonego na podstawie uzysku) pomiędzy próbami (10).

Wymagany jest zrandomizowany plan umieszczania naczyń badawczych w inkubatorze, aby ograniczyć do minimum wpływ przestrzennych różnic natężenia światła i temperatury. Wymagany jest również zblokowany plan lub losowe przestawianie naczyń podczas dokonywania obserwacji (lub częstsze przestawianie).

Jeżeli wstępna próba stabilności wykazuje, że nie można utrzymać stężenia substancji testowej (tj. mierzone stężenie spada poniżej 80 % zmierzonego początkowego stężenia) w czasie trwania badania (7 dni), zalecane są warunki badania półstatycznego. W takim przypadku kolonie należy wyeksponować na świeżo sporządzone roztwory testowe i kontrolne co najmniej dwukrotnie w ciągu badania (np. w dniach 3 i 5). Częstotliwość ekspozycji na świeżą pożywkę zależeć będzie od stabilności substancji testowej; do utrzymania prawie stałych stężeń wysoce niestabilnych lub lotnych substancji może być wymagana większą częstotliwość. W niektórych sytuacjach może być wymagana procedura przepływowa (11)(13).

Scenariusz ekspozycji poprzez nałożenie na liście (natrysk) nie jest objęty niniejszą metodą badawczą; można natomiast znaleźć go w (14).

1.7.8. Warunki inkubacji

Należy zastosować ciągłe oświetlenie w postaci ciepłego lub chłodnego światła fluorescencyjnego o natężeniu wybranym z zakresu 85–135 μE·m–2·s–1, zmierzonym w promieniowaniu aktywnym dla fotosyntezy (400–700 nm) w punktach o takiej samej odległości od źródła światła, co liście Lemna (równoważnym 6 500–10 000 luksów). Wszelkie różnice w stosunku do wybranego natężenia światła na badanej powierzchni nie powinny przekraczać ± 15 %. Na mierzoną wartość będzie mieć wpływ metoda detekcji i pomiaru światła, w szczególności typ czujnika. Przedkładane są czujniki sferyczne (które reagują na światło ze wszystkich kątów powyżej i poniżej płaszczyzny pomiaru) oraz czujniki „kosinusowe” (które reagują na światło ze wszystkich kątów powyżej płaszczyzny pomiaru) nad czujniki jednokierunkowe i będą one dawać wyższe wskazania dla opisywanego tu typu wielopunktowego źródła światła.

Temperatura w naczyniach badawczych powinna wynosić 24 ± 2 °C. Wartość pH pożywki kontrolnej nie powinna wzrosnąć w ciągu badania o więcej niż 1,5 jednostki. Jednakże odchylenie o więcej ni 1,5 jednostki nie spowoduje unieważnienia badania, jeśli można wykazać, że spełnione są kryteria ważności. Dodatkowej uwagi wymaga dryft pH w szczególnych przypadkach, takich jak podczas badania nietrwałych substancji lub metali. Dalsze wskazówki przedstawiono w (11).

1.7.9. Czas trwania

Badanie zostaje zakończone po 7 dniach od przeniesienia roślin do naczyń badawczych.

1.7.10. Pomiary i oznaczenia analityczne

Na początku badania liczy się i rejestruje liczbę liści w naczyniach badawczych, zwracając uwagę na uwzględnienie wystających, wyraźnie widocznych liści. Liczbę liści wydających się wyglądać normalne lub nienormalne należy określić na początku badania, co najmniej raz na 3 dni w ciągu okresu ekspozycji (tj. co najmniej 2 razy podczas 7-dniowego okresu) oraz na zakończenie badania. Należy odnotować zmiany w rozwoju roślin, np. pod względem wielkości liści, wyglądu, oznak martwicy, chlorozy lub garbatości, rozbicia kolonii lub utraty zdolności utrzymywania się na powierzchni wody oraz długości i wyglądu korzeni. Należy również odnotować istotne cechy pożywki (np. obecność nierozpuszczonej substancji, wzrost glonów w naczyniu badawczym).

Oprócz określenia liczby liści w ciągu badania ocenia się również wpływy substancji testowej na jedną (lub więcej) następujących zmiennych pomiarowych:

(i) całkowitą powierzchnię liści;

(ii) ciężar masy suchej;

(iii) ciężar masy świeżej.

Całkowita powierzchnia liści ma tę zaletę, że może być określona dla każdego naczynia badawczego i kontrolnego na początku, podczas i na koniec badania. Ciężar masy suchej lub świeżej należy wyznaczyć na początku badania na podstawie próbki kultury inokulum reprezentatywnej dla tego, co jest użyte do rozpoczęcia badania, oraz na końcu badania przy użyciu materiału roślinnego z każdego naczynia badawczego i kontrolnego. Jeśli nie mierzy się powierzchni liści, to przedkłada się ciężar masy suchej nad ciężar masy świeżej.

