Załącznik IV

C.3.

BADANIE INHIBICJI WZROSTU SŁODKOWODNYCH GLONÓW I CYJANOBAKTERII

1. METODA

Niniejsza metoda odpowiada OECD TG 201 (2006) (1).

1.1. WSTĘP

Metody badawcze są okresowo przeglądane i aktualizowane w świetle postępu naukowego. Metoda badawcza C.3 wymagała korekty, tak by objąć dodatkowe gatunki i spełnić wymagania w zakresie oceny zagrożenia oraz klasyfikacji substancji chemicznych. Korekty dokonano na podstawie szerokich doświadczeń praktycznych, postępu naukowego w dziedzinie badań nad toksycznością glonów oraz rozległego zastosowania regulacyjnego, które nastąpiło od czasu pierwotnego przyjęcia.

1.2. DEFINICJE

Do celów niniejszej metody użyto następujących definicji i skrótów:

Biomasa: jest to ciężar suchej materii żywej obecnej w populacji, wyrażony na objętość; np. mg glonów/litr badanego roztworu. Zwykle „biomasę” określa się w postaci masy, lecz w niniejszym badaniu słowo to użyte jest w odniesieniu do masy przypadającej na objętość. Ponadto w niniejszym badaniu zwykle mierzy się również surogaty biomasy, takie jak liczba komórek, fluorescencja, itp. i przez to określenie „biomasa” odnosi się także do tych surogatowych miar.

Współczynnik zmienności: jest bezwymiarową miarą zmienności parametru, określoną jako stosunek odchylenia standardowego do średniej. Może on również być wyrażony jako wartość procentowa. Średni współczynnik zmienności średniej właściwej szybkości wzrostu w replikatowych kulturach kontrolnych należy obliczyć w następujący sposób:

1. Obliczyć % CV (współczynnik zmienności) średniej właściwej szybkości wzrostu z szybkości wzrostu dla odnośnego replikatu.

2. Obliczyć wartość średnią ze wszystkich wartości obliczonych w punkcie 1, otrzymując średni współczynnik zmienności właściwej szybkości wzrostu dla poszczególnych dni/odcinków w replikatowych kulturach kontrolnych.

ECx

: jest stężeniem substancji testowej rozpuszczonej w pożywce, powodującym zmniejszenie wzrostu badanego organizmu o x % (np. 50 %) w danym okresie ekspozycji (który należy wyraźnie podać, jeśli odbiega od pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby w sposób jednoznaczny oznaczyć wartość EC otrzymaną z szybkości wzrostu lub z uzysku, używa się symboli, odpowiednio, „ErC” i „EyC”.

Pożywka wzrostowa: jest to kompletne syntetyczne podłoże hodowlane, w którym wzrastają glony, gdy są wystawione na działanie substancji testowej. Substancja testowa zwykle jest rozpuszczona w pożywce.

Szybkość wzrostu (średnia właściwa szybkość wzrostu): jest to logarytmiczny wzrost biomasy w ciągu okresu ekspozycji.

Najmniejszy obserwowany poziom stężenia (LOEC): jest to najniższe badane stężenie, przy którym zostaje zaobserwowane, że substancja ma statystycznie istotny redukujący wpływ na wzrost (przy p < 0,05) w porównaniu do kultury kontrolnej, w danym okresie ekspozycji. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą mieć szkodliwy wpływ równy lub większy niż te, które są obserwowane przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, należy podać pełne wyjaśnienie, w jaki sposób LOEC (a stąd NOEC) zostało wybrane.

Nieobserwowany wpływ stężenia (NOEC): jest to stężenie bezpośrednio poniżej LOEC.

Zmienna odpowiedzi: jest to zmienna dla oszacowania toksyczności uzyskana z dowolnych zmierzonych parametrów opisujących biomasę za pomocą różnych metod obliczania. W przypadku niniejszej metody szybkości wzrostu i uzysk są zmiennymi odpowiedzi uzyskanymi z pomiaru biomasy bezpośrednio lub pomiaru dowolnego ze wspomnianych surogatów.

