Załącznik V

CZĘŚĆ I

Pobieranie i analiza próbek otłuszczonego mleka w proszku oferowanego w ramach interwencji

1. Próbki są pobierane z każdej partii zgodnie z procedurą określoną w międzynarodowej normie ISO 707. Agencje płatnicze mogą jednak stosować inną metodę pobierania próbek pod warunkiem że jest ona zgodna z zasadami powyższej normy.

2. Liczba opakowań wybieranych do analizy próbek:

a) partie zawierające nie więcej niż 800 worków po 25 kg: co najmniej 8;

b) partie zawierające więcej niż 800 worków po 25 kg: co najmniej 8 plus po jednym na każde kolejne 800 worków lub część tej ilości.

3. Masa próbek: z każdego opakowania pobiera się próbki o masie co najmniej 200 g.

4. Grupowanie próbek: w skład jednej próbki zbiorczej nie powinno wchodzić więcej niż 9 pojedynczych próbek.

5. Analiza próbek: każda próbka zbiorcza powinna być sprawdzona pod względem cech jakościowych określonych w części II załącznika V do rozporządzenia delegowanego (UE) 2016/1238.

6. W przypadku ujawnienia wad w próbkach:

a) jeżeli próbka zbiorcza wykazuje wady w odniesieniu do jednego z parametrów, ilość, z której pochodzi taka próbka, zostaje odrzucona;

b) jeżeli próbka zbiorcza wykazuje wady w odniesieniu do więcej niż jednego z parametrów, ilość, z której pochodzi taka próbka, jest odrzucana i pobrane są próbki z pozostałych ilości z tego samego zakładu; analiza tych próbek jest ostateczna. W tym przypadku:

— liczba próbek ustalona w pkt 2 jest podwajana,

— jeżeli próbka zbiorcza wykazuje wady w odniesieniu do więcej niż jednego z parametrów, ilość z której pochodzi taka próbka, jest odrzucana.

CZĘŚĆ IA

Metody analizy odtłuszczonego mleka w proszku do celów interwencji publicznej

Parametr

Metoda

Białko

ISO 8968 część 1

Tłuszcz

ISO 1736

Woda

ISO 5537

Kwasowość

ISO 6091

Mleczany

ISO 8069

Test na fosfatazę

ISO 11816 część 1

Wskaźnik nierozpuszczalności

ISO 8156

Cząstki przypalone (1)

ADPI

Mikroorganizmy

ISO 4833 część 1

Maślanka

Dodatek I

Serwatka podpuszczkowa (2)

Dodatki II i III

Serwatka kwasowa (3)

ISO 8069 lub kontrole na miejscu

Kontrole sensoryczne (4)

ISO 22935 część 2 i 3

(1) Analiza cząstek przypalonych może być przeprowadzana systematycznie. Analiza taka musi być jednak zawsze przeprowadzona w przypadku braku kontroli sensorycznej.

(2) Stosuje się metodę zatwierdzoną przez agencję płatniczą (jedną lub więcej metod).

(3) Stosuje się metodę zatwierdzoną przez agencję płatniczą.

(4) Jeżeli okaże się to konieczne po przeprowadzeniu analizy ryzyka zatwierdzonej przez agencję płatniczą, przeprowadza się kontrole sensoryczne.

Dodatek I

ODTŁUSZCZONE MLEKO W PROSZKU: ILOŚCIOWE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI FOSFATYDYLOSERYNY I FOSFATYDYLOETANOLAMINY

Metoda: HPLC z odwróconymi fazami.

1. ZAKRES I DZIEDZINA STOSOWANIA

Metoda opisuje procedurę ilościowego oznaczania fosfatydyloseryny (PS) oraz fosfatydyloetanolaminy (PE) w odtłuszczonym mleku w proszku (OMP) i jest odpowiednia do wykrywania suchej masy maślanki w odtłuszczonym mleku w proszku.

2. DEFINICJA

Zawartość PS + PE : ułamek masowy substancji oznaczony z wykorzystaniem procedury określonej w niniejszej metodzie. Wynik wyrażony jest w miligramach dipalmitoilofosfatydyloetanolaminy (PEDP) na 100 g proszku.

3. ZASADA METODY

Ekstrakcja aminofosfolipidów z odtworzonego mleka w proszku przy użyciu metanolu. Oznaczenie PS i PE jako pochodnych dialdehydu o-ftalowego (OPA) metodą HPLC z odwróconymi fazami i detekcją fluorescencyjną. Oznaczenie ilościowe zawartości PS i PE w badanej próbce przez odniesienie do próbki wzorcowej zawierającej znaną ilość PEDP.

4. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Stosuje się wodę destylowaną lub wodę o równoważnym stopniu czystości, jeżeli nie określono inaczej.

4.1.

Materiał wzorcowy: PEDP, czystość co najmniej 99 %

Uwaga: Materiał wzorcowy musi być przechowywany w temperaturze – 18 °C.

4.2.

Odczynniki do przygotowania próbki wzorcowej i próbki badanej

4.2.1.

Metanol o jakości wymaganej dla HPLC

4.2.2.

Chloroform o jakości wymaganej dla HPLC

4.2.3.

Monochlorowodorek tryptaminy

4.3.

Odczynniki do derywatyzacji dialdehydu o-ftalowego

4.3.1.

Wodorotlenek sodu, roztwór wodny 12 M

4.3.2.

Kwas borny, roztwór wodny 0,4 M, o pH doprowadzonym do 10,0 przy użyciu wodorotlenku sodu (ppkt 4.3.1)

4.3.3.

2-merkaptoetanol

4.3.4.

Dialdehyd o-ftalowy (OPA)

4.4.

Rozpuszczalniki eluujące do HPLC

4.4.1.

Rozpuszczalniki eluujące są przygotowywane przy użyciu odczynników o jakości wymaganej dla HPLC.

4.4.2.

Woda o jakości wymaganej dla HPLC

4.4.3.

Metanol o czystości zbadanej fluorometrycznie

4.4.4.

Tetrahydrofuran

4.4.5.

Diwodorofosforan sodu

4.4.6.

Octan sodu

4.4.7.

Kwas octowy

5. APARATURA

5.1.

Waga analityczna, umożliwiająca ważenie z dokładnością do 1 mg, o dokładności odczytu 0,1 mg

5.2.

Zlewki poj. 25 ml i 100 ml

5.3.

Pipety umożliwiające dozowanie 1 ml i 10 ml

5.4.

Mieszadło magnetyczne

5.5.

Pipety miarowe umożliwiające dozowanie 0,2 ml, 0,5 ml i 5 ml

5.6.