Całkowitą powierzchnię liści oraz ciężar masy suchej i ciężar masy świeżej można wyznaczyć następująco:

(i) Całkowita powierzchnia liści: całkowitą powierzchnię liści wszystkich kolonii można określić za pomocą analizy obrazu. Sylwetkę naczynia badawczego i liści można uchwycić za pomocą kamery wideo (np. ustawiając naczynie na kopioramie), a otrzymany w wyniku obraz poddać digitalizacji. Poprzez kalibrację za pomocą płaskich kształtów o znanej powierzchni można następnie wyznaczyć całkowitą powierzchnię liści w naczyniu badawczym. Należy pamiętać, aby wykluczyć zakłócenie spowodowane przez obrzeże naczynia badawczego. Alternatywne, choć bardziej pracochłonne podejście, polega na wykonaniu fotokopii wszystkich naczyń badawczych i roślin, wycięciu otrzymanej sylwetki kolonii i wyznaczeniu ich powierzchni przy użyciu analizatora powierzchni liści lub papieru milimetrowego. Odpowiednie mogą być również inne techniki (np. określenie stosunku ciężaru papieru powierzchni sylwetki kolonii do powierzchni jednostkowej).

(ii) Ciężar masy suchej: z każdego naczynia badawczego zbiera się wszystkie kolonie i przepłukuje się wodą destylowaną lub dejonizowaną. Odsącza się je bibułą w celu usunięcia nadmiaru wody, a następnie suszy w temperaturze 60 °C do stałej masy. Należy dołączyć wszelkie fragmenty korzeni. Ciężar suchej masy należy wyrazić z dokładnością co najmniej do 0,1 mg.

(iii) Ciężar masy świeżej: wszystkie kolonie przenosi się do uprzednio zważonych probówek z polistyrenu (lub innego obojętnego materiału) z małymi (1 mm) otworami w zaokrąglonym dnie. Następnie probówki odwirowuje się z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Probówki zawierające wysuszone kolonie ponownie waży się i oblicza się ciężar masy świeżej przez odjęcie ciężaru pustej probówki.

1.7.10.1. Częstotliwość pomiarów i oznaczeń analitycznych

Jeżeli zastosowany jest statyczny plan badania, to należy zmierzyć pH każdej próby na początku i na końcu badania. Jeżeli zastosowany jest półstatyczny plan badania, to należy zmierzyć pH w każdej partii „świeżego” roztworu testowego przed każdą wymianą oraz w odpowiednich „zużytych” roztworach.

Natężenie światła należy zmierzyć w komorze wzrostu, inkubatorze lub pomieszczeniu w różnych punktach o takiej samej odległości od źródła światła, co liście Lemna. Pomiaru należy dokonać co najmniej raz w ciągu badania. Temperaturę pożywki w naczyniu zastępczym utrzymywanym w takich samych warunkach w komorze wzrostu, inkubatorze lub pomieszczeniu należy rejestrować co najmniej codziennie.

Podczas badania, w odpowiednich ostępach czasu oznacza się stężenia substancji testowej. W badaniach statycznych minimalnym wymogiem jest oznaczenie stężeń na początku i na końcu badania.

W badaniach półstatycznych, gdzie nie jest spodziewane, że stężenie substancji testowej pozostanie w granicach ± 20 % stężenia nominalnego, niezbędne jest zanalizowanie wszystkich świeżo sporządzonych roztworów oraz tych samych roztworów przy każdej wymianie (zob. akapit trzeci w sekcji 1.7.7). Jednakże w przypadku badań, gdzie zmierzone początkowe stężenie substancji testowej nie mieści się w granicach ± 20 % nominalnego, lecz gdzie można dostarczyć dostatecznych dowodów wykazujących, że początkowe stężenia są powtarzalne i stabilne (tj. zawierają się w granicach 80–120 % początkowego stężenia), oznaczenia chemiczne można przeprowadzać tylko na najwyższych i najniższych stężeniach testowych. We wszystkich przypadkach, oznaczenie stężeń substancji testowej przed wymianą musi być wykonane tylko na jednym replikatowym naczyniu przy każdym stężeniu testowym (lub zawartościach naczyń połączonych z sobą według replikatu).

Jeżeli zastosowana jest badanie przepływowe, to odpowiednim systemem jest system pobierania próbek podobny do opisanego dla badań półstatycznych, wraz z analizą na początku, w środku i na końcu badania, lecz pomiar „zużytych” roztworów nie jest odpowiedni w tym przypadku. W tego typu badaniu należy codziennie sprawdzać natężenie przepływu rozcieńczalnika i substancji testowej lub roztworu podstawowego substancji testowej.

Jeżeli istnieją dowody, że stężenie substancji testowej zostało zadowalająco utrzymane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia w ciągu całego badania, to analizę wyników można oprzeć na nominalnych lub zmierzonych początkowych wartościach. Jeżeli odchylenie od nominalnych lub zmierzonych początkowych stężeń jest większe niż ± 20 %, analizę wyników należy oprzeć na średnim geometrycznym stężeniu podczas ekspozycji lub na modelach opisujących spadek stężenia substancji testowej (11).

