Załącznik II

W załączniku do rozporządzenia (UE) nr 231/2012 po pozycji dotyczącej dodatku do żywności E 960a dodaje się pozycję w brzmieniu:

„E 960b(i) REBAUDIOZYD M Z FERMENTACJI WYTWARZANY PRZEZ YARROWIA LIPOLYTICA

Nazwy synonimowe

Definicja

Rebaudiozyd M z fermentacji wytwarzany przez Yarrowia lipolytica składa się z mieszaniny glikozydów stewiolowych, złożonej głównie z rebaudiozydu M, pewnej ilości rebaudiozydu D oraz mniejszych ilości rebaudiozydu A i rebaudiozydu B. Proces wytwarzania obejmuje dwa zasadnicze etapy. Pierwszy etap obejmuje fermentację prostego źródła cukru przy użyciu nietoksycznego niepatogenicznego szczepu Yarrowia lipolytica, który został genetycznie zmodyfikowany za pomocą genów heterologicznych, by spowodować nadekspresję genów, które są zaangażowane w syntezę glikozydów stewiolowych w celu uzyskania szczepu VRM (CBS 147477). Po usunięciu biomasy poprzez separację ciało stałe – ciecz i obróbkę cieplną następuje stężenie glikozydów stewiolowych. Drugi etap polega na oczyszczaniu przez zastosowanie chromatografii jonowymiennej, po której następuje krystalizacja glikozydów stewiolowych z etanolu, w wyniku czego powstaje produkt końcowy zawierający co najmniej 95 % rebaudiozydów M, D, A i B. Żywotne komórki i DNA szczepu VRM Yarrowia lipolytica nie mogą być wykrywalne w dodatku do żywności.

Nazwa chemiczna

Rebaudiozyd A: kwas 13-[(2-O-β-D-glukopiranozylo-3-O-β-D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozyl)oksy]kaur-16-en-18-oidowy, ester β-D-glukopiranozylowy

Rebaudiozyd B: kwas 13-[(2-O-β-D-glukopiranozylo-3-O-β–D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozyl)oksy]kaur-16-en-18-oidowy

Rebaudiozyd D: kwas 13-[(2-O-β-D-glukopiranozylo-3-O-β-D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozyl)oksy]kaur-16-en-18-oidowy, ester 2-O-β-D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozylowy

Rebaudiozyd M: kwas 13-[(2-O-β-D-glukopiranozylo-3-O-β-D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozyl)oksy]kaur-16-en-18-oidowy, ester 2-O-β-D-glukopiranozylo-3-O-β-D-glukopiranozylo-β-D-glukopiranozylowy

Wzór cząsteczkowy

Nazwa potoczna

Wzór

Współczynnik przeliczeniowy

Rebaudiozyd A

C44H70 O23

0,33

Rebaudiozyd B

C38H60 O18

0,40

Rebaudiozyd D

C50H80O28

0,29

Rebaudiozyd M

C56H90O33

0,25

Masa cząsteczkowa i nr CAS

Nazwa potoczna

Numer CAS

Masa cząsteczkowa (g/mol)

Rebaudiozyd A

58543-16-1

967,01

Rebaudiozyd B

58543-17-2

804,88

Rebaudiozyd D

63279-13-0

1 129,15

Rebaudiozyd M

1220616-44-3

1 291,30

Oznaczenie zawartości

Nie mniej niż 95 % rebaudiozydu M, rebaudiozydu D, rebaudiozydu A i rebaudiozydu B, w przeliczeniu na suchą masę.

Wielkość cząstek

Nie więcej niż 0,5 % cząstek o długości poniżej 300 nm (metodą STEM).

Opis

Proszek o barwie białej do jasnożółtej, około 200 do 350 razy słodszy od sacharozy (przy 5 % ekwiwalencji sacharozy).

Identyfikacja

Rozpuszczalność

Słabo rozpuszczalny w wodzie

pH

Między 4,5 a 7,0 (roztwór 1:100)

Czystość

Popiół całkowity

Nie więcej niż 1 %

Strata przy suszeniu

Nie więcej niż 6 % (105 °C, 2 godz.)

Pozostałości rozpuszczalników

Etanol – nie więcej niż 5 000 mg/kg

Kwas kaurenowy

Nie więcej niż 0,3 mg/kg (pomiar metodą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas)

Arsen

Nie więcej niż 0,01 mg/kg

Ołów

Nie więcej niż 0,01 mg/kg

Kadm

Nie więcej niż 0,01 mg/kg

Rtęć

Nie więcej niż 0,05 mg/kg

Kryteria mikrobiologiczne

Całkowita liczba drobnoustrojów (tlenowych)

Nie więcej niż 1 000 jtk/g

Drożdże i pleśń

Nie więcej niż 100 jtk/g

Escherichia coli

Wynik ujemny w 1 g

Salmonella spp.

Wynik ujemny w 25 g

Pozostałości białek

Nie więcej niż 20 mg/kg”