Rozporządzenie Komisji (WE) nr 761/2009 z dnia 23 lipca 2009 r. zmieniające, w celu dostosowania do postępu technicznego, rozporządzenie (WE) nr 440/2008 ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)

Załącznik III

W mocy

B.46.

DZIAŁANIE DRAŻNIĄCE NA SKÓRĘ IN VITRO: BADANIE NA MODELU ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO NASKÓRKA

1. METODA

1.1. WPROWADZENIE

Działanie drażniące na skórę oznacza powodowanie odwracalnego uszkodzenia skóry w wyniku nałożenia na skórę badanej substancji na okres do 4 godzin [zgodnie z definicją Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ)](1). Niniejsza metoda badania obejmuje procedurę in vitro, która — zależnie od potrzeb informacyjnych — może umożliwić ustalenie drażliwości substancji dla skóry na podstawie samodzielnego badania zastępczego w ramach strategii badawczej, zgodnie z podejściem uwzględniającym wartość naukową danych (2).

Ocena działania drażniącego na skórę obejmowała na ogół wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych (zob. metoda B.4)(3). Z uwagi na konieczność zapewnienia dobrostanu zwierząt opracowano metodę B.4, która pozwala na ustalenie działania żrącego/drażniącego na skórę dzięki zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych, przy użyciu zwalidowanych metod in vitro i ex vivo, co pozwala na uniknięcie zadawania bólu zwierzętom i powodowania ich cierpienia. Do części dotyczącej badań działania żrącego w ramach strategii badań sekwencyjnych B.4 przydatne są trzy zwalidowane metody badania (wytyczne do badań) in vitro B.40, B.40bis i TG 435 (4, 5, 6).

Niniejsza metoda badania opiera się na wykorzystaniu modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, które pod względem ogólnej struktury (zastosowanie keratynocytów naskórka pochodzenia ludzkiego jako źródła komórek, reprezentatywna tkanka i cytoarchitektura) imitują ściśle biochemiczne i fizjologiczne właściwości górnych części ludzkiej skóry, tj. naskórka. Procedura opisana w niniejszej metodzie badania pozwala na identyfikację zagrożeń powodowanych przez substancje drażniące zgodnie z kategorią 2 GHS ONZ. Niniejsza metoda badania obejmuje również zestaw norm efektywności do oceny podobnych i zmodyfikowanych metod badania z wykorzystaniem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka (7).

Przeprowadzono badania wstępne, optymalizacyjne i walidacyjne dwóch metod badania in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), dostępnych w handlu pod nazwami EpiSkin™ i EpiDerm™, wykorzystujących modele zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. Badania te przeprowadzono z udziałem substancji należących do kategorii R38. Niektóre aspekty ponownych obliczeń na potrzeby Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów znajdują się w pozycji 25 Literatury. Metody o porównywalnej wydajności z EpiDerm™ (zwalidowana metoda referencyjna 1), są zalecane jako samodzielne metody badania zastępujące badanie in vivo na królikach kwalifikujące do kategorii 2 według GHS, substancje drażniące. EpiDerm™ (zwalidowana metoda referencyjna 2) zaleca się do stosowania jedynie jako przesiewową metodę badania lub w ramach strategii badań sekwencyjnych, zgodnie z podejściem uwzględniającym wartość naukową danych, w celu zaklasyfikowania do kategorii 2 według GHS, substancje drażniące. Zanim będzie możliwe wykorzystanie proponowanego badania działania drażniącego na skórę in vitro na modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do celów regulacyjnych, należy ustalić jego wiarygodność, istotność (dokładność) i ograniczenia w zakresie dotyczącym jego proponowanego stosowania, aby zapewnić jego porównywalność ze zwalidowaną metodą referencyjną 1, zgodnie z normami efektywności określonymi w niniejszej metodzie badania (dodatek).

Dwie inne metody badania in vitro z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka zostały zwalidowane zgodnie z wymaganiami na podstawie niniejszej metody badania i dają podobne wyniki jak zwalidowana metoda referencyjna 1 (18). Są to zmodyfikowana metoda badania EpiDerm™ (zmodyfikowana metoda referencyjna 2) i metoda badania SkinEthic RHE™ (metoda naśladowcza 1).

1.2. DEFINICJE

W ramach niniejszej metody badania stosowane są następujące definicje:

Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badania a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badania i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem „zgodność” na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badania.

Substancja do kontroli serii: substancja wzorcowa powodująca średnią reakcję tkankową pod względem żywotności komórek.

Żywotność komórek: parametr określający całkowitą aktywność populacji komórek, np. zdolność dehydrogenaz w mitochondriach komórek do obniżenia zawartości przyżyciowego barwnika MTT (bromek 3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy), który, w zależności od mierzonego punktu końcowego i zastosowanego schematu badania, odpowiada całkowitej liczbie i/lub żywotności żywych komórek.

ET50

: czas ekspozycji potrzebny do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % po zastosowaniu markera w określonym, stałym stężeniu, zob. również IC50.

Odsetek wyników fałszywie ujemnych: Odsetek wszystkich obecnych substancji fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania jako nieobecne. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badania.