1.7.11. Badanie graniczne

W pewnych okolicznościach, np. gdy wstępne badanie wskazuje, że substancja testowa nie ma toksycznych oddziaływań przy stężeniach do 100 mg·l–1 lub do jej granicznej rozpuszczalności w pożywce (zależnie od tego, co jest mniejsze), można przeprowadzić badanie graniczne polegające na porównaniu odpowiedzi w grupie kontrolnej i jednej grupie poddawanej zabiegowi (o stężeniu 100 mg·l–1 lub równym rozpuszczalności granicznej). Bardzo zalecane jest, aby było to poparte analizą stężenia ekspozycji. Do badania granicznego stosują się wszystkie poprzednio opisane warunki badania i kryteria ważności, poza tym że liczba replikatów poddawanych zabiegowi powinna być dwukrotnie zwiększona. Wzrost w grupie kontrolnej i poddawanej zabiegowi można zanalizować przy pomocy testu statystycznego do porównywania średnich, np. testu t Studenta.

2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

2.1. CZAS PODWOJENIA

Aby określić czas podwojenia (Td) liczby liści oraz spełnienie przez badanie niniejszego kryterium ważności (sekcja 1.6), używa się poniższego wzoru z danymi uzyskanymi z naczyń kontrolnych:

Td = ln 2/μ

gdzie μ jest średnią właściwą szybkością wzrostu wyznaczoną w sposób opisany w akapicie pierwszym i drugim w sekcji 2.2.1.

2.2. ZMIENNE ODPOWIEDZI

Celem badania jest określenie wpływów substancji testowej na wegetatywny wzrost Lemna. Niniejsza metoda badawcza opisuje dwie zmienne odpowiedzi, gdyż państwa członkowskie mają różne preferencje i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania były akceptowalne we wszystkich państwach członkowskich, skutki powinny być ocenione przy użyciu obydwu zmiennych odpowiedzi a) i b) opisanych poniżej.

a) Średnia właściwa szybkość wzrostu: tę zmienną odpowiedzi oblicza się na podstawie zmian logarytmów liczb liści, a ponadto na podstawie zmian logarytmów innego parametru pomiarowego (całkowitej powierzchni liści oraz ciężaru masy suchej lub ciężaru masy świeżej) w czasie (wyrażonych na dzień) w grupach kontrolnych i w każdej grupie poddawanej zabiegowi. Niekiedy określa się ją mianem względnej szybkości wzrostu (15).

b) Uzysk: tę zmienną odpowiedzi oblicza się na podstawie zmian liczby liści, a ponadto na podstawie zmian innego parametru pomiarowego (całkowitej powierzchni liści oraz ciężaru masy suchej lub ciężaru masy świeżej) w grupach kontrolnych i w każdej grupie poddawanej zabiegowi, aż do końca badania.

Należy zauważyć, że wartości toksyczności obliczone przy użyciu tych dwu zmiennych odpowiedzi nie są porównywalne i różnica ta musi być rozpoznana, gdy używa się wyników badania. Jeżeli spełnione są warunki badania określone w niniejszej metodzie badawczej, to wartości ECx oparte na średniej właściwej szybkości wzrostu (ErCx) bywają zwykle wyższe od wyników opartych na uzysku (EyCx), ze względu na podstawę matematyczną odnośnych podejść. Nie należy interpretować tego jako różnicy czułości pomiędzy tymi dwiema zmiennymi odpowiedzi, lecz jedynie, że wartości te są różne matematycznie. Pojęcie średniej właściwej szybkości wzrostu oparte jest na ogólnym wykładniczym przebiegu wzrostu rzęsy w nieograniczonych kulturach, gdzie toksyczność szacowana jest na podstawie wpływów na szybkość wzrostu, nie będąc zależną od bezwzględnego poziomu właściwej szybkości wzrostu kultury kontrolnej, nachylenia krzywej stężenie–odpowiedź lub czasu trwania badania. Natomiast wyniki oparte na zmiennej odpowiedzi w postaci uzysku są zależne od wszystkich tych pozostałych zmiennych. EyCx jest zależne od właściwej szybkości wzrostu gatunków rzęsy użytych w każdym badaniu oraz od maksymalnej właściwej szybkości wzrostu, która może być różna dla różnych gatunków, a nawet dla różnych szczepów. Tej zmiennej odpowiedzi nie powinno się używać do porównywania czułości na czynniki toksyczne pomiędzy gatunkami rzęsy lub nawet różnymi ich szczepami. Choć z naukowego punktu widzenia do szacowania toksyczności preferowane jest posługiwanie się średnią właściwą szybkością wzrostu, to oszacowania toksyczności na podstawie uzysku są również objęte niniejszą metodą badawczą, aby uczynić zadość obecnym wymogom regulacyjnym istniejącym w niektórych krajach.

Oszacowania toksyczności powinny być oparte na liczbie liści oraz na dodatkowych zmiennych pomiarowych (całkowitą powierzchnię liści, ciężar masy suchej lub ciężar masy świeżej), ponieważ niektóre substancje mogą mieć znacznie większy wpływ na inne zmienne pomiarowe niż na liczbę liści. Skutek ten nie zostałby wykryty jedynie przez obliczenie liczby liści.

Liczba liści, jak również każda inna rejestrowana zmienna pomiarowa, tj. całkowita powierzchnia liści, ciężar masy suchej lub ciężar masy świeżej, jest zapisywana w postaci tabelarycznej wraz ze stężeniami substancji testowej podczas każdego pomiaru. Późniejsza analiza danych, np. w celu oszacowania LOEC, NOEC lub ECx, powinna być oparta na wartościach dla indywidualnych replikatów, a nie na obliczonych średnich dla każdej grupy poddawanej zabiegowi.