Właściwa szybkość wzrostu: jest to zmienna odpowiedzi określona jako iloraz różnicy logarytmów naturalnych parametru obserwacji (w niniejszej metodzie badawczej — biomasy) przez odpowiedni okres.

Uzysk: jest to wartość zmiennej pomiarowej na końcu okresu ekspozycji minus wartość zmiennej pomiarowej na początku okresu ekspozycji, wyrażająca przyrost biomasy w ciągu badania.

1.3. STOSOWALNOŚĆ BADANIA

Niniejszą metodę badawczą najłatwiej stosuje się do substancji rozpuszczalnych w wodzie, które — w warunkach badania — prawdopodobnie pozostaną w wodzie. Dla badania substancji lotnych, silnie adsorbujących, zabarwionych lub mających niską rozpuszczalność w wodzie, bądź substancji, które mogą wpływać na dostępność składników pokarmowych lub minerałów w pożywce, mogą być wymagane pewne modyfikacje opisywanej procedury (np. układ zamknięty, specjalne przygotowanie naczyń testowych). Wskazówki dotyczące niektórych stosownych modyfikacji podano w (2), (3) i (4).

1.4. ZASADA BADANIA

Celem niniejszego badania jest określenie wpływu danej substancji na wzrost słodkowodnych mikroglonów i/lub cyjanobakterii. Wykładniczo wzrastające badane organizmy wystawia się na działanie substancji testowej w hodowlach statycznych na okres wynoszący zwykle 72 godziny. Pomimo stosunkowo krótkiego czasu trwania badania, skutki można ocenić na przestrzeni kilku pokoleń.

Odpowiedź układu polega na ograniczeniu wzrostu w szeregu kultur glonów (badanych jednostek) wystawionych na działanie różnych stężeń substancji testowej. Odpowiedź ocenia się w funkcji stężenia w stosunku do średniego wzrostu replikatu, kultur kontrolnych niepoddawanych ekspozycji. Dla pełnego wyrażenia odpowiedzi układu na toksyczne oddziaływania (optymalnej czułości), kulturom umożliwia się nieograniczony wykładniczy wzrost w dostatecznych warunkach odżywczych i przy stałym świetle przez wystarczający czas, aby zmierzyć zmniejszenie właściwej szybkości wzrostu.

Wzrost i inhibicję wzrostu określa się ilościowo poprzez pomiary biomasy glonów w funkcji czasu. Biomasę glonów określa się jako ciężar masy suchej przypadający na objętość, np. mg glonów/litr roztworu testowego. Jednakże ciężar masy suchej jest trudny do zmierzenia i dlatego używa się parametrów zastępczych. Spośród tych surogatów najczęściej używa się liczby komórek. Do innych zastępczych parametrów należy objętość komórek, fluorescencja, gęstość optyczna itp. Należy znać współczynnik przeliczenia pomiędzy mierzonym parametrem zastępczym a biomasą.

Punktem końcowym badania jest inhibicja wzrostu wyrażona jako logarytmiczny przyrost biomasy (średnia właściwa szybkość wzrostu) w ciągu okresu ekspozycji. Ze średnich właściwych szybkości wzrostu zarejestrowanych w serii roztworów testowych wyznacza się stężenie powodujące inhibicję wzrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się jako ErCx (np. ErC50).

Do celów stosowania tej metody w ramach unijnego prawodawstwa, z powodów opisanych w pkt 2.2 poniżej, obliczanie wyników powinno opierać się na średniej właściwej szybkości wzrostu. Dodatkową zmienną odpowiedzi użytą w niniejszej metodzie badawczej jest uzysk, który może być wymagany do spełnienia określonych wymogów regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on określony jako biomasa na końcu okresu ekspozycji minus biomasa na początku okresu ekspozycji. Z uzysku zarejestrowanego w serii roztworów testowych oblicza się stężenie powodujące inhibicję uzysku o określone x % (np. 50 %) i wyraża się jako EyCx (np. EyC50).