Odsetek wyników fałszywie dodatnich: odsetek wszystkich nieobecnych (nieaktywnych) substancji fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania jako obecne. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badania.

Dawka nieograniczona: ilość substancji badanej nakładana na skórę, przekraczająca ilość konieczną do całkowitego, jednolitego pokrycia jej powierzchni.

GHS (Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów): wprowadzony w UE na mocy rozporządzenia (WE) nr 1272/2008 system proponujący klasyfikację substancji i mieszanin według znormalizowanych rodzajów i poziomów zagrożeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawiający odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak piktogramy, hasła ostrzegawcze, zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia, zwroty wskazujące środki ostrożności i karty charakterystyki substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekazać informacje na temat ich działań niepożądanych w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewoźników, konsumentów i ratowników) i środowiska (1).

IC50

: stężenie, w którym marker powoduje zmniejszenie żywotności tkanek o 50 % (IC50) po stałym czasie ekspozycji, zob. również ET50.

Normy efektywności: normy oparte na zwalidowanej metodzie referencyjnej, zapewniające podstawę do oceny porównywalności proponowanej metody badania, która jest podobna do metody referencyjnej pod względem mechanistycznym i funkcjonalnym. Uwzględnia się I) istotne składowe metody badania; II) wykaz minimum substancji referencyjnych wybranych spośród substancji wykorzystywanych do wykazania dopuszczalnej efektywności zwalidowanej metody referencyjnej oraz III) oparte na wynikach uzyskanych w odniesieniu do zwalidowanej metody referencyjnej, porównywalne poziomy dokładności i wiarygodności, które powinna wykazać proponowana metoda badania w ocenie dokonywanej przy użyciu wykazu minimum substancji referencyjnych.

Wiarygodność: miary zakresu, w jakim metoda badania może zostać wykonana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami w czasie, w przypadku jej wykonywania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją poprzez obliczenie odtwarzalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej.

Czułość: odsetek wszystkich obecnych/aktywnych substancji prawidłowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dokładności metody badania, która daje wyniki kategoryczne, stanowiąca parametr istotny dla oceny istotności metody badania.

Swoistość: odsetek wszystkich nieobecnych/nieaktywnych substancji prawidłowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dokładności metody badania, która daje wyniki kategoryczne, stanowiąca parametr istotny dla oceny istotności metody badania.

Działanie drażniące na skórę: powodowanie odwracalnego uszkodzenia skóry w wyniku nałożenia na skórę badanej substancji na okres do 4 godzin. Działanie drażniące na skórę jest powstającą miejscowo, nieimmunogenną reakcją, która pojawia się wkrótce po stymulacji (24). Jego główną cechą jest odwracalny proces obejmujący reakcje zapalne oraz większość charakterystycznych objawów klinicznych podrażnienia (rumień, obrzęk, świąd i ból) związanych z procesem zapalnym.

1.3. ZAKRES I OGRANICZENIA

Ograniczeniem badań z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka objętych niniejszą metodą badania jest to, że pozwalają one jedynie na zaklasyfikowanie substancji jako drażniących dla skóry według kategorii 2 GHS ONZ. Ponieważ nie umożliwiają one zaklasyfikowania substancji do opcjonalnej kategorii 3 zdefiniowanej w GHS ONZ, wszystkie pozostałe substancje nie będą klasyfikowane (brak kategorii). Może zaistnieć konieczność weryfikacji niniejszej metody badania, w zależności od potrzeb regulacyjnych i ewentualnego uwzględnienia w przyszłości nowych punktów końcowych bądź też udoskonaleń metody lub opracowania nowych badań naśladowczych.

Niniejsza metoda badania umożliwia identyfikację zagrożeń stwarzanych przez drażniące substancje jednoskładnikowe (19), jednak nie zapewnia wystarczających informacji na temat działania żrącego na skórę. Nie można badać gazów i aerozoli, a w badaniu walidacyjnym nie oceniano jeszcze mieszanin.

1.4. ZASADA METODY BADANIA

Substancję badaną nakłada się miejscowo na trójwymiarowy model zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, składający się z prawidłowych keratynocytów naskórka pochodzących od człowieka, które poddano hodowli w celu uzyskania wielowarstwowego, wysoce zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka. Model ten składa się ze zorganizowanych warstw: podstawnej, kolczystej i ziarnistej oraz z wielopoziomowej warstwy rogowej zawierającej międzykomórkowe, blaszkowate warstwy lipidów ułożonych w struktury analogiczne do stwierdzanych in vivo.

Zasada badań z użyciem modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka opiera się na założeniu, że substancje drażniące wykazują zdolność do przenikania przez warstwę rogową na drodze dyfuzji i są cytotoksyczne dla komórek głębszych warstw. Żywotność komórek mierzy się na podstawie konwersji przez dehydrogenazę przyżyciowego barwnika MTT [bromek 3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy; numer EINECS 206–069–5, numer CAS 298–93–1)] w niebieską sól formazanową, którą oznacza się ilościowo po ekstrakcji z tkanek (20). Substancje drażniące identyfikuje się na podstawie ich zdolności do zmniejszenia żywotności komórek poniżej określonych wartości progowych (tj. ≤ 50 % dla substancji drażniących kategorii 2 GHS ONZ). Substancje, które prowadzą do zachowania żywotności komórek powyżej określonego poziomu progowego, nie będą klasyfikowane (tj. > 50 % — brak kategorii).