2.2.1. Średnia właściwa szybkość wzrostu

Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza się jako logarytmiczny przyrost zmiennych wzrostu — liczb liści oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, ciężaru masy suchej lub ciężaru masy świeżej) — przy użyciu poniższego wzoru, dla każdego replikatu grupy kontrolnej i grup poddawanych zabiegowi:

gdzie:

— μi–j:

średnia właściwa szybkość wzrostu od czasu i do j,

— Ni:

zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontrolnym o czasie i,

— Nj:

zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontrolnym o czasie j,

— t:

okres od czasu i do j.

Dla każdej grupy poddawanej zabiegowi i grupy kontrolnej obliczyć średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji.

Średnią właściwą szybkość wzrostu należy obliczyć dla całego okresu badania (czas „i” w powyższym równaniu jest początkiem badania, a czas „j” jest końcem badania). Dla każdego stężenia testowego i próby kontrolnej obliczyć średnią wartość średniej właściwej szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji. Ponadto należy ocenić szybkość wzrostu według odcinków, aby określić skutki substancji testowej występujące w czasie okresu ekspozycji (np. przez badanie krzywych wzrostu przekształconych na postać logarytmiczną). Znaczące różnice pomiędzy szybkością wzrostu dla poszczególnych odcinków a średnią szybkością wzrostu świadczą o odchyleniu od stałego wykładniczego wzrostu i uzasadniają dokładne zbadanie krzywych wzrostu. W takim przypadku rozważnym podejściem byłoby porównanie właściwych szybkości wzrostu uzyskanych z kultur poddawanych zabiegowi w ciągu okresu maksymalnej inhibicji z właściwymi szybkościami wzrostu dla kultur kontrolnych w ciągu tego samego okresu.

Następnie można obliczyć procentową inhibicję szybkości wzrostu (Ir) dla każdego stężenia testowego (grupy poddawanej zabiegowi), według następującego równania:

gdzie:

— % Ir:

procentowa inhibicja średniej właściwej szybkości wzrostu,

— μC:

średnia wartość μ w grupie kontrolnej,

— μT:

średnia wartość μ w grupie poddawanej zabiegowi.

2.2.2. Uzysk

Wpływy na uzysk określa się na podstawie dwu zmiennych pomiarowych: liczby liści oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, ciężaru masy suchej lub ciężaru masy świeżej) istniejących w każdym naczyniu badawczym na początku i na końcu badania. Dla ciężaru masy suchej lub ciężaru masy świeżej początkową biomasę określa się na podstawie próbki liści pobranej z tej samej partii użytej do zaszczepienia naczyń badawczych (zob. akapit drugi w sekcji 1.7.3). Dla każdego stężenia testowego i grupy kontrolnej obliczyć średnią wartość uzysku wraz z oszacowaniami wariancji. Średnie procentowe inhibicji uzysku (% Iy) można obliczyć dla każdej poddawanej zabiegowi grupy w następujący sposób:

gdzie:

— % Iy:

procentowe zmniejszenie uzysku,

— bC:

biomasa końcowa minus biomasa początkowa dla grupy kontrolnej,

— bT:

biomasa końcowa minus biomasa początkowa dla grupy poddawanej zabiegowi.

2.2.3. Wykreślanie krzywych stężenie-odpowiedź

Należy wykreślić krzywe stężenie-odpowiedź wiążące średnią procentową inhibicję zmiennej odpowiedzi (Ir, lub Iy obliczone jak pokazano w ostatnim akapicie sekcji 2.2.1 lub w sekcji 2.2.2) i logarytm stężenia substancji testowej.

2.2.4. Oszacowanie ECx

Oszacowania ECx (np. EC50) powinny być oparte zarówno na średniej właściwej szybkości wzrostu (ErCx) jak i na uzysku (EyCx), z których każde powinno być oparte na liczbie liści oraz jednej dodatkowej zmiennej pomiarowej (całkowitą powierzchnię liści, ciężar masy suchej lub ciężar masy świeżej). Wynika to stąd, że istnieją takie substancje testowe, które wpływają różnie na liczbę liści i inne zmienne pomiarowe. Żądanymi parametrami toksyczności są więc cztery wartości ECx dla każdego obliczonego poziomu inhibicji x: ErCx (liczba liści); ErCx (całkowita powierzchnia liści, ciężar masy suchej lub ciężar masy świeżej); EyCx (liczba liści); oraz EyCx (całkowita powierzchnia liści, ciężar masy suchej lub ciężar masy świeżej).