Kolby miarowe poj. 10 ml, 50 ml i 100 ml

5.7.

Strzykawki poj. 20 μl i 100 μl

5.8.

Łaźnia ultradźwiękowa

5.9.

Wirówka umożliwiająca osiągnięcie 27 000 × g

5.10.

Fiolki szklane poj. ok. 5 ml

5.11.

Cylinder miarowy poj. 25 ml

5.12.

Pehametr o dokładności pomiaru do 0,1 jednostki pH

5.13.

Sprzęt do HPLC

5.13.1.

Układ pompowy do elucji gradientowej umożliwiający pracę przy natężeniu 1,0 ml/min i ciśnieniu 200 barów

5.13.2.

Automatyczny podajnik do próbek umożliwiający derywatyzację

5.13.3.

Ogrzewacz kolumnowy, umożliwiający utrzymanie kolumny w temp. 30 °C ± 1 °C

5.13.4.

Detektor fluorescencji, umożliwiający pracę przy długości fali wzbudzenia 330 nm i długości fali emisji 440 nm

5.13.5.

Integrator lub oprogramowanie do przetwarzania danych umożliwiające pomiar powierzchni pików

5.13.6.

LiChrospher® – kolumna 100 (250 × 4,6 mm) lub równoważna kolumna wypełniona oktadecylosilanem (C 18) o uziarnieniu 5 μm

6. POBIERANIE PRÓBEK

Pobieranie próbek przeprowadza się zgodnie z normą ISO 707.

7. PROCEDURA

7.1.

Przygotowanie wewnętrznego roztworu wzorcowego

7.1.1.

Odmierzyć wagowo 30,0 ± 0,1 mg monochlorowodorku tryptaminy (ppkt 4.2.3) do kolby miarowej poj. 100 ml (ppkt 5.6) i uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1).

7.1.2.

Odmierzyć pipetą 1 ml (ppkt 5.3) tego roztworu do kolby miarowej poj. 10 ml (ppkt 5.6) i uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1) w celu uzyskania stężenia 0,15 mM tryptaminy.

7.2.

Przygotowanie roztworu próbki badanej

7.2.1.

Odmierzyć wagowo 1,000 ± 0,001 g próbki OMP do zlewki poj. 25 ml (ppkt 5.2). Odmierzyć pipetą (ppkt 5.3) 10 ml wody destylowanej o temp. 40 °C ± 1 °C i mieszać mieszadłem magnetycznym (ppkt 5.4) przez 30 minut do całkowitego rozpuszczenia grudek.

7.2.2.

Odmierzyć pipetą (ppkt 5.5) 0,2 ml odtworzonego mleka do kolby miarowej poj. 10 ml (ppkt 5.6), za pomocą strzykawki (ppkt 5.7) dodać 100 μl roztworu 0,15 mM tryptaminy (ppkt 7.1) i uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1). Wymieszać dokładnie, odwracając kolbę i poddawać sonikacji (ppkt 5.8) przez 15 minut.

7.2.3.

Wirować (ppkt 5.9) przy 27 000 × g przez 10 minut i zebrać nadsącz do szklanej fiolki (ppkt 5.10).

Uwaga: Do chwili przeprowadzenia analizy HPLC roztwór próbki badanej należy przechowywać w temp. 4 °C.

7.3.

Przygotowanie zewnętrznego roztworu wzorcowego

7.3.1.

Odmierzyć wagowo 55,4 mg PEDP (ppkt 4.1) do kolby miarowej poj. 50 ml (ppkt 5.6) i dodać ok. 25 ml chloroformu (ppkt 4.2.2), używając cylindra miarowego (ppkt 5.11). Podgrzać zakorkowaną kolbę do 50 °C ± 1 °C i wymieszać dokładnie aż do rozpuszczenia PEDP. Schłodzić kolbę do 20 °C, uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1) i wymieszać przez odwracanie.

7.3.2.

Odmierzyć pipetą 1 ml (ppkt 5.3) tego roztworu do kolby miarowej poj. 100 ml (ppkt 5.6), uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1). Odmierzyć pipetą 1 ml (ppkt 5.3) tego roztworu do kolby miarowej poj. 10 ml (ppkt 5.6), dodać 100 μl (ppkt 5.7) roztworu 0,15 mM tryptaminy (ppkt 7.1) i uzupełnić do kreski metanolem (ppkt 4.2.1). Wymieszać przez odwracanie.

Uwaga: Do chwili przeprowadzania analizy HPLC roztwór próbki odniesienia należy przechowywać w temp. 4 °C.

7.4.

Przygotowanie odczynnika do derywatyzacji

Odmierzyć wagowo 25,0 ± 0,1 mg OPA (ppkt 4.3.4) do kolby miarowej poj. 10 ml (ppkt 5.6), dodać 0,5 ml (ppkt 5.5) metanolu (ppkt 4.2.1) i wymieszać dokładnie w celu rozpuszczenia OPA. Uzupełnić do kreski roztworem kwasu bornego (ppkt 4.3.2) i dodać 20 μl 2-merkaptoetanolu (ppkt 4.3.3) za pomocą strzykawki (ppkt 5.7).

Uwaga: Odczynnik do derywatyzacji należy przechowywać w temp. 4 °C w fiolce z brązowego szkła; w takich warunkach zachowuje on stabilność przez okres jednego tygodnia.

7.5.

Oznaczenie za pomocą HPLC

7.5.1.

Rozpuszczalniki eluujące (ppkt 4.4)

Rozpuszczalnik A: roztwór 0,3 mM diwodorofosforanu sodu i roztwór 3 mM octanu sodu (dostosowane do pH 6,5 ± 0,1 za pomocą kwasu octowego): metanol: tetrahydrofuran = 558:440:2 (v/v/v)

Rozpuszczalnik B: metanol

7.5.2.

Zalecany gradient elucji

Czas (minuty)

Rozpuszczalnik A (%)

Rozpuszczalnik B (%)

Natężenie przepływu (ml/min)

Początkowy

40

60

0

0,1

40

60

0,1

5,0

40

60

0,1

6,0

40

60

1,0

6,5

40

60

1,0

9,0

36

64

1,0

10,0

20

80

1,0

11,5

16

84

1,0

12,0

16

84

1,0

16,0

10

90

1,0

19,0

0

100

1,0

20,0

0

100

1,0

21,0

40

60

1,0

29,0

40

60

1,0

30,0

40

60

0

Uwaga: W celu uzyskania rozdzielczości przedstawionej na rys. 1 niezbędna może się okazać drobna modyfikacja gradientu elucji.

Temperatura kolumny: 30 °C.

7.5.3.