Systemy modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka mogą być stosowane do badania substancji stałych, płynnych, półstałych i wosków. Płyny mogą być wodne lub niewodne; substancje stałe mogą być rozpuszczalne w wodzie lub nie. W miarę możliwości substancje stałe powinny być badane w postaci drobnoziarnistego proszku. Ponieważ do badań walidacyjnych systemów modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka wykorzystano 58 starannie wybranych substancji chemicznych reprezentujących szeroki wachlarz ich klas, oczekuje się, że omawiane metody powinny zasadniczo być odpowiednie dla różnych klas substancji chemicznych (16). Badania walidacyjne objęły 13 substancji kategorii 2 GHS. Należy podkreślić, że badania walidacyjne nie objęły niektórych niekorodujących kwasów, zasad, soli i innych substancji nieorganicznych, oraz nie objęły, bądź objęły jedynie w ograniczonym stopniu niektóre znane klasy organicznych substancji drażniących takich jak wodoronadtlenki, fenole oraz substancje powierzchniowo czynne.

1.5. WYKAZANIE EFEKTYWNOŚCI

Przed rozpoczęciem rutynowego stosowania zwalidowanej metody zgodnej z niniejszą metodą badania laboratoria mogą chcieć wykazać jej efektywność techniczną z wykorzystaniem dziesięciu substancji chemicznych zaleconych w tabeli 1. Zgodnie z niniejszą metodą badania, opcjonalna kategoria 3 GHS ONZ jest uznawana za brak kategorii. W przypadku nowych podobnych (naśladowczych) metod badania opracowanych na podstawie niniejszej metody badania, podobnych strukturalnie i funkcjonalnie do zwalidowanych metod referencyjnych, lub w przypadku modyfikacji zwalidowanych metod należy zastosować normy efektywności opisane w dodatku do niniejszej metody badania, aby wykazać porównywalną wiarygodność i dokładność nowej metody badania przed jej zastosowaniem do badań regulacyjnych.

Tabela 1

Substancje do oceny efektywności, które stanowią podgrupę referencyjnych substancji wymienionych w dodatku

Substancja

Numer CAS

Ocena in vivo

Stan fizyczny

Kategoria GHS

Kwas naftylooctowy

86–87–3

Brak kat.

Izopropanol

67–63–0

0,3

Brak kat.

Stearynian metylu

112–61–8

Brak kat.

Maślan heptylu

5870–93–9

1,7

Opcjonalna kat. 3

Salicylan heksylu

6259–76–3

Opcjonalna kat. 3

Aldehyd cyklamenu

103–95–7

2,3

Kat. 2

1-bromoheksan

111–25–1

2,7

Kat. 2

Metakrylan butylu

97–88–1

Kat. 2

1-metylo-3-fenylo-1-piperazyna

5271–27–2

3,3

Kat. 2

Heptanal

111–71–7

Kat. 2

1.6. OPIS METODY

Poniżej przedstawiono opis składowych i procedur badania oceniającego działanie drażniące na skórę przy użyciu modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. Model zrekonstruowanego ludzkiego naskórka może zostać utworzony lub przygotowany samodzielnie bądź też uzyskany na rynku (np. EpiSkin™, EpiDerm™ i SkinEthic RHE™). Standardowe protokoły metod badania z użyciem modeli EpiSkin™, EpiDerm™ i SkinEthic RHE™ można uzyskać na stronie internetowej [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] (21, 22, 23). Badania należy wykonywać zgodnie z poniższymi zaleceniami:

1.6.1. Składowe modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka

1.6.1.1. Ogólne warunki modelu

Do tworzenia naskórka należy użyć prawidłowych ludzkich keratynocytów. Pod zachowującą funkcje życiowe warstwą rogową powinno znajdować się kilka warstw żywych komórek naskórka (warstwa podstawna, warstwa kolczysta, warstwa ziarnista). Warstwa rogowa powinna być wielopoziomowa i powinna zawierać lipidy niezbędne do utworzenia czynnościowej bariery na tyle wytrzymałej, aby uniemożliwiała szybkie przenikanie cytotoksycznych markerów, np. soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) lub markera Triton X-100. Funkcję bariery można ocenić albo poprzez ustalenie stężenia, w którym marker zmniejsza żywotność tkanek o 50 % (IC50) po ustalonym czasie ekspozycji, albo poprzez ustalenie czasu ekspozycji potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % (ET50) po zastosowaniu markera w określonym, stałym stężeniu. Właściwości izolacyjne modelu powinny zapobiegać przechodzeniu materiału przez warstwę rogową do żywej tkanki, gdyż w innym razie modelowanie ekspozycji skóry mogłoby być niewłaściwe. Model skóry nie powinien być skażony bakteriami, wirusami, mykoplazmami ani grzybami.