2.3. PROCEDURY STATYSTYCZNE

Celem jest uzyskanie ilościowej zależności stężenie-odpowiedź za pomocą analizy regresji. Możliwe jest zastosowanie ważonej regresji liniowej po przeprowadzeniu linearyzującej transformacji danych odpowiedzi — na przykład do jednostek probit lub logit albo Weibulla (16), lecz preferowane są procedury regresji nieliniowej, które lepiej znoszą nieuniknione nieregularności danych i odchylenia od gładkich rozkładów. Przy zbliżaniu się do zerowej lub do całkowitej inhibicji, nieregularności takie mogą zostać powiększone przez transformację, zakłócając analizę (16). Należy zwrócić uwagę, że standardowe metody analizy przy użyciu transformat probit, logit lub Weibulla są przeznaczone do stosowania do danych kwantalowych (np. śmiertelności lub przeżywalności) i muszą zostać zmodyfikowane z dostosowaniem do danych szybkości wzrostu lub biomasy. Szczegółowe procedury wyznaczania wartości ECx na podstawie ciągłych danych można znaleźć w (17), (18) i (19).

Dla każdej zmiennej odpowiedzi, która ma być analizowana, należy użyć zależności stężenie-odpowiedź do obliczenia oszacowań punktowych wartości ECx. W miarę możliwości dla każdego oszacowania należy określić granice ufności 95 %. Dokładność dopasowania danych odpowiedzi do modelu regresji należy ocenić graficznie lub statystycznie. Analizę regresji należy przeprowadzić, używając odpowiedzi indywidualnych replikatów zamiast średnich z grup poddawanych zabiegowi.

Oszacowania EC50 i granice ufności można również otrzymać przy użyciu interpolacji liniowej z ładowaniem początkowym (20), jeżeli dostępne modele/metody regresji są nieodpowiednie dla danych.

W celu oszacowania LOEC, a stąd NOEC, konieczne jest porównanie średnich z grup poddawanych zabiegowi przy użyciu technik analizy wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia należy następnie porównać ze średnią kontrolną przy użyciu odpowiedniej metody wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny może być test Dunnetta lub Williamsa (21)(22)(23)(24). Należy ocenić, czy przyjęte w ANOVA założenie homogeniczności wariancji pozostaje w mocy. Ocenę tę można przeprowadzić graficznie lub za pomocą formalnego testu (25). Odpowiednimi do tego celu testami są testy Levene’a lub Bartletta. Niespełnienie założenia o homogeniczności wariancji można niekiedy skorygować za pomocą logarytmicznego przekształcenia danych. Jeżeli heterogeniczność wariancji jest skrajnie duża i nie może być skorygowana przez transformację, to należy rozważyć analizę za pomocą metod takich, jak testy trendu stopniowego obniżania Jonkheere’a. Dodatkowe wskazówki dotyczące wyznaczania NOEC można znaleźć w (19).

Rozwój naukowy, jaki ostatnio nastąpił, doprowadził do zalecenia zarzucenia pojęcia NOEC i zastąpienia go opartymi o regresję oszacowaniami punktowymi ECx. Dla niniejszego badania Lemna nie ustalono odpowiedniej wartości x. Jednakże, odpowiednim wydaje się przedział 10–20 % (w zależności od wybranej zmiennej odpowiedzi), a najlepiej należy podać zarówno EC10 jak i EC20.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Substancja testowa:

— fizyczny charakter i własności fizykochemiczne, w tym graniczna rozpuszczalność w wodzie,

— dane identyfikacyjne substancji chemicznej (np. numer CAS), w tym czystość.

Badane gatunki:

— nazwa naukowa, klon (jeśli jest znany) oraz źródło.

Warunki badania:

— zastosowana procedura badawcza (statyczna, półstatyczna lub przepływowa),

— data rozpoczęcia badania i czas jego trwania,

— pożywka,

— opis planu doświadczalnego: naczynia badawcze i przykrywki, objętości roztworów, liczba kolonii i liści przypadających na naczynie badawcze na początku badania,

— stężenia testowe (nominalne i zmierzone, gdy stosowne) oraz liczba replikatów na stężenie,

— metody sporządzania roztworów podstawowych i testowych, w tym użycie ewentualnych rozpuszczalników lub dyspergatorów,

— temperatura podczas badania,

— źródło światła, natężenie i jednorodność światła,

— wartości pH pożywki testowej i kontrolnej,

— stężenia substancji testowej oraz metoda analizy wraz z odpowiednimi danymi oceny jakości (badania walidacyjne, odchylenia standardowe lub granice ufności analiz),

— metody określania liczby liści i innych zmiennych pomiarowych, np. ciężaru masy suchej, ciężaru masy świeżej lub powierzchni liści,

— wszelkie odstępstwa od niniejszej metody badawczej.

Wyniki:

— dane pierwotne: liczba liści oraz inne zmienne pomiarowe w każdym naczyniu badawczym i kontrolnym podczas każdej obserwacji i okazji analizy,

— średnie i odchylenia standardowe dla każdej zmiennej pomiarowej,

— krzywe wzrostu dla każdego stężenia (zalecane ze zmienną pomiarową przekształconą do postaci logarytmicznej, zob. akapit drugi w sekcji 2.2.1),

— czas podwojenia/szybkość wzrostu w grupie kontrolnej na podstawie liczby liści,

— obliczone zmienne odpowiedzi dla każdego replikatu poddawanemu zabiegowi, wraz z wartościami średnimi i współczynnikiem zmienności dla repplikatów,

— graficzne przedstawienie zależności stężenie/skutek,

— oszacowania punktów końcowych toksyczności dla zmiennych odpowiedzi, np. EC50, EC10, EC20 oraz związane z nimi przedziały ufności. W przypadku obliczenia — LOEC i/lub NOEC oraz metody statystyczne użyte do ich wyznaczenia,

— jeżeli zastosowana została ANOVA — wielkość skutku, który można wykryć (np. najmniejsza znacząca różnica),

— wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którejkolwiek próbie,

— wszelkie wizualne oznaki fitotoksyczności, jak również obserwacje roztworów testowych,

— omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania wynikający z odstępstw od niniejszej metody badawczej.