Objętość wprowadzona: 50 μl odczynnika do derywatyzacji i 50 μl roztworu próbki.

7.5.4.

Równoważenie kolumny

Uruchamiając układ każdego dnia, należy przepłukiwać kolumny rozpuszczalnikiem B o stężeniu 100 % przez 15 minut, następnie ustalić rozpuszczalniki A i B w proporcji 40:60 i równoważyć przy 1 ml/min przez 15 minut. Przeprowadzić ślepą próbę poprzez wprowadzenie metanolu (ppkt 4.2.1).

Uwaga: Przed długotrwałym przechowywaniem płukać kolumnę roztworem metanolu i chloroformu w proporcji 80:20 (v/v) przez 30 minut.

7.5.5.

Oznaczyć zawartość PS + PE w badanej próbce.

7.5.6.

Przeprowadzić sekwencję analiz chromatograficznych, utrzymując niezmieniony czas pomiędzy pojedynczymi analizami w celu uzyskania stałych czasów retencji. Wprowadzać zewnętrzny roztwór wzorcowy (ppkt 7.3) co 5–10 wprowadzeń roztworu badanej próbki w celu obliczenia współczynnika odpowiedzi.

Uwaga: Kolumna jest czyszczona przez przepłukiwanie 100 % rozpuszczalnikiem B (ppkt 7.5.1), przez co najmniej 30 minut, co 20–25 pojedynczych analiz.

7.6.

Metoda całkowania

7.6.1.

Pik PEDP

PEDP jest eluowana w postaci pojedynczego piku. Określić powierzchnię piku przez całkowanie wykresu między kolejnymi dolinami.

7.6.2.

Pik tryptaminy

Tryptamina jest eluowana w postaci pojedynczego piku (rys. 1). Określić powierzchnię piku przez całkowanie wykresu między kolejnymi dolinami.

7.6.3.

Grupy pików PS i PE

W opisanych warunkach (rys. 1) PS jest eluowana w postaci dwóch głównych, częściowo nierozdzielonych pików, poprzedzonych mniejszym pikiem. PE jest eluowana w postaci trzech głównych, częściowo nierozdzielonych pików. Określić całkowitą powierzchnię każdego skupiska pików przez ustawienie linii podstawowej zgodnie z rys. 1.

8. OBLICZANIE I PREZENTACJA WYNIKÓW

Zawartość PS i PE w próbce badanej oblicza się, jak następuje:

C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)),

gdzie:

C

=

zawartość PS lub PE (mg/100 g proszku) w badanej próbce

A 1

=

powierzchnia piku PEDP roztworu próbki wzorcowej (ppkt 7.3)

A 2

=

powierzchnia piku PS lub PE roztworu próbki badanej (ppkt 7.2)

T 1

=

powierzchnia piku tryptaminy w roztworze próbki wzorcowej (ppkt 7.3)

T 2

=

powierzchnia piku tryptaminy w roztworze próbki badanej (ppkt 7.2)

9. DOKŁADNOŚĆ METODY

Uwaga: Wartości powtarzalności zostały obliczone zgodnie z międzynarodową normą IDF (*).

9.1.

Powtarzalność

Względne odchylenie standardowe powtarzalności, wyrażające zmienność niezależnych wyników analitycznych otrzymanych przez ten sam podmiot, wykorzystujący tę samą aparaturę, w takich samych warunkach, na takiej samej próbce badanej oraz w krótkim odstępie czasu, nie powinno przekraczać 2 % wartości względnej. Jeżeli w tych warunkach otrzymane są dwa oznaczenia, względna różnica między dwoma wynikami nie powinna być większa niż 6 % średniej arytmetycznej wyników.

9.2.

Odtwarzalność

Jeżeli podczas analizy tej samej próbki badanej dwa oznaczenia są otrzymane przez podmioty w różnych laboratoriach, w różnych warunkach i przy wykorzystaniu różnej aparatury, względna różnica między dwoma wynikami nie powinna być większa niż 11 % średniej arytmetycznej wyników.

10. ODNIESIENIA

10.1.

Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Rys. 1

Uzyskany przy użyciu HPLC wzór pochodnych OPA fosfatydyloseryny (PS) i fosfatydyloetanolaminy (PE) w wyciągu metanolowym odtworzonego odtłuszczonego mleka w proszku. Podano tryb całkowania dla pików PS, PE i tryptaminy (wzorzec wewnętrzny).

Dodatek II

WYKRYWANIE OBECNOŚCI SERWATKI PODPUSZCZKOWEJ W ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU PRZEZNACZONYM DO PRZECHOWYWANIA PUBLICZNEGO ZA POMOCĄ OZNACZANIA MAKROPEPTYDÓW KAZEINOWYCH METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

1. ZAKRES I DZIEDZINA STOSOWANIA

Omawiana metoda umożliwia wykrywanie obecności serwatki podpuszczkowej w odtłuszczonym mleku w proszku przeznaczonym do przechowywania publicznego za pomocą oznaczania makropeptydów kazeinowych.

2. ODNIESIENIE

Międzynarodowa norma ISO 707 – Mleko i przetwory mleczne – Wytyczne do pobierania próbek.

3. DEFINICJA

Zawartość suchej masy serwatki podpuszczkowej jest zdefiniowana jako procent masowy, określony w oparciu o zawartość makropeptydów kazeinowych w ramach opisanej procedury.

4. ZASADA

— Odtworzenie odtłuszczonego mleka w proszku, usunięcie tłuszczu i białka za pomocą kwasu trichlorooctowego, a następnie wirowanie lub sączenie,

— Oznaczenie ilości makropeptydów kazeinowych (CMP) w nadsączu metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC),

— Ocena wyniku otrzymanego dla próbek poprzez odniesienie do próbek wzorcowych składających się z odtłuszczonego mleka w proszku z dodatkiem znanego udziału procentowego ilości serwatki w proszku lub bez takiego dodatku.

5. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Stosuje się wodę destylowaną lub wodę o równoważnym stopniu czystości.

5.1.

Roztwór kwasu trichlorooctowego

Rozpuścić 240 g kwasu trichlorooctowego (CCl3COOH) w wodzie i uzupełnić do 1 000 ml. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.

5.2.

Roztwór eluentu, pH 6,0

Rozpuścić 1,74 g ortofosforanu dipotasu (K2HPO4), 12,37 g ortofosforanu potasu (KH2PO4) oraz 21,41 g siarczanu sodu (Na2SO4) w ok. 700 ml wody. W razie potrzeby doprowadzić pH do wartości 6,0, używając roztworu kwasu ortofosforowego lub wodorotlenku potasu.