1.6.1.2. Funkcjonalne warunki modelu

1.6.1.2.1. Żywotność

Zalecaną próbą ustalenia wielkości żywotności jest MTT (20). Gęstość optyczna (OD) ekstrahowanego (rozpuszczonego) barwnika z tkanki potraktowanej kontrolą negatywną (NC) powinna być co najmniej 20 razy większa niż OD samego rozpuszczalnika do ekstrakcji. Należy udokumentować stabilność w hodowli (uzyskiwanie podobnych wyników pomiarów żywotności) tkanki potraktowanej NC w okresie ekspozycji testowej.

1.6.1.2.2. Funkcja bariery

Warstwa rogowa i wchodzące w jej skład lipidy powinny być na tyle odporne, aby nie było możliwe szybkie przenikanie przez nie cytotoksycznych markerów, np. SDS lub markera Triton X-100, według oceny na podstawie IC50 lub ET50.

1.6.1.2.3. Morfologia

Odpowiednio wykwalifikowany personel powinien przeprowadzić badanie histologiczne zrekonstruowanej skóry/zrekonstruowanego naskórka, z wykazaniem istnienia struktury przypominającej ludzką skórę/ludzki naskórek (w tym wielopoziomowej warstwy rogowej).

1.6.1.2.4. Odtwarzalność

Należy wykazać odtwarzalność w czasie wyników zastosowania metody wykorzystującej określony model, najlepiej z użyciem właściwej substancji (wzorcowej) do kontroli serii (zob. dodatek).

1.6.1.2.5. Kontrole jakości (QC) modelu

Każda seria stosowanego modelu naskórka powinna spełniać określone kryteria zwolnienia do produkcji, spośród których najistotniejsze są te dotyczące żywotności (pkt 1.6.1.2.1) i funkcji bariery (pkt 1.6.1.2.2). Zakres dopuszczalności (górna i dolna granica) IC50 lub ET50 powinien zostać ustalony przez dostawcę modelu skóry (lub badacza w przypadku stosowania modelu opracowanego wewnętrznie). Właściwości bariery cechujące tkanki powinny być sprawdzane przez laboratorium po otrzymaniu tkanek. Do wiarygodnego przewidywania skutków drażniących można przyjąć wyłącznie wyniki uzyskane z użyciem zakwalifikowanych tkanek. Poniżej przedstawiono przykładowe zakresy dopuszczalności zwalidowanych metod referencyjnych.

Tabela 2

Przykłady kryteriów zwolnienia serii na podstawie kontroli jakości

Dolna granica dopuszczalności

Średnia zakresu dopuszczalności

Górna granica dopuszczalności

Zwalidowana metoda referencyjna 1 (traktowanie SDS przez 18 godzin)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 2,32 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

Zwalidowana metoda referencyjna 2 (1 % Triton X100)

ET50 = 4,8 h

ET50 = 6,7 h

ET50 = 8,7 h

1.6.1.3. Nakładanie substancji badanej i kontrolnej

Konieczne jest zastosowanie dostatecznej liczby powtórzeń poddawania tkanek działaniu badanej substancji i prób kontrolnych (co najmniej trzy powtórzenia na serię badań). W przypadku płynnych i stałych substancji należy nałożyć na skórę dostateczną ilość substancji badanej, tak aby równomiernie pokrywała powierzchnię skóry, unikając jednak nakładania dawki nieograniczonej (zob. 1.2 Definicje), tj. należy użyć co najmniej 25 μl/cm2 lub 25 mg/cm2. W przypadku substancji stałych przed ich nałożeniem należy zwilżyć powierzchnię naskórka wodą dejonizowaną lub destylowaną, aby zapewnić dobry kontakt ze skórą. W miarę możliwości substancje stałe powinny być badane w postaci drobnoziarnistego proszku. Pod koniec okresu ekspozycji substancję badaną należy ostrożnie zmyć z powierzchni skóry buforem wodnym lub 0,9 % NaCl. Zależnie od stosowanego modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka okres ekspozycji może się wahać od 15 do 60 minut, a temperatura inkubacji może wynosić od 20 do 37 °C. Szczegółowe informacje określono w standardowych procedurach operacyjnych dotyczących trzech omawianych metod (21, 22, 23).

W każdym badaniu należy stosować równocześnie kontrolę negatywną (NC) i pozytywną (PC), aby wykazać, że żywotność (NC), funkcja bariery i ostateczna czułość tkankowa (PC) są zawarte w dopuszczalnym zakresie zdefiniowanym na podstawie danych historycznych. Jako substancji stanowiącej PC zaleca się użycie 5 % roztworu wodnego SDS. Zalecanymi substancjami stanowiącymi NC są woda lub sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS).

1.6.1.4. Pomiary żywotności komórek

Najważniejszym elementem procedury badania jest to, że pomiarów żywotności nie wykonuje się natychmiast po ekspozycji na badane substancje, ale po dostatecznie długim okresie inkubacji tkanek przemytych po tej ekspozycji, w świeżym podłożu. Ten okres pozwala zarówno na ustąpienie słabo drażniących działań, jak i na pojawienie się wyraźnych działań cytotoksycznych. W trakcie fazy optymalizacji badania (9, 10, 11, 12, 13) okazało się, że optymalny jest okres 42 godzin inkubacji tkanek po ekspozycji, w związku z czym został on wykorzystany do walidacji referencyjnych metod badania.