4. LITERATURA

(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test.

(2) Wykorzystanie badań Lemna w odniesieniu do zabarwionych substancji opisano w sekcji 13.5.3 Podręcznika decyzji UE z lipca 2006 r., dostępnego pod adresem http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals.

(3) Guidance on information requirements and chemical safety assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, dostępny pod adresem

http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1234958685#A

(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.

(6) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(7) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37–120 pp.

(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.

(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3–77 108. September 1977.

(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.

(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481–483.

(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.

(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.

(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.

(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.

(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096–1121.

(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491.

(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.

(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.

(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Dodatek 1

Opis gatunków Lemna

Roślina wodna powszechnie zwana rzęsą, obejmująca gatunki Lemna, należy do rodziny Lemnaceae, na którą składa się szereg występujących na całym świecie gatunków w czterech rodzajach. Ich różny wygląd i taksonomia zostały wyczerpująco opisane (1)(2). Lemna gibba i L. minor są gatunkami reprezentatywnymi dla obszarów o klimacie umiarkowanym i są powszechnie używane do badań toksyczności. Obydwa gatunki mają pływającą lub zanurzoną tarczowatą łodygę (liść) i bardzo cienkie wypustki korzenia wychodzące ze środka dolnej powierzchni każdego liścia. Gatunki Lemna rzadko wytwarzają kwiaty i rośliny rozmnażają się poprzez wegetatywne wytwarzanie nowych liści (3). W porównaniu do starszych roślin młode rośliny bywają zazwyczaj bledsze, mają krótsze korzenie i składają się z dwóch do trzech liści o różnych rozmiarach. Mały rozmiar gatunku Lemna, jego prosta budowa, bezpłciowe rozmnażanie się oraz krótki czas trwania pokolenia sprawiają, że rośliny tego rodzaju są bardzo dogodne do badań laboratoryjnych (4)(5).

Z powodu prawdopodobnej zmienności międzygatunkowej pod względem wrażliwości ważne są jedynie porównania czułości w obrębie gatunku.

Przykłady gatunków Lemna, które były używane do badań: źródła literaturowe dotyczące gatunków

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29: 935–941.

Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Szwedzki Instytut Norm (SIS). (1995). Jakość wody — Wyznaczanie inhibicji wzrostu (7-d) rzęsy Lemna minor, SS 02 82 13. s. 15. (w języku szwedzkim).

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.

Źródła gatunków Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria (Kolekcja kulturowa glonów i cyjanobakterii Uniwersytetu w Toronto)

Department of Botany, University of Toronto (Wydział Botaniki Uniwersytetu w Toronto)

Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2

Tel.: +1–416–978–3641

Faks: +1–416–978–5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University (Uniwersytet Stanu Północna Karolina)

Forestry Dept (Wydział Leśnictwa)

Duckweed Culture Collection (Kolekcja kulturowa rzęsy wodnej)

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695–8002

USA

Tel.: 001 (919) 515–7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University (Instytut Badań Stosowanych nad Środowiskiem, Uniwersytet w Sztokholmie)

106 91 Sztokholm

SZWECJA

Tel.: +46 8 674 7240

Faks: +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA) (Federalna Agencja Środowiskowa)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

NIEMCY

e-mail: lemna@uba.de

http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Literatura

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82–991150–0–0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.

(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7–22.

Dodatek 2

Utrzymanie kultury podstawowej

Kultury podstawowe mogą być utrzymywane w niskich temperaturach (4–10 °C) przez dłuższy okres bez konieczności odtwarzania. Pożywka wzrostowa dla gatunku Lemna może być taka sama jak używana do badań, lecz do kultur podstawowych można używać innych pożywek bogatych w składniki odżywcze.

Okresowo pewną ilość młodych, jasnozielonych roślin przenosi się do zawierających świeżą pożywkę naczyń przeznaczonych na nowe kultury, stosując technikę aseptyczną. W proponowanych tu chłodniejszych warunkach hodowanie podkultur można prowadzić w odstępach czasu wynoszących do trzech miesięcy.

