Załącznik I

1. OGÓLNE ZASADY DOTYCZĄCE WYSTĘPOWANIA OKREŚLONEGO AGROFAGA

1.1. Występowanie określonego agrofaga podejrzewa się w przypadku uzyskania pozytywnego wyniku pierwszego testu wykrywania przeprowadzonego na określonej roślinie lub na próbkach wody.

1.2. Występowanie określonego agrofaga jest potwierdzone w następujących przypadkach:

a) gdy pierwszym lub drugim testem wykrywania jest izolacja selektywna, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii, a pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych przeprowadzonych na tych koloniach;

b) gdy pierwszym i drugim testem są testy inne niż izolacja selektywna, a pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych po poddaniu próbki izolacji selektywnej, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii.

Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g).

2. TESTY

2.1. Testy wykrywania

Testy wykrywania zapewniają spójne wykrywanie co najmniej 104 komórek/ml zawieszonego osadu pobranego z próbek niewykazujących objawów.

Drugi test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych niż pierwszy test wykrywania.

Stosuje się następujące testy wykrywania:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) izolację określonego agrofaga na podłożu półselektywnym mSMSA zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) konwencjonalny test PCR z użyciem starterów Pastrik et al. (2002) (

1

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond:

(i) Weller et al. (2000) (

2

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(ii) Vreeburg et al. (2016) (

3

) (przy użyciu sondy TaqMan® zmodyfikowanej w stosunku do oryginalnej sondy opisanej przez Wellera et al. (2000)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iii) Vreeburg et al. (2018) (

4

) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iv) Massart et al. (2014) (

5

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) test LAMP (izotermiczna amplifikacja kwasów nukleinowych) z użyciem starterów Lenarčič et al. (2014) (

6

) (jedynie w przypadku materiału roślinnego o typowych objawach chorobowych) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

2.2. Testy identyfikacyjne

Stosuje się następujące testy identyfikacyjne:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) konwencjonalne testy PCR z użyciem starterów Pastrik et al. (2002) zgodnie ze szczegółowym opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond:

(i) Weller et al. (2000) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(ii) Vreeburg et al. (2016) (przy użyciu sondy TaqMan® zmodyfikowanej w stosunku do oryginalnej sondy opisanej przez Wellera et al. (2000)) zgodnie ze szczegółowym opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iii) Vreeburg et al. (2018) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iv) Massart et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) test LAMP (amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli) z użyciem starterów Lenarčič et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) specyficzny dla danego filotypu multipleksowy konwencjonalny test PCR (Opina et al. (1997) (

7

); Fegan i Prior (2005) (

8

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

f) barkodowanie DNA (Wicker et al. (2007) (

9

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018) (

10

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

3. SCHEMATY BLOKOWE PROCEDUR

Schemat blokowy nr 1: Procedura diagnostyczna dotycząca występowania określonego agrofaga w próbkach określonej rośliny

a

Izolacja może być stosowana jako pierwszy lub drugi test wykrywania. Jeśli podejrzewa się występowanie określonego agrofaga na podłożu, kolonie oczyszcza się w celu uzyskania czystych kultur, na których należy przeprowadzić dwa testy identyfikacyjne.

b

Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g). W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

c

Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych.

Schemat blokowy nr 2: Procedura diagnostyczna dotycząca określonego agrofaga w próbkach wody

a

Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g). W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.1. Próbki pochodzące z bulw niewykazujących objawów

Standardowa próbka zawiera 200 bulw na każdy test. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania fragmentów części przystolonowych w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.

4.2. Próbki pochodzące z określonych roślin niewykazujących objawów

Wykrywanie zakażeń utajonych przeprowadza się w próbkach złożonych z fragmentów łodygi lub ogonków liściowych. Procedurę można zastosować do maksymalnie 200 fragmentów łodygi lub 200 ogonków liściowych pobranych z różnych roślin w jednej próbce. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do odkażania i testowania fragmentów łodygi lub ogonków liściowych w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.3. Próbki pochodzące z wykazującego objawy materiału określonych roślin

Fragmenty tkanki pobiera się aseptycznie z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek przewodzących łodygi określonych roślin wykazujących objawy więdnięcia. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano szczegółowo właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania tych tkanek w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.4. Próbki wody powierzchniowej lub recyrkulacyjnej (w tym ścieki pochodzące z obróbki ziemniaków lub ścieki ciekłe)

Podstawowym testem służącym do wykrywania określonego agrofaga w próbkach wód powierzchniowych, wód z systemów recyrkulacji oraz próbkach ścieków (przemysł przetwórczy ziemniaków) jest izolacja selektywna. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania próbek wody.