Próba konwersji MTT jest zwalidowaną metodą ilościową, którą należy wykorzystywać do pomiarów żywotności komórek. Można ją stosować do badań z użyciem trójwymiarowego wytworu tkankowego. Próbkę skóry umieszcza się w roztworze MTT o właściwym stężeniu (np. 0,3–1 mg/ml) na 3 godziny. Wytrącony niebieski produkt formazanowy ekstrahuje się następnie z tkanki przy użyciu rozpuszczalnika (np. izopropanol, kwaśny izopropanol) i mierzy się stężenie formazanu poprzez oznaczenie OD przy długości fali 570 nm, w paśmie maksimum ±30 nm.

Właściwości optyczne substancji badanej lub jej działanie chemiczne na MTT mogą wpływać na próbę, powodując zafałszowanie oceny żywotności (ponieważ substancja badana może uniemożliwiać lub odwracać oraz powodować powstawanie barwy). Może tak się zdarzyć w przypadku niecałkowitego usunięcia określonej substancji badanej ze skóry przez przemywanie lub gdy substancja ta przeniknie przez naskórek. Jeśli substancja badana oddziałuje bezpośrednio na MTT, jest naturalnie barwna lub staje się barwna w trakcie oddziaływania na tkankę, należy zastosować dodatkowe kontrole w celu wykrycia i skorygowania wpływu substancji badanej na technikę pomiaru żywotności. Szczegółowy opis sprawdzenia, czy nie dochodzi do bezpośredniej redukcji MTT, zawarty jest w protokole metody badania dotyczącym zwalidowanych metod referencyjnych (21, 22, 23). Nieswoista barwa (NSC) związana z tymi oddziaływaniami nie powinna przekraczać 30 % NC (do korekcji). Jeśli NSC > 30 %, uznaje się, że badanie nie nadaje się do oceny badanej substancji.

1.6.1.5. Kryteria dopuszczalności próby

W przypadku każdej próby z użyciem zwalidowanych serii (zob. pkt 1.6.1.2.5), tkanki traktowane NC powinny wykazywać OD odpowiednią do jakości tkanek poddanych wszystkim etapom wysyłki i odbioru oraz wszystkim procesom protokołu badania działania drażniącego. Wartości OD kontroli nie powinny być niższe niż dolne granice zdefiniowane na podstawie danych historycznych. Również tkanki traktowane PC, tj. 5 % wodnym roztworem SDS, powinny wykazywać czułość zachowaną przez tkanki i zdolność do reagowania na substancję drażniącą w warunkach każdej pojedynczej próby (np. żywotność ≤ 40 % w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 1 oraz ≤ 20 % w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 2). Należy zdefiniować powiązane i właściwe miary zmienności pomiędzy powtórzeniami tkankowymi (np. w przypadku stosowania odchyleń standardowych powinny być one < 18 %).

2. DANE

2.1. DANE

W przypadku każdej ekspozycji należy przedstawić w formie tabelarycznej, z uwzględnieniem w stosownych przypadkach danych z powtórzeń eksperymentu, dane z poszczególnych, powtarzalnych prób (np. dane dotyczące wartości OD i obliczonej procentowej żywotności komórek dla każdej badanej substancji, łącznie z klasyfikacją). Dodatkowo należy przedstawić średnie ± odchylenie standardowe z każdej próby. Powinny być przedstawione zaobserwowane interakcje z odczynnikiem MTT i z barwnymi substancjami badanymi w odniesieniu do każdej badanej substancji.

2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW

Wartości OD uzyskane dla każdej próbki badanej można wykorzystać do obliczenia procentowej żywotności w porównaniu do NC, której żywotność ustala się na 100 %. Należy wyraźnie zdefiniować i udokumentować wartość odcięcia procentowej żywotności komórek, odróżniającą drażniące substancje badane od niesklasyfikowanych substancji badanych, oraz procedury statystyczne stosowane do oceny wyników i identyfikacji substancji drażniących; należy również udowodnić, że są one właściwe. Poniżej podano wartości odcięcia do predykcji działania drażniącego, związane ze zwalidowanymi metodami referencyjnymi:

Substancję badaną uznaje się za drażniącą dla skóry zgodnie z kategorią 2 GHS ONZ:

(i) jeśli żywotność tkanki po ekspozycji i następującej po niej inkubacji jest mniejsza lub równa (≤) 50 %.

Substancję badaną uznaje się za niezakwalifikowaną do żadnej kategorii:

(ii) jeśli żywotność tkanki po ekspozycji i następującej po niej inkubacji jest większa niż (>) 50 %.

3. SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania zawierać powinno następujące informacje:

Substancje badane i kontrolne:

— nazwy chemiczne, np. nazwa IUPAC lub CAS oraz numer CAS, jeśli jest znany,

— czystość i skład substancji (w procentach wagowych),

— właściwości fizykochemiczne istotne dla prowadzenia badania (np. stan fizyczny, stabilność i lotność, pH, rozpuszczalność w wodzie, jeśli jest znana),

— w stosownych przypadkach, obróbka substancji badanych/kontrolnych przed badaniem (np. ogrzanie, zmielenie),

— warunki przechowywania.