Należy używać chemicznie czystych (przepłukanych kwasem) i sterylnych naczyń na nowe kultury oraz stosować sterylne techniki manipulacji. W razie zanieczyszczenia kultury podstawowej, np. glonami lub grzybami, należy podjąć kroki mające na celu wyeliminowanie zanieczyszczających organizmów. W przypadku glonów i większości innych zanieczyszczających organizmów można tego dokonać przez powierzchniową sterylizację. Pobiera się próbkę zanieczyszczonego materiału roślinnego i odcina się korzenie. Następnie materiał energicznie wytrząsa się w czystej wodzie, po czym zanurza się w 0,5 % (obj.) roztworze podchlorynu sodowego na czas od 30 sekund do 5 minut. Materiał roślinny następnie płucze się sterylną wodą i przenosi się, jako pewną liczbę partii, do przeznaczonych na kultury naczyń zawierających świeżą pożywkę wzrostową. Wiele liści obumrze w wyniku tego zabiegu, zwłaszcza jeśli stosowane będą dłuższe okresy ekspozycji, lecz niektóre spośród tych, które przeżyją, będą zazwyczaj wolne od zanieczyszczenia. Liście te można następnie użyć do ponownego zaszczepienia nowych kultur.

Dodatek 3

Pożywki

Dla L. minor i L. gibba zalecane są różne pożywki wzrostowe. Dla L. minor zaleca się zmodyfikowaną pożywkę według Normy Szwedzkiej (SIS), natomiast dla L. gibba zalecana jest pożywka 20X AAP. Składy obydwu pożywek podano poniżej. Przy sporządzaniu tych pożywek należy użyć substancji chemicznych gatunku odczynnikowego lub analitycznego oraz wody dejonizowanej.

Pożywka wzrostowa dla Lemna według Normy Szwedzkiej (SIS)

— Roztwory podstawowe I–V sterylizuje się przez obróbkę w autoklawie (120 °C, 15 minut) lub za pomocą filtracji przez przeponę (o wielkości porów około 0,2 μm).

— Roztwór podstawowy VI (i opcjonalnie VII) sterylizuje się wyłącznie przez filtrację przeponową; roztworów tych nie należy obrabiać w autoklawie.

— Sterylne roztwory podstawowe należy przechowywać w warunkach chłodnych i ciemnych. Roztwory podstawowe I–V należy usunąć po sześciu miesiącach, natomiast roztwory podstawowe VI (i opcjonalnie VII) mają dopuszczalny okres przechowywania wynoszący jeden miesiąc.

Nr roztworu podstawowego

Substancja

Stężenie w roztworze podstawowym (g·l–1)

Stężenie w sporządzonej pożywce (mg·l–1)

Sporządzona pożywka

Pierwiastek

Stężenie (mg·l–1)

I

NaNO3

KH2PO4

8,50

1,34

85

13,4

Na; N

K; P

32; 14

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

MnCl2 · 4H2O

Na2MoO4 · 2H2O

ZnSO4 · 7H2O

CuSO4 · 5H2O

Co(NO3)2 · 6H2O

1,0

0,20

0,010

0,050

0,0050

0,010

1,00

0,20

0,010

0,050

0,0050

0,010

B

Mn

Mo

Zn

Cu

Co

0,17

0,056

0,0040

0,011

0,0013

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

Na2-EDTA·2H2O

0,17

0,28

0,84

1,4

Fe

— 0,17

— VII

MOPS (bufor)

490

490

— —

— Aby sporządzić jeden litr pożywki SIS, do 900 ml dejonizowanej wody dodaje się:

— 10 ml roztworu podstawowego I,

— 5 ml roztworu podstawowego II,

— 5 ml roztworu podstawowego III,

— 5 ml roztworu podstawowego IV,

— 1 ml roztworu podstawowego V,

— 5 ml roztworu podstawowego VI,

— 1 ml roztworu podstawowego VII (opcjonalnie).

Uwaga: Dla niektórych badanych substancji może być potrzebny dodatkowy roztwór podstawowy VII (bufor MOPS) (zob. ostatni akapit w sekcji 1.4).

— pH reguluje się do 6,5 ± 0,2 przy użyciu 0,1 lub 1 molowego HCl albo NaOH, a objętość uzupełnia się do jednego litra, używając wody dejonizowanej.

Pożywka wzrostowa 20X AAP

Roztwory podstawowe sporządza się w sterylnej wodzie destylowanej lub dejonizowanej.

Sterylne roztwory podstawowe należy przechowywać w warunkach chłodnych i ciemnych. W takich warunkach, dopuszczalny okres przechowywania roztworów podstawowych wynosić będzie co najmniej 6–8 tygodni.

Dla pożywki 20X AAP sporządza się pięć roztworów podstawowych składników odżywczych (A1, A2, A3, B i C), używając substancji chemicznych gatunku odczynnikowego. 20 ml każdego roztworu podstawowego składników odżywczych dodaje się do około 850 ml dejonizowanej wody, tworząc pożywkę wzrostową. pH reguluje się do 7,5 ± 0,1 przy użyciu 0,1 lub 1 molowego HCl albo NaOH, a objętość uzupełnia się do jednego litra, używając wody dejonizowanej. Pożywkę następnie przefiltrowuje się przez filtr przeponowy (ok.) 0,2 μm do sterylnego pojemnika.

Pożywkę wzrostową przeznaczoną do badań należy sporządzić 1–2 dni przed użyciem, aby pozwolić na ustabilizowanie się pH. Przed użyciem należy sprawdzić i wyregulować, w razie potrzeby, pH pożywki wzrostowej przez dodanie 0,1 lub 1 M NaOH albo HCl, jak opisano powyżej.