Uzupełnić wodą do 1 000 ml i homogenizować.

Uwaga: Skład eluentu można aktualizować w celu zachowania zgodności z certyfikatem norm lub zaleceniami producenta materiału wypełniającego kolumnę.

Przed zastosowaniem przesączyć roztwór eluentu przez sączek membranowy o średnicy porów 0,45 μm.

5.3.

Rozpuszczalnik przepłukujący

Zmieszać jedną objętość acetonitrylu (CH3CN) z dziewięcioma objętościami wody. Przed użyciem przesączyć mieszaninę przez sączek membranowy o średnicy porów 0,45 μm.

Uwaga: Można zastosować każdy inny rozpuszczalnik przepłukujący o działaniu bakteriobójczym, który nie wpływa niekorzystnie na zdolność rozdzielczą kolumn.

5.4.

Próbki wzorcowe

5.4.1.

Odtłuszczone mleko w proszku spełniające wymogi niniejszego rozporządzenia (tzn. [0])

5.4.2.

To samo odtłuszczone mleko w proszku zafałszowane 5 % (m/m) serwatką typu podpuszczkowego w proszku o składzie standardowym (tzn. [5]).

6. APARATURA

6.1.

Waga analityczna

6.2.

Opcjonalnie wirówka umożliwiająca osiągnięcie siły odśrodkowej 2 200 g, wyposażona w probówki wirówkowe z korkiem lub zatyczką, poj. ok. 50 ml

6.3.

Wstrząsarka mechaniczna

6.4.

Mieszadło magnetyczne

6.5.

Lejki szklane o średnicy ok. 7 cm

6.6.

Sączki papierowe, średnia prędkość sączenia, o średnicy ok. 12,5 cm

6.7.

Szklany zestaw do sączenia z sączkiem membranowym o średnicy porów 0,45 μm

6.8.

Pipety miarowe pozwalające na dozowanie 10 ml (ISO 648, klasa A lub ISO/R 835) lub system dozujący umożliwiający dostarczenie 10,0 ml w ciągu dwóch minut

6.9.

System dozujący umożliwiający dostarczenie 20 ml wody w temp. ok. 50 °C

6.10.

Łaźnia wodna kontrolowana termostatycznie, ustawiona na 25 °C ± 0,5 °C.

6.11.

Zestaw do HPLC, w skład którego wchodzi:

6.11.1.

Pompa

6.11.2.

Dozownik, ręczny lub automatyczny, poj. 15–30 μl

6.11.3.

Dwie kolumny TSK 2 000 -SW połączone szeregowo (długość 30 cm, średnica wewnętrzna 0,75 cm) lub kolumny równoważne (np. jedna kolumna TSK 2 000 -SWxl, jedna kolumna Agilent Technologies Zorbax GF 250), oraz przedkolumna (3 cm × 0,3 cm) wypełnione I 125 lub materiałem o równoważnej efektywności

6.11.4.

Piec do kolumn kontrolowany termostatycznie, ustawiony na temp. 35 °C ± 1 °C

6.11.5.

Detektor UV o zmiennej długości fali, umożliwiający pomiary przy 205 nm, o czułości 0,008 Å

6.11.6.

Integrator umożliwiający całkowanie wykresu między kolejnymi dolinami

Uwaga: Praca z kolumnami utrzymywanymi w temperaturze pokojowej jest możliwa, ale ich zdolność rozdzielcza jest wtedy nieco niższa. W takim wypadku temperatura nie powinna podlegać wahaniom większym niż ± 5 °C w ramach żadnej z analiz.

7. POBIERANIE PRÓBEK

7.1.

Próbki pobiera się zgodnie z procedurą określoną w międzynarodowej normie ISO 707. Państwa członkowskie mogą jednak stosować inną metodę pobierania próbek pod warunkiem, że jest ona zgodna z zasadami powyższej normy.

7.2.

Próbkę przechowywać w warunkach wykluczających spadek jakości lub zmianę składu.

8. PROCEDURA

8.1.

Przygotowanie próbki do badań

Przenieść mleko w proszku do pojemnika o pojemności w przybliżeniu dwukrotnie większej niż objętość proszku, wyposażonego w hermetyczną pokrywę. Natychmiast zamknąć pojemnik. Wymieszać dobrze mleko w proszku poprzez wielokrotne odwracanie pojemnika do góry dnem.

8.2.

Porcja badana

Odmierzyć wagowo 2,000 ± 0,001 g badanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej (ppkt 6.2) bądź w odpowiedniej kolbie z zatyczką (50 ml).

8.3.

Usuwanie tłuszczu i białek

8.3.1.

Do porcji badanej dodać 20,0 ml ciepłej wody (50 °C). Rozpuścić proszek, wstrząsając przez 5 minut przy pomocy wstrząsarki mechanicznej (ppkt 6.3). Umieścić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 6.10) i pozostawić do wyrównania się temperatury do 25 °C.

8.3.2.

Dodawać stopniowo w ciągu dwóch minut 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 5.1) o temp. ok. 25 °C, mieszając jednocześnie energicznie mieszadłem magnetycznym (ppkt 6.4). Umieścić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 6.10) i pozostawić na 60 minut.

8.3.3.

Wirować (ppkt 6.2) przez 10 minut przy 2 200 g lub przesączyć przez sączek papierowy (ppkt 6.6), odrzucając pierwsze 5 ml przesączu.

8.4.

Oznaczenie chromatograficzne

8.4.1.

Wprowadzić 15–30 μl dokładnie odmierzonego nadsączu lub przesączu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPLC (ppkt 6.11), pracując przy natężeniu przepływu wynoszącym 1,0 ml roztworu eluentu (ppkt 5.2) na minutę.

Uwaga 1. Można zastosować inne natężenie przepływu w zależności od średnicy wewnętrznej wykorzystywanej kolumny lub instrukcji producenta kolumny.

Uwaga 2. Podczas każdej przerwy przepłukiwać kolumny wodą. Nie należy nigdy pozostawiać roztworu eluentu (ppkt 5.2) w kolumnach.

Przed każdą przerwą dłuższą niż 24 godziny przepłukać kolumny wodą, a następnie przemywać je roztworem (ppkt 5.3) przez co najmniej trzy godziny przy natężeniu przepływu równym 0,2 ml/min.

8.4.2.

Wyniki chromatograficznej analizy badanej próbki [E] otrzymuje się w postaci chromatogramu, na którym poszczególne piki określa się za pomocą ich czasu retencji RT w następujący sposób:

Pik II:

Drugi pik chromatogramu z RT wynoszącym ok. 12,5 minuty.