Ponadto, można statystycznie wyznaczyć najmniejszy obserwowany poziom stężenia (LOEC) oraz nieobserwowany wpływ stężenia (NOEC).

1.5. INFORMACJE O SUBSTANCJI TESTOWEJ

Informacje o substancji testowej, które mogą być przydatne przy ustalaniu warunków badania, obejmują wzór strukturalny, czystość, trwałość w warunkach badania, własności pochłaniania światła, pKa oraz wyniki badań przemiany, w tym podatności na rozkład biologiczny w wodzie.

Należy znać rozpuszczalność w wodzie, współczynnik podziału oktanol/woda (Pow) oraz ciśnienie pary substancji testowej i powinna być dostępna potwierdzona metoda kwantyfikacji substancji w roztworach testowych z podaną wydajnością odzysku i granicą wykrywalności.

1.6. SUBSTANCJA ODNIESIENIA

Jako sposób sprawdzenia procedury badania, można zbadać substancję(-e) odniesienia, taką jak 3,5-dichlorofenol stosowany w międzynarodowej próbie pierścieniowej (4). Jako substancji odniesienia dla zielenic można również użyć dwuchromianu potasowego. Pożądane jest zbadanie substancji odniesienia co najmniej dwa razy w roku.

1.7. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne muszą być spełnione następujące kryteria wykonania:

— Biomasa w kulturach kontrolnych powinna wzrosnąć wykładniczo o czynnik wynoszący co najmniej 16 w ciągu 72-godzinnego okresu badania. Odpowiada to właściwej szybkości wzrostu wynoszącej 0,92 dzień–1. Dla najczęściej używanych gatunków, szybkość wzrostu jest zazwyczaj znacznie wyższa (zob. dodatek 1). Kryterium to może nie być spełnione, gdy użyty jest gatunek, który wzrasta wolniej niż wymienione w dodatku 1. W takim przypadku okres badania można przedłużyć, tak aby uzyskać co najmniej 16-krotny wzrost w kulturach kontrolnych, przy czym wzrost musi być wykładniczy w ciągu całego okresu badania. Okres badania można skrócić do co najmniej 48 godz., aby utrzymać nieograniczony wykładniczy wzrost w ciągu badania, o ile osiągnięta zostanie krotność wynosząca minimum 16.

— Średni współczynnik zmienności dla właściwych szybkości wzrostu według poszczególnych odcinków (dni 0–1, 1–2 i 2–3, dla 72-godzinnych badań) w kulturach kontrolnych (zob. sekcja 1.2 pod hasłem „współczynnik zmienności”) nie może przekraczać 35 %. Obliczanie właściwej szybkości wzrostu według poszczególnych odcinków podano w akapicie drugim sekcji 2.2.1. Kryterium to stosuje się do średniej wartości współczynników zmienności obliczonej dla replikatowych kultur kontrolnych.

— Współczynnik zmienności średnich właściwych szybkości wzrostu w ciągu całego okresu badania w replikatowych kulturach kontrolnych nie może przekroczyć 7 % w badaniach z udziałem Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus

subspicatus. Dla innych, rzadziej badanych gatunków, wartość ta nie powinna przekraczać 10 %.

1.8. OPIS METODY

1.8.1. Aparatura

Użyte do badania naczynia oraz inne urządzenia, które będą się stykać z roztworami testowymi, powinny być wykonane w całości ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Sprzęt należy gruntownie umyć w celu zapewnienia, że jakiekolwiek zanieczyszczenia organiczne lub nieorganicznie nie będą zakłócać wzrostu glonów ani składu roztworów testowych.

