Załącznik I

1. Przeprowadzanie testów za pomocą zarodników

W celu wykrywania i identyfikacji wykorzystuje się zarodnie letnie i zarodniki przetrwalnikowe, które uzyskuje się z gleby po przesianiu lub bezpośrednio z materiału roślinnego.

2. Metody wykrywania

W celu ekstrakcji z gleby zarodników określonego agrofaga stosuje się jedną z następujących metod:

a) metoda przesiewania gleby opisana przez Pratt (1976) (

1

);

b) metoda przesiewania gleby opisana przez van Leeuwen et al. (2005) (

2

);

c) technika wirowania warstwowego do wysokowydajnego testowania próbek opisana przez Wandera et al. (2007) (

3

).

3. Metody identyfikacji

Wyekstrahowane zarodniki określonego agrofaga identyfikuje się jedną z następujących metod:

a) identyfikacja morfologiczna pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100–400x;

b) konwencjonalny PCR z zastosowaniem starterów według Lévesque et al. (2001) (

4

) oraz van den Boogert et al. (2005) (

5

);

c) PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów i sond według van Gent-Pelzer et al. (2010) (

6

);

d) PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów i sond według Smith et al. (2014) (

7

).

4. Żywotność zarodników przetrwalnikowych

Żywotność zarodników przetrwalnikowych można określić za pomocą badania mikroskopowego lub testu biologicznego. Żywotność zarodników można określić za pomocą badania mikroskopowego zarodni umieszczonych w laktofenolu lub w wodzie (Przetakiewicz 2015) (

8

). Zarodnie z ziarnistą zawartością lub z protoplazmą lekko oddzieloną od ściany można uznać za żywe. Te, które uległy trwałej plazmolizie lub nie zawierają widocznej zawartości, uznaje się za martwe.

Alternatywnie lub w przypadku wątpliwości można przeprowadzić test biologiczny zgodnie z opisem w załączniku IV pkt 3.

5. Określanie patotypów

Do określenia patotypów potrzebne są świeże narośla.

Inokulum do badania przygotowuje się, stosując jedną z poniższych metod:

a) metodę SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), składającą się z dwóch następujących etapów:

(i) wytworzenie inokulum

Starą (brązową) tkankę naroślową dzieli się na mniejsze kawałki i suszy na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż stanie się twarda. Twardą tkankę rozdrabnia się ręcznie albo mechanicznie.

Rozdrobniony materiał przesiewa się na sucho, zbierając frakcję od 25 do 75 μm, a następnie poddaje ekstrakcji metodą chloroformową według Pratt (1976)1;

(ii) wytworzenie świeżych narośli

Około 10 mg wyekstrahowanych zarodników przetrwalnikowych rozsypuje się na powierzchni 10 ml sterylnej wody destylowanej na małej plastikowej płytce Petriego i inkubuje w ciemności w temperaturze 20 °C do momentu kiełkowania.

Bulwy ziemniaka z małymi kiełkami o długości około 1–2 mm umieszcza się w przezroczystych plastikowych pojemnikach wyłożonych wilgotną bibułą, z zaznaczonymi kiełkami skierowanymi do góry. Kiełki otacza się roztopioną wazeliną za pomocą strzykawki. Pierścień powinien być szczelny i na tyle wysoki, aby zawiesina zarodników nie przeciekała.

10 ml kiełkujących zarodników przetrwalnikowych rozcieńcza się dodatkowo do 20 ml sterylną wodą i umieszcza w pierścieniach za pomocą pipety lub wyciskanej butelki, aż kiełek będzie całkowicie zanurzony w zawiesinie zarodników. Plastikowe pojemniki przykrywa się pokrywkami i inkubuje przez 4 dni w temperaturze 10 °C, po czym otwiera się je, usuwa inokulum i pierścienie wazelinowe, a pojemniki przenosi do zraszanej szklarni o temperaturze 15–18 °C (16 godzin światła);

b) metodę Spiekermanna i Kotthoffa (1924) (

9

);

c) metodę Potočka et al. (1991) (

10

);

d) metodę Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (

11

); Lemmerzahl 1930 (

12

); Noble i Glynne 1970 (

13

)).

W celu określenia wszystkich patotypów, o których wiadomo, że są istotne dla Unii (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) i 38(Nevșehir)), stosuje się test różnicujący na podstawie reakcji na zakażenie różnych odmian określonej rośliny, jak wskazano w tabeli. Test na zakażenie przeprowadza się zgodnie z protokołem wymienionym w lit. d) (metoda Glynne’a-Lemmerzahla).

Selektywna wrażliwość odmian ziemniaka w celu określania patotypów S. endobioticum

Odmiana uprawna

Patotypy S. endobioticum

1(D1)

2(G1)

6(O1)

18(T1)

38(Nevșehir)

Tomensa/Evora/Deodara

S

S

S

S

S

Irga/Producent

R

S

S

S

S

Talent

R

R*

R*

S

S

Saphir

R

S

R

R

S

Ikar/Gawin/Karolin/Belita

R

R

R

R

R

„S”: Podatne

„R”: Odporne

*: Wskazuje na słabą podatność odmiany na S. endobioticum („występowanie pól zarodników nieotoczonych nekrozą, bez tworzenia się narośli”).