Uzasadnienie dla zastosowanego modelu skóry i protokołu.

Warunki badania:

— zastosowany system komórkowy,

— informacje na temat kalibracji urządzenia pomiarowego i pasma, które wykorzystano do pomiaru żywotności komórek (np. spektrofotometru),

— pełne informacje podstawowe na temat stosowanego modelu skóry, z uwzględnieniem jego efektywności, w tym w szczególności następujące dane:

(i) żywotność;

(ii) funkcja bariery;

(iii) morfologia;

(iv) odtwarzalność i predykcyjność;

(v) kontrole jakości (QC) modelu,

— szczegółowe dane na temat zastosowanej procedury badania,

— zastosowane badane dawki, czas trwania ekspozycji i okresu inkubacji po ekspozycji,

— opis wszelkich modyfikacji procedury badania,

— odwołanie do danych historycznych modelu. Powinno to w szczególności obejmować:

(i) dopuszczalność danych QC z odwołaniem do danych dotyczących serii historycznych;

(ii) dopuszczalność wartości kontroli pozytywnych i negatywnych, z określeniem pozytywnych i negatywnych średnich oraz zakresów kontroli,

— opis stosowanych kryteriów oceny, z uzasadnieniem wyboru punktu(-ów) odcięcia w modelu predykcyjnym.

Wyniki:

— tabelaryczne zestawienie danych dotyczących pojedynczych badanych próbek,

— opis innych zaobserwowanych skutków.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4. LITERATURA

(1) Organizacja Narodów Zjednoczonych (ONZ) (2007). Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie drugie zmienione, ONZ, Nowy Jork i Genewa 2007. Dostępne na stronie internetowej: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html.

(2) REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Dostępne na stronie internetowej: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649.

(3) Test Method B.4. ACUTE TOXICITY; DERMAL IRRITATION/CORROSION.

(4) Test Method B.40. IN VITRO SKIN CORROSION: TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST TER.

(5) Test Method B.40 BIS. IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST.

(6) OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Przyjęte 19 lipca 2006 r. Dostępne na stronie internetowej: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html.

(7) ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

(8) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57–93.

(9) Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765–770.

(10) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107–114.

(11) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351–367.

(12) Cotovio, J., Grandidier, M.–H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329–249.

(13) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, 109–129.

(14) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601.

(15) Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 s. + załączniki. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

(16) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619.

(17) J. Cotovio, M.–H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol. 14, 351–358.

(18) ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays z dnia 5 listopada 2008 r.

(19) WE (2006). Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) i utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE.

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 396 z 30.12.2006, s. 1. OPOCE, Luksemburg.

(20) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63.

(21) EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

(22) EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

(23) SkinEthic RHE™ SOP. Tekst będzie dostępny pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

(24) Harvell, J.D., Lammintausta, K., Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, s. 7–18.

(25) Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13 listopada 2008 r.

Dodatek

Ocena charakterystyki efektywności proponowanych modeli in vitro zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do badania działania drażniącego na skórę

WPROWADZENIE

Procedury proponowane do stosowania zgodnie z niniejszą metodą badania należy ocenić w celu ustalenia ich wiarygodności i dokładności, przy użyciu substancji reprezentujących pełny zakres wskaźników podrażnienia wg Draize’a. W ocenie z użyciem 20 zalecanych referencyjnych substancji (tabela 2) proponowana procedura powinna mieć wartość wiarygodności i dokładności porównywalną do wykazywanych przez zwalidowaną metodę referencyjną 1 (tabela 3) (1). Normy dokładności i wiarygodności, które powinny zostać osiągnięte, zostały przedstawione poniżej w pkt II i III. Uwzględniono tu substancje niesklasyfikowane i sklasyfikowane (według kategorii 2 GHS ONZ), reprezentujące istotne klasy substancji chemicznych, tak aby wiarygodność i wydajność (czułość, swoistość, odsetki wyników fałszywie ujemnych, odsetki wyników fałszywie dodatnich i dokładność) proponowanej metody badania można było porównać do tych cechujących zwalidowaną metodę referencyjną 1. Przed zastosowaniem metody badania do badań nowych substancji należy określić jej wiarygodność, a także zdolność do prawidłowej identyfikacji substancji drażniących należących do kategorii 2 GHS ONZ.

NORMY EFEKTYWNOŚCI

Normy efektywności obejmują następujące trzy elementy: I) istotne składowe metody badania, II) referencyjne substancje oraz III) zdefiniowane wartości dokładności i wiarygodności (2). Te normy efektywności są oparte na normach efektywności określonych po zakończeniu badania walidacyjnego ECVAM dotyczącego oceny działania drażniącego na skórę (3).

I) Istotne składowe metody badania

Ogólne warunki modelu

Funkcjonalne warunki modelu

Żywotność

Zalecaną próbą ustalenia wielkości żywotności jest MTT (4). Gęstość optyczna OD ekstrahowanego (rozpuszczonego) barwnika z tkanki potraktowanej NC powinna być co najmniej 20 razy większa niż OD samego rozpuszczalnika do ekstrakcji. Należy udokumentować stabilność w hodowli (uzyskiwanie podobnych wyników pomiarów żywotności) tkanki potraktowanej NC w okresie ekspozycji testowej.