Pik III:

Trzeci pik chromatogramu, odpowiadający CMP, z RT wynoszącym 15,5 minuty.

Dobór kolumny lub kolumn może mieć znaczący wpływ na czasy retencji poszczególnych pików.

Integrator (ppkt 6.11.6) automatycznie oblicza powierzchnię A każdego piku.

AII:

powierzchnia piku II

AIII:

powierzchnia piku III

Konieczne jest zbadanie wyglądu każdego chromatogramu przed dokonaniem interpretacji ilościowej w celu wykrycia ewentualnych nieprawidłowości, będących skutkiem wadliwego działania aparatury lub kolumn albo też pochodzenia i rodzaju analizowanej próbki.

W razie wątpliwości analizę należy powtórzyć.

8.5.

Kalibracja

8.5.1.

Do próbek wzorcowych (ppkt 5.4) zastosować dokładnie procedurę opisaną w ppkt 8.2–8.4.2.

Używać świeżo przygotowanych roztworów, ponieważ w środowisku 8 % kwasu trichlorooctowego następuje rozpad CMP. Straty szacuje się na 0,2 % na godzinę w temp. 30 °C.

8.5.2.

Przed oznaczeniem chromatograficznym próbek należy przygotować kolumny, wprowadzając wielokrotnie próbkę wzorcową (ppkt 5.4.2) w roztworze (ppkt 8.5.1) do momentu, gdy powierzchnia i czas retencji piku odpowiadającego CMP są stałe.

8.5.3.

Oznaczyć współczynniki odpowiedzi R poprzez wprowadzenie takiej samej objętości przesączu (ppkt 8.5.1), jak objętość wykorzystana do próbek.

9. PREZENTACJA WYNIKÓW

9.1.

Metoda obliczania i wzory

9.1.1.

Obliczanie współczynników odpowiedzi R:

Pik II:

RII = 100/(AII[0])

gdzie:

RII

=

współczynniki odpowiedzi pików II,

AII [0]

=

powierzchnie pików II próbki wzorcowej [0] otrzymane w ppkt 8.5.3.

Pik III:

RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])

gdzie:

RIII

=

współczynniki odpowiedzi piku III,

AIII [0] i AIII [5]

=

powierzchnie piku III w próbkach wzorcowych, odpowiednio [0] i [5], otrzymane w ppkt 8.5.3.

W

=

ilość serwatki w próbce wzorcowej [5], tzn. 5.

9.1.2.

Obliczanie względnej powierzchni pików w próbce [E]

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E],

gdzie:

SII [E], SIII [E], SIV [E]

=

względne powierzchnie pików, odpowiednio, II, III i IV, w próbce [E],

AII [E], AIII [E]

=

powierzchnie pików, odpowiednio, II i III w próbce [E], otrzymane w ppkt 8.4.2,

RII, RIII

=

współczynniki odpowiedzi obliczone w ppkt 9.1.1.

9.1.3.

Obliczanie względnego czasu retencji piku III w próbce [E]:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]),

gdzie:

RRTIII [E]

=

względny czas retencji piku III w próbce [E],

RTIII [E]

=

względny czas retencji piku III w próbce [E] otrzymany w ppkt 8.4.2,

RTIII [5]

=

czas retencji piku III w próbce kontrolnej [5] otrzymany w ppkt 8.5.3.

9.1.4.

Doświadczenia wykazały, że istnieje liniowa zależność między względnym czasem retencji piku III, tzn. RRTIII [E] i zawartością procentową serwatki w proszku w zakresie do 10 %.

— RRTIII [E] jest < 1,000, gdy zawartość serwatki wynosi > 5 %,

— RRTIII [E] jest ≥ 1,000 gdy zawartość serwatki wynosi ≤ 5 %.

Dopuszczalna niepewność w odniesieniu do wartości RRTIII wynosi ±0,002.

Zazwyczaj wartość RRTIII [0] odbiega nieco od 1,034. W zależności od stanu kolumn wartość ta może zbliżać się do 1,000, ale zawsze musi ją przewyższać.

9.2.

Obliczanie zawartości procentowej serwatki podpuszczkowej w proszku w próbce:

W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)],

gdzie:

W

=

zawartość procentowa m/m serwatki podpuszczkowej w próbce [E];

SIII [E]

=

względna powierzchnia piku III próbki badanej [E] otrzymana w ppkt 9.1.2;

1,3

=

stanowi średnią powierzchnię względną piku III wyrażoną w gramach serwatki podpuszczkowej na 100 g, oznaczoną w niezafałszowanym odtłuszczonym mleku w proszku różnego pochodzenia. Wielkość tę uzyskano doświadczalnie;

SIII [0]

=

stanowi względną powierzchnię piku III, która jest równa RIII × AIII [0]. Wartości te uzyskano odpowiednio w ppkt 9.1.1 i pkt. 8.5.3;

(SIII [0] – 0,9)

=

stanowi poprawkę, jaką należy wprowadzić w odniesieniu do średniej powierzchni względnej 1,3, gdy SIII [0] nie jest równe 0,9. Doświadczalnie określono, że średnia powierzchnia piku III próbki kontrolnej [0] wynosi 0,9.

9.3.

Dokładność procedury

9.3.1.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń wykonanych równocześnie lub w bezpośrednim następstwie przez tego samego analityka przy użyciu tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 0,2 % m/m.

9.3.2.

Odtwarzalność

Różnica między dwoma pojedynczymi i niezależnymi wynikami, otrzymanymi w dwóch różnych laboratoriach na identycznym materiale badanym, nie może przekraczać 0,4 % m/m.

9.4.

Interpretacja

9.4.1.

Należy przyjąć, że serwatka jest nieobecna, jeżeli względna powierzchnia piku III, SIII [E], wyrażona w gramach serwatki podpuszczkowej na 100 g produktu, wynosi ≤ 2,0 + (SIII [0] – 0,9),

gdzie:

2,0

to maksymalna wartość dopuszczalna dla względnej powierzchni piku III przy uwzględnieniu względnej średniej powierzchni piku III, tzn. 1,3; niepewność wynika ze zmian składu odtłuszczonego mleka w proszku oraz odtwarzalności metody (ppkt 9.3.2),

(SIII [0] – 0,9)

to poprawka, jaką należy wprowadzić, jeżeli powierzchnia SIII [0] jest różna od 0,9 (zob. ppkt 9.2)

9.4.2.

Jeżeli względna powierzchnia piku III, SIII [E], jest > 2,0 + (SIII [0] – 0,9), a względna powierzchnia piku II, SII [E] ≤ 160, należy oznaczyć zawartość serwatki podpuszczkowej w sposób wskazany w ppkt 9.2.