Nr roztworu podstawowego

Substancja

Stężenie w roztworze podstawowym (g·l–1) (*1)

Stężenie w sporządzonej pożywce (mg·l–1) (*1)

Sporządzona pożywka

Pierwiastek

Stężenie (mg·l–1) (*1)

A1

NaNO3

MgCl2·6H2O

CaCl2·2H2O

26

12

4,4

510

240

90

Na; N

Mg

Ca

190; 84

58,08

24,04

A2

MgSO4·7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4·3H2O

1,4

30

K; P

9,4;3,7

B

H3BO3

MnCl2·4H2O

FeCl3·6H2O

Na2EDTA·2H2O

ZnCl2

CoCl2·6H2O

Na2MoO4·2H2O

CuCl2·2H2O

0,19

0,42

0,16

0,30

3,3 mg·l–1

1,4 mg·l–1

7,3 mg·l–1

0,012 mg·l–1

3,7

8,3

3,2

6,0

66 μg·l–1

29 μg·l–1

145 μg·l–1

0,24 μg·l–1

B

Mn

Fe

— Zn

Co

Mo

Cu

0,65

2,3

0,66

— 31 μg·l–1

7,1 μg·l–1

58 μg·l–1

0,080 μg·l–1

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Przypis: Teoretycznie odpowiednie końcowe stężenie wodorowęglanu (które pozwoli uniknąć znacznej regulacji pH) wynosi 15 mg/l, a nie 300 mg/l. Jednakże historyczne stosowanie odżywki 20X AAP, w tym w próbie pierścieniowej dla niniejszej metody, oparte jest na stężeniu 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse i R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environmental Agency).

Pożywka STEINBERGA (za ISO 20079)

Stężenia i roztwory podstawowe

— Zmodyfikowana pożywka Steinberga zastosowana jest w ISO 20079 dla samego Lemna minor (gdyż tylko Lemna minor jest tam dopuszczona), lecz próby wykazały, iż można uzyskiwać dobre wyniki również w przypadku Lemna gibba.

— Przy sporządzaniu pożywki należy użyć substancji chemicznych gatunku odczynnikowego lub analitycznego oraz wody dejonizowanej.

— Sporządzić odżywkę z roztworów podstawowych lub 10-krotnie zatężonej odżywki, co pozwala na maksymalne stężenie odżywki bez wytrącenia.

Tabela 1

Pożywka STEINBERGA o stabilizowanym pH (zmodyfikowana wg Altenburgera)

Substancja

Pożywka

Makroelementy

masa cząsteczkowa

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelementy

masa cząsteczkowa

µg/l

µmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

Sól dwusodowa EDTA, dwuwodna

372,24

1 500,00

4,03

Tabela 2

Roztwory podstawowe (makroelementy)

1. Makroelementy (zatężone 50-krotnie)

g/l

Roztwór podstawowy 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Roztwór podstawowy 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Roztwór podstawowy 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75

Tabela 3

Roztwory podstawowe (mikroelementy)

2. Mikroelementy (zatężone 1 000 -krotnie)

mg/l

Roztwór podstawowy 4:

H3BO3

120,0

Roztwór podstawowy 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Roztwór podstawowy 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Roztwór podstawowy 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Roztwór podstawowy 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

Sól dwusodowa EDTA, dwuwodna

1 500,00

— Roztwory podstawowe 2 i 3 oraz oddzielnie 4–7 można połączyć z sobą (biorąc pod uwagę wymagane stężenia).

— Aby zapewnić dłuższą przechowalność roztworów podstawowych, należy poddać je obróbce w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min lub, alternatywnie, przeprowadzić sterylną filtrację (0,2 µm). Dla roztworu podstawowego 8 zdecydowanie zaleca się sterylną filtrację (0,2 µm).

Sporządzenie pożywki STEINBERGA (zmodyfikowanej) o stężeniu końcowym

— Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do około 900 ml wody dejonizowanej, aby uniknąć wytrącenia.

— Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3).

— pH powinno wynosić 5,5 ± 0,2 (wyregulować przez dodanie ograniczonej do minimum objętości roztworu NaOH lub HCl).

— Uzupełnić wodą do 1 000 ml.

— Jeżeli roztwory są wysterylizowane i użyta jest odpowiednia woda, to nie ma konieczności dalszej sterylizacji. Jeżeli sterylizacji dokonuje się na końcowej pożywce, to roztwór podstawowy 8 należy dodać po obróbce w autoklawie (w temperaturze 121 °C przez 20 min).

Sporządzenie 10-krotnie zatężonej pożywki STEINBERGA (zmodyfikowanej) do średnioterminowego przechowywania

— Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do około 30 ml wody, aby uniknąć wytrącenia.

— Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3). Uzupełnić wodą do 100 ml.

— Jeżeli roztwory są wysterylizowane i użyta jest odpowiednia woda, to nie ma konieczności dalszej sterylizacji. Jeżeli sterylizacji dokonuje się na końcowej pożywce, to roztwór podstawowy 8 należy dodać po obróbce w autoklawie (w temperaturze 121 °C przez 20 min).

— pH pożywki (końcowe stężenie) powinno wynosić 5,5 ± 0,2.

(*1) O ile nie podano inaczej.