Funkcja bariery

Morfologia

Odtwarzalność

Należy wykazać odtwarzalność w czasie wyników zastosowania metody wykorzystującej określony model, najlepiej z użyciem właściwej substancji (wzorcowej) do kontroli serii (zob. definicje w sekcji 1.2).

Kontrole jakości (QC) modelu

Każda seria stosowanego modelu naskórka powinna spełniać określone kryteria zwolnienia do produkcji, spośród których najistotniejsze są te dotyczące żywotności i funkcji bariery. Zakres dopuszczalności (górna i dolna granica) IC50 lub ET50 powinien zostać ustalony przez dostawcę modelu skóry (lub badacza w przypadku stosowania modelu opracowanego wewnętrznie). Właściwości bariery cechujące tkanki powinny być sprawdzane przez laboratorium po otrzymaniu tkanek. Do wiarygodnego przewidywania skutków drażniących można przyjąć wyłącznie wyniki uzyskane z użyciem zakwalifikowanych tkanek. Poniżej przedstawiono przykładowe zakresy dopuszczalności zwalidowanych metod referencyjnych.

Tabela 1

Przykłady kryteriów zwolnienia serii na podstawie kontroli jakości

Dolna granica dopuszczalności

Średnia zakresu dopuszczalności

Górna granica dopuszczalności

Zwalidowana metoda referencyjna 1 (traktowanie SDS przez 18 godzin)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 2,32 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

Zwalidowana metoda referencyjna 2 (1 % Triton X100)

ET50 = 4,8 h

ET50 = 6,7 h

ET50 = 8,7 h

II) Referencyjne substancje

Referencyjne substancje są wykorzystywane do ustalenia, czy wiarygodność i dokładność proponowanej nowej metody badania in vitro zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, o udowodnionym dostatecznym podobieństwie strukturalnym i funkcjonalnym do zwalidowanych metod referencyjnych lub stanowiącej niewielką modyfikację zwalidowanej metody referencyjnej, wskazują na porównywalną efektywność tej metody z zatwierdzoną metodą referencyjną 1 (1). Do 20 referencyjnych substancji wymienionych w tabeli 2 należą substancje reprezentujące różne istotne klasy chemiczne, jak również substancje z kategorii 2 GHS ONZ. Wymienione substancje obejmują 10 substancji kategorii 2 GHS ONZ, 3 substancje opcjonalnej kategorii 3 GHS ONZ i 7 niesklasyfikowanych substancji. Zgodnie z niniejszą metodą badania opcjonalna kategoria 3 jest uznawana za brak kategorii. Te referencyjne substancje odpowiadają minimalnej liczbie substancji, które należy wykorzystać do oceny dokładności i wiarygodności proponowanej metody badania działania drażniącego na skórę z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. W sytuacjach, w których wymieniona substancja nie jest dostępna, można wykorzystać inne substancje, w odniesieniu do których są dostępne właściwe dane referencyjne z badań in vivo. W razie potrzeby wykaz minimum substancji referencyjnych można uzupełnić o dodatkowe substancje, reprezentujące inne klasy chemiczne, w odniesieniu do których są dostępne dostateczne dane referencyjne z badań in vivo, aby dodatkowo ocenić dokładność proponowanej metody badania.

Tabela 2

Referencyjne substancje wykorzystywane do ustalenia dokładności i wiarygodności modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do badań działania drażniącego na skórę

Substancja (*1)

Nr CAS

Nr EINECS

Stan fizyczny

Ocena in vivo

Kat. GHS in vitro

Kat. GHS in vivo

1-bromo-4-chlorobutan

6940–78–9

230–089–3

Kat. 2

Brak kat.

Ftalan dietylu

84–66–2

201–550–6

Brak kat.

Kwas naftylooctowy

86–87–3

201–705–8

Brak kat.

2-propenylo fenoksyoctan

7493–74–5

231–335–2

0,3

Brak kat.

Izopropanol

67–63–0

200–661–7

0,3

Brak kat.

Aldehyd 4-metylo-tio-benzoesowy

3446–89–7

222–365–7

Kat. 2

Brak kat.

Stearynian metylu

112–61–8

203–990–4

Brak kat.

Maślan heptylu

5870–93–9

227–526–5

1,7

Brak kat.

Opcjonalna kat. 3

Salicylan heksylu

6259–76–3

228–408–6

Brak kat.

Opcjonalna kat. 3

Fosforan triizobutylu

126–71–6

204–798–3

Kat. 2

Opcjonalna kat. 3

1-dekanol

112–30–1

203–956–9

2,3

Kat. 2

Aldehyd cyklamenu

103–95–7

203–161–7

2,3

Kat. 2

1-bromoheksan

111–25–1

203–850–2

2,7

Kat. 2

Chlorowodorek 2-chlorometylo-3,5-dimetylo-4-metoksypirydyny

86604–75–3

434–680–9

2,7

Kat. 2

a-terpineol

98–55–5

202–680–6

2,7

Kat. 2

Disiarczek di-n-propylu

629–19–6

211–079–8

Brak kat.

