Załącznik I

1. OGÓLNE ZASADY DOTYCZĄCE WYSTĘPOWANIA OKREŚLONEGO AGROFAGA

1.1. Występowanie określonego agrofaga podejrzewa się w przypadku uzyskania pozytywnego wyniku pierwszego testu wykrywania przeprowadzonego na określonej roślinie.

W przypadku materiału roślinnego wykazującego objawy pierwszym testem wykrywania może być izolacja selektywna.

1.2. Występowanie określonego agrofaga potwierdza się w wykazujących objawy próbkach określonych roślin w następujących przypadkach:

a) gdy pierwszym testem wykrywania jest izolacja selektywna, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii: pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych;

b) gdy pierwszym testem wykrywania jest inny test niż izolacja selektywna:

(i) pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych po poddaniu próbki izolacji selektywnej;

(ii) pozytywne wyniki uzyskuje się w drugim teście wykrywania, innym niż izolacja selektywna.

1.3. Występowanie określonego agrofaga potwierdza się w niewykazujących objawów próbkach określonych roślin w następujących przypadkach:

a) gdy wynik pozytywny uzyskuje się w drugim teście wykrywania, pod warunkiem że pierwszy lub drugi test wykrywania jest testem molekularnym (opartym na DNA) (TaqMan® metodą PCR w czasie rzeczywistym lub konwencjonalnego PCR);

b) w przypadku próbek pobranych w państwie członkowskim lub na obszarze państwa członkowskiego, w którym nie stwierdzono występowania określonego agrofaga, oraz w przypadku próbek pochodzących z innego państwa członkowskiego: gdy pozytywny wynik uzyskuje się w drugim teście wykrywania zgodnie z lit. a) oraz pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych przeprowadzonych po poddaniu próbki izolacji selektywnej.

2. TESTY

2.1. Testy wykrywania

Testy wykrywania zapewniają spójne wykrywanie co najmniej 104 komórek/ml zawieszonego osadu.

Drugi test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych niż pierwszy test wykrywania.

Stosuje się następujące testy wykrywania:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) test FISH (van Beuningen et al. (1995) (

1

)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) izolacja zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych. Przeprowadza się jeden z dwóch poniższych wariantów:

(i) bezpośrednia izolacja na podłożach półselektywnych (lub nieselektywnych) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(ii) po wzbogaceniu w ramach testu biologicznego izolacja zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) konwencjonalny test PCR z użyciem starterów Pastrik (2000) (

2

)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond:

(i) Schaad et al. (1999) (

3

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(ii) Vreeburg et al. (2018) (

4

) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iii) Gudmestad et al. (2009) po dostosowaniu przez Vreeburg et al. (2018)4 zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iv) Massart et al. (2014) (

5

) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

2.2. Testy identyfikacyjne

Stosuje się następujące testy identyfikacyjne:

a) test immunofluorescencyjny zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) konwencjonalny test PCR (Pastrik (2000)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond:

(i) Schaad et al. (1999) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(ii) Vreeburg et al. (2018) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iii) Gudmestad et al. (2009) po dostosowaniu przez Vreeburg et al. (2018) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

(iv) Massart et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) barkodowanie DNA zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (

6

)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

3. SCHEMATY BLOKOWE PROCEDUR

Schemat blokowy nr 1: Procedura diagnostyczna dotycząca występowania określonego agrofaga w wykazujących objawy próbkach określonej rośliny

a

Izolacja może być stosowana jako pierwszy lub drugi test wykrywania. Jeśli podejrzewa się występowanie określonego agrofaga na podłożu, kolonie oczyszcza się w celu uzyskania czystych kultur, na których należy przeprowadzić dwa testy identyfikacyjne. W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

b

Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych.

Schemat blokowy nr 2: Procedura diagnostyczna dotycząca określonego agrofaga w niewykazujących objawów próbkach określonej rośliny

a

Nie stosuje się izolacji.

b

Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych. Nie stosuje się izolacji.

c

W przypadku próbek, o których mowa w pkt 1.3 lit. b), potwierdzenie występowania określonego agrofaga po drugim dodatnim teście wykrywania wymaga wyizolowania określonego agrofaga z próbki, a następnie przeprowadzenia dwóch dodatnich testów identyfikacyjnych.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.1. Próbki pochodzące z bulw niewykazujących objawów

Standardowa próbka zawiera 200 bulw na każdy test. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania fragmentów części przystolonowych w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.

4.2. Próbki pochodzące z niewykazującego objawów materiału roślinnego innego niż bulwy

Wykrywanie zakażeń utajonych przeprowadza się w próbkach zbiorczych złożonych z fragmentów łodygi. Procedurę można zastosować do maksymalnie 200 fragmentów łodygi pobranych z różnych roślin wchodzących w skład jednej próbki. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do odkażania i testowania fragmentów łodygi w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.3. Próbki pochodzące z określonych roślin wykazujących objawy

Fragmenty tkanki pobiera się aseptycznie z pierścienia wiązek przewodzących bulwy lub z wiązek przewodzących łodygi określonych roślin wykazujących objawy więdnięcia. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano szczegółowo właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania tych tkanek w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.