Naczyniami używanymi do badania są zwykle kolby szklane o wymiarach pozwalających na uzyskanie dostatecznej objętości kultur do pomiarów podczas badania oraz należyte przenikanie masy CO2 z atmosfery (zob. akapit drugi w sekcji 1.8.9). Należy zwrócić uwagę, że objętość cieczy musi być wystarczająca dla oznaczeń analitycznych (zob. akapit piąty w sekcji 1.8.11).

Ponadto wymagane będą niektóre lub wszystkie spośród następujących urządzeń:

— Urządzenia do hodowli kultur: zalecana jest kabina lub komora, w której wybrana temperatura inkubacji może być utrzymywana w granicach ±2 °C.

— Przyrządy do pomiaru światła: należy zwrócić uwagę, że na mierzoną wartość będzie mieć wpływ metoda pomiaru natężenia światła, w szczególności typ receptora (kolektora). Pomiary należy wykonywać najlepiej przy użyciu receptora sferycznego (4 π) (który reaguje na bezpośrednie i odbite światło ze wszystkich kątów powyżej i poniżej płaszczyzny pomiaru) lub receptora 2 π (który reaguje na światło ze wszystkich kątów powyżej płaszczyzny pomiaru).

— Aparatura do określania biomasy glonów. Liczbę komórek, która jest najczęściej stosowanym parametrem zastępczym dla biomasy glonów, można wyznaczyć za pomocą elektronicznego licznika cząstek, mikroskopu z komorą do liczenia oraz cytometru przepływowego. Inne surogaty biomasy można mierzyć przy pomocy cytometru, fluorymetru, spektrofotometru lub kolorymetru. Pomocny w obliczeniu jest współczynnik przeliczeniowy wiążący liczbę komórek z ciężarem masy suchej. Aby zapewnić użyteczne pomiary przy niskich stężeniach biomasy, gdy używa się spektrofotometru, może być niezbędne użycie kuwet o długości ścieżki światła co najmniej 4 cm.

1.8.2. Badane organizmy

Można użyć kilku gatunków nieprzyłączonych mikroglonów i cyjanobakterii. Wykazano, że gdy stosuje się procedurę badania określoną w niniejszej metodzie badawczej, to odpowiednie są szczepy wymienione w dodatku 1.

Jeżeli użyte są inne gatunki, to należy podać szczep i/lub pochodzenie. Należy potwierdzić, że można utrzymać wykładniczy wzrost wybranych do badania glonów w ciągu całego okresu badania w panujących warunkach.

1.8.3. Pożywka wzrostowa

Zaleca się dwie alternatywne pożywki wzrostowe, pożywkę OECD i pożywkę AAP. Składy tych pożywek przedstawiono w dodatku 2. Należy zwrócić uwagę, że wartość pH i zdolność buforująca (regulowanie wzrostu pH) tych dwu pożywek są różne. Dlatego wyniki badań mogą być różne, w zależności od użytej pożywki, zwłaszcza gdy badane są substancje jonizujące się.

Do niektórych celów, np. gdy bada się metale i czynniki chelatujące lub gdy wykonuje się badanie przy różnych wartościach pH, może być konieczna modyfikacja pożywki wzrostowej. Użycie zmodyfikowanej pożywki należy szczegółowo opisać i uzasadnić (3)(4).

1.8.4. Stężenie początkowej biomasy

Początkowa biomasa w badanych kulturach musi być taka sama i dostatecznie mała, aby umożliwić wykładniczy wzrost w ciągu całego okresu inkubacji bez ryzyka wyczerpania składnika pokarmowego. Początkowa biomasa nie może przekraczać 0,5 mg/l w przeliczeniu na masę suchą. Zalecane są następujące początkowe skupienia komórek:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103–104

komórek/ml

Desmodesmus subspicatus

2–5 × 103

komórek/ml

Navicula pelliculosa

104

komórek/ml

Anabaena flos-aquae

104

komórek/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104–105

komórek/ml

1.8.5. Stężenia substancji testowej

Zakres stężenia, w którym mogą wystąpić wpływy, można wyznaczyć na podstawie wyników prób określania zakresu. Dla końcowego definitywnego badania należy wybrać co najmniej pięć stężeń uporządkowanych w szereg geometryczny o współczynniku nieprzekraczającym 3,2. Dla substancji wykazujących płaską krzywą odpowiedzi stężenia może być uzasadniony większy współczynnik. Szereg stężeń powinien najlepiej obejmować zakres powodujący inhibicję szybkości wzrostu glonów o 5–75 %.