Kat. 2

Metakrylan butylu

97–88–1

202–615–1

Kat. 2

Benzenotiol, 5–(1,1-dimetyloetylo)-2-metylu

7340–90–1

438–520–9

3,3

Kat. 2

1-metylo-3-fenylo-1-piperazyna

5271–27–2

431–180–2

3,3

Kat. 2

Heptanal

111–71–7

203–898–4

Kat. 2

Substancje wymienione w tabeli 2 stanowią reprezentatywny wybór spośród 58 substancji użytych w międzynarodowym badaniu walidacyjnym ECVAM dotyczącym oceny działania drażniącego na skórę (1). Ich wyboru dokonano na podstawie następujących kryteriów:

— wymienione substancje są dostępne w handlu,

— są reprezentatywne dla pełnego zakresu wskaźników podrażnienia wg Draize’a (od niedrażniących do silnie drażniących),

— mają określoną budowę chemiczną,

— są reprezentatywne dla odtwarzalności i zdolności predykcyjnej zwalidowanej metody, ustalonych w badaniu walidacyjnym wykonanym przez ECVAM,

— są reprezentatywne dla funkcjonalności chemicznej wykorzystywanej w procesie walidacji,

— nie wykazują bardzo wysoce toksycznych właściwości (np. nie są rakotwórcze ani toksyczne dla układu rozrodczego) i nie wiążą się z nadmiernymi kosztami usuwania pozostałości.

III) Zdefiniowane wartości dokładności i wiarygodności

Wydajność (czułość, swoistość, odsetek wyników fałszywie ujemnych, odsetek wyników fałszywie dodatnich i dokładność) proponowanej metody badania powinna być porównywalna z odpowiednimi wartościami w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 1 (tabela 3), tj. czułość powinna być większa lub równa (≥) 80 %, swoistość powinna być większa lub równa (≥) 70 %, a dokładność powinna być większa lub równa (≥) 75 %. Wydajność należy obliczyć z uwzględnieniem wszystkich uzyskanych klasyfikacji 20 substancji w uczestniczących laboratoriach. Klasyfikację każdej substancji w każdym laboratorium należy uzyskać na podstawie średniej wartości żywotności w trakcie wykonanych poszczególnych serii badań (minimum trzy ważne serie).

Tabela 3

Wydajność zwalidowanej metody referencyjnej 1 (1)

Metoda badania

Liczba substancji

Czułość

Swoistość

Odsetek wyników fałszywie ujemnych

Odsetek wyników fałszywie dodatnich

Dokładność

Zwalidowana metoda referencyjna 1 (2)

87,2 % (3)

71,1 % (4)

12,8 %

29,9 %

74,7 %

Zwalidowana metoda referencyjna 1 (2)

90 %

73,3 %

10 %

26,7 %

81,7 %

Wiarygodność proponowanej metody badania powinna być porównywalna z wiarygodnością zwalidowanych metod referencyjnych.

Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna

Ocena odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej powinna wykazywać zgodność klasyfikacji (kategoria 2/brak kategorii) uzyskanej w różnych, niezależnych seriach badań 20 referencyjnych substancji w pojedynczym laboratorium większą lub równą (≥) 90 %.

Odtwarzalność międzylaboratoryjna

Ocena odtwarzalności międzylaboratoryjnej nie jest niezbędna, jeśli proponowana metoda badania ma być stosowana tylko w jednym laboratorium. Aby można było przenosić metody pomiędzy laboratoriami, zgodność klasyfikacji (kategoria 2/brak kategorii) uzyskanej w różnych, niezależnych seriach badań 20 referencyjnych substancji pomiędzy, najkorzystniej, minimalnie trzema laboratoriami powinna być większa lub równa (≥) 80 %.

LITERATURA

(1) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601.

(2) OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paryż.

(3) ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Strona ostatnio sprawdzona w dniu 27.10.2008 r.

(4) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63.

(5) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619.

(*1) 20 referencyjnych substancji stanowi reprezentatywny wybór spośród 58 substancji, które zostały pierwotnie użyte do zwalidowania metody referencyjnej 1 (EpiSkin™). Dostępny jest pełny wykaz substancji badanych i kryteriów ich wyboru (5).

(1) W tabeli 3 podano wydajność określającą zdolność zwalidowanej metody referencyjnej 1 do prawidłowego zidentyfikowania substancji drażniących (kategoria 2 GHS ONZ) i niesklasyfikowanych substancji (brak kategorii, w tym opcjonalna kategoria 3) odpowiednio w odniesieniu do 58 i 20 referencyjnych substancji (tabela 2).

(2) EpiSkin™.

(3) Badanie z uwzględnieniem 13 substancji drażniących kategorii 2 GHS.

(4) Badanie z uwzględnieniem 45 substancji drażniących kategorii 3 GHS lub substancji niesklasyfikowanych.

Tekst urzędowy w EUR-Lex. Lexeva pokazuje treść przepisu, nie udziela porad prawnych. Moc prawną ma wyłącznie tekst opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.