9.4.3.

Jeżeli względna powierzchnia piku III, SIII [E], jest > 2,0 + (SIII [0] – 0,9), a względna powierzchnia piku II, SII [E] ≤ 160, należy oznaczyć zawartość białka (P %); następnie zbadać wykresy 1 i 2.

9.4.3.1.

Dane otrzymane po analizie próbek niezafałszowanego odtłuszczonego mleka w proszku o wysokiej całkowitej zawartości białka zostały zgromadzone na wykresach 1 i 2.

Linia ciągła ilustruje regresję liniową, której współczynniki obliczane są metodą najmniejszych kwadratów.

Linia prosta przerywana wyznacza górną granicę względnej powierzchni piku III z prawdopodobieństwem nieprzekroczenia jej w 90 % przypadków.

Równania w odniesieniu do prostych linii przerywanych na wykresach 1 i 2 są następujące:

SIII = 0,376 P % – 10,7

(wykres 1)

SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93

(wykres 2)

gdzie, odpowiednio:

SIII

to względna powierzchnia piku III wyliczona albo według całkowitej zawartości białka, albo według względnej powierzchni piku SII [E],

P %

to całkowita zawartość białka wyrażona jako zawartość procentowa, masowo,

SII [E]

to względna powierzchnia piku próbki obliczona w ppkt 9.1.2.

Równania te odpowiadają liczbie 1,3 wymienionej w ppkt 9.2.

Rozbieżność (T1 i T2) między stwierdzoną względną powierzchnią SIII [E] a względną powierzchnią SIII jest podawana w sposób następujący: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]

9.4.3.2.

Jeżeli T1 lub T2

są równe lub mniejsze od zera, nie można ustalić obecności serwatki podpuszczkowej.

Jeżeli T1 lub T2

są większe od zera, serwatka podpuszczkowa jest obecna.

Zawartość serwatki podpuszczkowej jest obliczana zgodnie ze wzorem: W = T2 + 0,91,

gdzie:

0,91 stanowi odległość na osi pionowej pomiędzy ciągłymi i przerywanymi liniami prostymi.

Dodatek III

OZNACZANIE SUCHEJ MASY SERWATKI PODPUSZCZKOWEJ W ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU

1. CEL: WYKRYCIE DODATKU SUCHEJ MASY SERWATKI PODPUSZCZKOWEJ DO ODTŁUSZCZONEGO MLEKA W PROSZKU

2. ODNIESIENIA: MIĘDZYNARODOWA NORMA ISO 707

3. DEFINICJA

Zawartość suchej masy serwatki podpuszczkowej zdefiniowana jest jako procent masowy, określony na podstawie zawartości makropeptydów kazeinowych za pomocą opisanej procedury.

4. ZASADA

Próbki poddaje się badaniu na makropeptyd kazeinowy A za pomocą procedury wysokosprawnej chromatografii cieczowej (procedura HPLC) z odwróconymi fazami. Ocena wyników otrzymywana jest poprzez odniesienie do próbek wzorcowych składających się z odtłuszczonego mleka w proszku zawierającego znany udział procentowy serwatki w proszku i odtłuszczonego mleka w proszku niezawierającego tego udziału. Wyniki wyższe niż 1 % (m/m) wskazują na obecność suchej masy serwatki podpuszczkowej.

5. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Stosuje się wodę destylowaną lub wodę o równoważnym stopniu czystości. Acetonitryl powinien mieć jakość spektroskopową lub jakość wymaganą dla HPLC.

5.1.

Roztwór kwasu trichlorooctowego

Rozpuścić 240 g kwasu trichlorooctowego (CCl3COOH) w wodzie i uzupełnić do 1 000 ml. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.

5.2.

Eluenty A i B

Eluent A: Eluent A: 150 ml acetonitrylu (CH3CN), 20 ml izopropanolu (CH3CHOHCH3) oraz 1,00 ml kwasu trifluorooctowego (TFA, CF3COOH) umieszcza się w kolbie miarowej o poj. 1 000 ml. Uzupełnić wodą do 1 000 ml.

Eluent B: 550 ml acetonitrylu, 20 ml izopropanolu oraz 1,00 ml TFA umieszcza się w kolbie miarowej o poj. 1 000 ml. Uzupełnić wodą do 1 000 ml. Przed zastosowaniem przesączyć roztwór eluentu przez sączek membranowy o średnicy porów 0,45 μm.

5.3.

Konserwacja kolumny

Po przeprowadzeniu analiz kolumna przepłukiwana jest eluentem B (metodą gradientową), a następnie przepłukiwana acetonitrylem (metodą gradientową przez 30 minut). Kolumna przechowywana jest w acetonitrylu.

5.4.

Próbki wzorcowe

5.4.1.

Odtłuszczone mleko w proszku spełniające wymogi przechowywania publicznego (tzn. [0]).

5.4.2.

To samo odtłuszczone mleko w proszku zafałszowane 5 % (m/m) serwatką typu podpuszczkowego w proszku o składzie standardowym (tzn. [5]).

5.4.3.

To samo odtłuszczone mleko w proszku zafałszowane 50 % (m/m) serwatką typu podpuszczkowego w proszku o składzie standardowym (tzn. [50]).

6. APARATURA

6.1.

Waga analityczna

6.2.

Opcjonalnie wirówka umożliwiająca osiągnięcie siły odśrodkowej 2 200 g, wyposażona w probówki wirówkowe z korkiem lub zatyczką, poj. ok. 50 ml

6.3.

Wstrząsarka mechaniczna

6.4.

Mieszadło magnetyczne

6.5.

Lejki szklane o średnicy ok. 7 cm

6.6.

Sączki papierowe, średnia prędkość sączenia, o średnicy ok. 12,5 cm

6.7.

Szklany zestaw do sączenia z sączkiem membranowym o średnicy porów 0,45 μm

6.8.

Pipety miarowe pozwalające na dozowanie 10 ml (ISO 648, klasa A lub ISO/R 835) albo system dozujący umożliwiający dostarczenie 10,0 ml w ciągu dwóch minut.

6.9.

System dozujący umożliwiający dostarczenie 20,0 ml wody w temp. ok. 50 °C

6.10.

Łaźnia wodna kontrolowana termostatycznie, ustawiona na 25 °C ± 0,5 °C.

6.11.

Zestaw do HPLC, w skład którego wchodzi:

6.11.1.

Układ pompowy do dwuskładnikowej elucji gradientowej

6.11.2.

Dozownik, ręczny lub automatyczny, poj. 100 μl

6.11.3.

Kolumna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (długość 25 cm, średnica wewnętrzna 0,46 cm) bądź równoważna kolumna do chromatografii z odwróconymi fazami z wypełnieniem na bazie krzemionki o szerokich porach.

6.11.4.

Piec do kolumn kontrolowany termostatycznie, ustawiony na temp. 35 °C ± 1 °C

6.11.5.

Detektor UV o zmiennej długości fali, umożliwiający pomiary przy 210 nm (w razie konieczności można stosować długość fal do 220 nm), o czułości 0,02 Å

6.11.6.

Integrator umożliwiający całkowanie względem wspólnej linii podstawowej lub wykresu między kolejnymi dolinami

Uwaga: Działanie kolumny w temperaturze pokojowej jest możliwe pod warunkiem, że temperatura pokojowa nie podlega wahaniom większym niż 1 °C, w przeciwnym razie ma miejsce zbyt duże wahanie w czasie retencji CMP A.

7. POBIERANIE PRÓBEK

7.1.

Próbki pobiera się zgodnie z procedurą określoną w międzynarodowej normie ISO 707. Państwa członkowskie mogą jednak stosować inną metodę pobierania próbek pod warunkiem, że jest ona zgodna z zasadami powyższej normy.

7.2.

Próbkę przechowywać w warunkach wykluczających spadek jakości lub zmianę składu.

8. PROCEDURA

8.1.

Przygotowanie próbki do badań

Przenieść mleko w proszku do pojemnika o pojemności w przybliżeniu dwukrotnie większej niż objętość proszku, wyposażonego w hermetyczną pokrywę. Natychmiast zamknąć pojemnik. Wymieszać dobrze mleko w proszku poprzez wielokrotne odwracanie pojemnika do góry dnem.

8.2.

Porcja badana

Odmierzyć wagowo 2,00 ± 0,001 g badanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej (ppkt 6.2) bądź w odpowiedniej kolbie z korkiem (50 ml).

Uwaga: W przypadku mieszanek odmierzyć wagowo taką ilość badanej próbki, aby odtłuszczona porcja próbki odpowiadała 2,00 g.

8.3.

Usuwanie tłuszczu i białek

8.3.1.

Do porcji badanej dodać 20,0 ml ciepłej wody (50 °C). Rozpuścić proszek, wstrząsając przez 5 minut przy pomocy wstrząsarki mechanicznej (ppkt 6.3). Umieścić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 6.10) i pozostawić do wyrównania się temperatury do 25 °C.

8.3.2.

Dodawać stopniowo przez dwie minuty 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 5.1) o temp. ok. 25 °C, mieszając jednocześnie energicznie mieszadłem magnetycznym (ppkt 6.4). Umieścić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 6.10) i pozostawić na 60 minut.

8.3.3.

Wirować (ppkt 6.2) przez 10 minut przy 2 200 g lub przesączyć przez sączek papierowy (ppkt 6.6), odrzucając pierwsze 5 ml przesączu.

8.4.

Oznaczenie chromatograficzne

8.4.1.

Analiza HPLC z odwróconymi fazami wyklucza możliwość otrzymania wyników fałszywie dodatnich ze względu na obecność maślanki kwasowej w proszku.

8.4.2.

Przed przeprowadzeniem analizy HPLC z odwróconymi fazami należy zoptymalizować warunki gradientu. Czas retencji wynoszący 26 ± 2 minuty dla CMPΑ jest czasem optymalnym w systemach gradientowych z martwą objętością wynoszącą ok. 6 ml (objętość od punktu, w którym łączą się rozpuszczalniki, do pętli dozownika włącznie). W przypadku systemów gradientowych z niższą martwą objętością (np. 2 ml) należy stosować optymalny czas retencji wynoszący 22 minuty.

Pobrać roztwory próbek wzorcowych (ppkt 5.4) z dodatkiem 50 % serwatki podpuszczkowej oraz bez takiego dodatku.

Wprowadzić 100 μl nadsączu lub przesączu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPCL działającej w warunkach gradientu rozpoznawczego podanych w tabeli 1.

Tabela 1

Warunki gradientu rozpoznawczego dla optymalizacji chromatografii

Czas

(minuty)

Przepływ

(ml/min)

% A

% B

Krzywa

Początkowy

1,0

90

10

*

27

1,0

60

40

liniowa

32

1,0

10

90

liniowa

37

1,0

10

90

liniowa

42

1,0

90

10

liniowa

Porównanie dwóch chromatogramów powinno ujawnić położenie piku CMPΑ.

Wykorzystując podany niżej wzór, można obliczyć początkowy skład rozpuszczalnika, który ma zostać użyty do gradientu normalnego (zob. ppkt 8.4.3) % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11

gdzie:

RTcmpA

:

czas retencji CMPΑ w gradiencie rozpoznawczym

10

:

początkowy % B gradientu rozpoznawczego

2,5

:

% B w punkcie środkowym minus % B w początku gradientu normalnego

13,5

:

czas w punkcie środkowym gradientu rozpoznawczego

26

:

wymagany czas retencji CMPΑ

6

:

stosunek nachylenia gradientu rozpoznawczego i normalnego

30

:

% B na początku minus % B w 27 minucie gradientu rozpoznawczego

27

:

czas przebiegu gradientu rozpoznawczego

8.4.3.

Pobranie roztworów badanych próbek:

Wprowadzić 100 μl dokładnie odmierzonego nadsączu lub przesączu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPCL, pracując przy natężeniu przepływu roztworu eluentu (ppkt 5.2) wynoszącej 1,0 ml na minutę.

Skład eluentu w chwili rozpoczęcia analizy otrzymuje się z ppkt 8.4.2. Zazwyczaj jest on zbliżony do A:B = 76:24 (ppkt 5.2). Natychmiast po wprowadzeniu uruchamia się gradient liniowy, który daje zwiększenie wartości procentowej B o 5 % po 27 minutach. Następnie uruchamia się gradient liniowy, który pozwala na uzyskanie składu eluentu w wysokości 90 % B w ciągu pięciu minut. Skład ten utrzymywany jest przez pięć minut, po czym zostaje zmieniony poprzez gradient liniowy w ciągu pięciu minut do składu początkowego. W zależności od wewnętrznej pojemności układu pompującego następne wprowadzenie można wykonać 15 minut po uzyskaniu warunków początkowych.

Uwaga 1. Czas retencji CMPA powinien wynosić 26 ± 2 minuty. Można to osiągnąć poprzez zmianę początkowych i końcowych warunków pierwszego gradientu. Jednakże różnica w % B dla początkowych i końcowych warunków pierwszego gradientu pozostaje na poziomie 5 % B.

Uwaga 2. Eluenty powinny być odgazowane w sposób wystarczający i pozostawać w takim stanie. Jest to istotne dla właściwego funkcjonowania gradientowego układu pompowego. Odchylenie standardowe dla czasu retencji piku CMPA powinno być mniejsze niż 0,1 minuty (n = 10).

Uwaga 3. Po wprowadzeniu każdej serii pięciu próbek należy wprowadzić próbkę odniesienia [5] i wykorzystać ją do obliczenia nowego współczynnika odpowiedzi R. (ppkt 9.1.1).

8.4.4.

Wyniki analizy chromatograficznej badanej próbki (E) otrzymuje się w postaci chromatogramu, na którym pik CMPA określa się na podstawie jego czasu retencji wynoszącego ok. 26 minut.

Integrator (ppkt 6.11.6) automatycznie oblicza wysokość H piku CMPA. W każdym chromatogramie należy sprawdzić położenie linii podstawowej. W przypadku nieprawidłowego położenia linii podstawowej analizę lub całkowanie należy powtórzyć.

Uwaga: Jeżeli pik CMPA jest wystarczająco oddzielony od innych pików, należy zastosować wyznaczenie linii podstawowej na podstawie położenia dolin między pikami, w przeciwnym razie zastosować spuszczenie prostopadłych na wspólną linię podstawową, której punkt wyjścia powinien być położony w pobliżu piku CMPA (co wyklucza t = 0 min!).W odniesieniu do wzorca i do próbek należy zastosować tę samą metodę całkowania, jak również sprawdzić, w przypadku wspólnej linii podstawowej, jej spójność w odniesieniu do próbek i do wzorca.

Przed dokonaniem interpretacji ilościowej niezbędne jest zbadanie wyglądu każdego chromatogramu w celu wykrycia ewentualnych nieprawidłowości, będących skutkiem wadliwego działania aparatury lub kolumny albo też pochodzenia i rodzaju analizowanej próbki. W razie wątpliwości analizę należy powtórzyć.

8.5.

Kalibracja

8.5.1.

Do próbek wzorcowych (ppkt 5.4.1–5.4.2) zastosować dokładnie procedurę opisaną od ppkt 8.2 do ppkt 8.4.4. Używać świeżo przygotowanych roztworów, ponieważ w środowisku 8 % kwasu trichlorooctowego w temperaturze pokojowej następuje rozkład CMP. W temp. 4 °C roztwór pozostaje stabilny przez 24 godziny. W przypadku długich serii analiz wskazane jest zastosowanie schłodzonego zasobnika na próbki w dozowniku automatycznym.

Uwaga: Podpunkt 8.4.2. można opuścić w przypadku, gdy % B w warunkach początkowych jest znany z poprzednich analiz.

Chromatogram próbki odniesienia [5] powinien być analogiczny do pokazanego na rys. 1. Na tym rysunku pik CMPA poprzedzony jest przez dwa niewielkie piki. Istotne jest, aby uzyskać podobny rozdział.

8.5.2.

Przed oznaczeniem chromatograficznym próbek wprowadzić 100 μl próbki wzorcowej bez serwatki podpuszczkowej [0] (ppkt 5.4.1).

Chromatogram nie powinien wykazywać piku w czasie retencji piku CMPA.

8.5.3.

Określić współczynniki odpowiedzi R poprzez wprowadzenie takiej samej objętości przesączu (ppkt 8.5.1), jak objętość wykorzystana do próbek.

9. PREZENTACJA WYNIKÓW

9.1.

Metoda obliczania i wzory

9.1.1.

Obliczanie współczynnika odpowiedzi R:

Pik CMPA: R = W/H,

gdzie:

R

=

współczynnik odpowiedzi piku CMPA

H

=

wysokość piku CMPA

W

=

ilość serwatki w próbce wzorcowej [5].

9.2.

Obliczanie zawartości procentowej serwatki podpuszczkowej w proszku w próbce

W(E) = R × H(E),

gdzie:

W(E)

=

zawartość procentowa (m/m) serwatki podpuszczkowej w próbce (E)

R

=

współczynnik odpowiedzi piku CMPA (ppkt 9.1.1)

H(E)

=

wysokość piku CMPA próbki (E)

W przypadku gdy wartość W(E) jest większa niż 1 %, a różnica między czasem retencji próbki badanej a czasem retencji próbki wzorcowej [5] jest mniejsza niż 0,2 minuty, wówczas stwierdzona jest obecność suchej masy serwatki podpuszczkowej.

9.3.

Dokładność procedury

9.3.1.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń wykonanych równocześnie lub w bezpośrednim następstwie przez tego samego analityka przy użyciu tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 0,2 % m/m.

9.3.2.

Odtwarzalność

Nieustalona.

9.3.3.

Liniowość

W zakresie 0–16 % serwatki podpuszczkowej należy otrzymać zależność liniową przy współczynniku korelacji > 0,99.

9.4.

Interpretacja

Wartość graniczna wynosząca 1 % uwzględnia niepewność związaną z odtwarzalnością.

(*) Norma międzynarodowa 135B/1991. Mleko i przetwory mleczne. Charakterystyka precyzji metod analitycznych. Zarys procedury współpracy badawczej.

CZĘŚĆ II

Dostawa i opakowanie odtłuszczonego mleka w proszku

1. Odtłuszczone mleko w proszku jest pakowane w nowe, czyste, suche i nienaruszone worki spełniające następujące wymogi:

a) worki mają co najmniej 3 warstwy, które łącznie dają średnią wytrzymałość do 420 J/m2 TEA;

b) druga warstwa pokryta jest warstwą polietylenową o grubości co najmniej 15 g/m2;

c) w środku warstw papierowych umieszczona jest torba polietylenowa o grubości co najmniej 0,08 mm, przytwierdzona na dole;

d) worki odpowiadają normie EN 770;

e) w czasie pakowania proszek powinien być dobrze sprasowany. Nie wolno dopuścić, by luźny proszek znalazł się między poszczególnymi warstwami.

2. Na opakowaniu znajdują się co najmniej następujące dane, w stosownych przypadkach w postaci kodu:

a) numer zatwierdzenia identyfikującego zakład oraz państwo członkowskie produkcji;

b) data produkcji lub, w stosownych przypadkach, tydzień produkcji;

c) numer produkcyjny partii;

d) napis: „odtłuszczone mleko w proszku otrzymane metodą rozpyłową”.

3. Obowiązkiem podmiotu przechowującego jest prowadzenie rejestru, w którym w dniu przyjęcia do przechowywania zamieszczane są dane określone w pkt 2.