1.8.6. Replikaty i próby kontrolne

Plan badania powinien obejmować trzy replikaty przy każdym stężeniu testowym. Jeżeli wyznaczenie NOEC nie jest wymagane, to plan badania można zmienić, zwiększając liczbę stężeń i zmniejszając liczbę replikatów przypadających na stężenie. Liczba replikatów kontrolnych musi wynosić co najmniej trzy, a najlepiej powinna być dwukrotnie większa od liczby replikatów użytych dla każdego stężenia testowego.

Do analitycznych oznaczeń stężeń substancji testowej można sporządzić oddzielny zestaw roztworów testowych (zob. akapit czwarty i szósty w sekcji 1.8.11).

Gdy do rozpuszczenia substancji testowej użyty jest rozpuszczalnik, to w planie badania należy ująć dodatkowe próby kontrolne zawierające rozpuszczalnik o tym samym stężeniu, co w badanych kulturach.

1.8.7. Przygotowanie kultury inokulum

W celu przystosowania badanych glonów do warunków badania oraz zapewnienia, że znajdują się one w fazie wykładniczego wzrostu, gdy są użyte do inokulacji roztworów testowych, kulturę inokulum w pożywce próbnej przygotowuje się 2–4 dni przez rozpoczęciem badania. Biomasę glonów należy skorygować w celu umożliwienia, aby w kulturze inokulum panował wzrost wykładniczy do czasu rozpoczęcia badania. Kulturę inokulum inkubuje się w tym samych warunkach, co kultury próbne. Należy zmierzyć przyrost biomasy w kulturze inokulum, aby zapewnić, że wzrost zawiera się w normalnym zakresie dla badanego szczepu w warunkach hodowania kultury. Przykład procedury dotyczącej hodowania kultury glonów opisano w dodatku 3. Aby uniknąć synchronicznego podziału komórek podczas badania, może być wymagany drugi krok reprodukowania kultury inokulum.

1.8.8. Sporządzenie roztworów testowych

Wszystkie roztwory testowe muszą zawierać takie same stężenia pożywki wzrostowej i początkowej biomasy badanych glonów. Roztwory testowe o wybranych stężeniach zwykle sporządza się przez zmieszanie roztworu podstawowego substancji testowej z pożywką wzrostową i kulturą inokulacyjną. Roztworzy podstawowe zwykle sporządza się rozpuszczając substancję testową w pożywce.

Jako nośników służących do dodania substancji o małej rozpuszczalności w wodzie do pożywki można użyć rozpuszczalników, np. acetonu, alkoholu t-butylowego i dwumetyloformamidu (2)(3). Stężenie rozpuszczalnika nie powinno przekraczać 100 µl/l i takie samo stężenie rozpuszczalnika należy dodać do wszystkich kultur (wraz z kontrolnymi) w badanej serii.

1.8.9. Inkubacja

Przykryć naczynia badawcze korkami przepuszczającymi powietrze. Naczynia wstrząsa się i umieszcza w aparacie do hodowli kultur. Podczas badania niezbędne jest utrzymanie glonów w zawiesinie i umożliwienie wnikania CO2. W tym celu należy stosować ciągłe wstrząsanie lub mieszanie. Kultury należy utrzymywać w przedziale temperatury 21–24 °C, regulowanej w granicach ±2 °C. Dla gatunków innych niż wymienione w dodatku 1, np. gatunków tropikalnych, odpowiednie mogą być wyższe temperatury, pod warunkiem że spełnione będą kryteria ważności. Kolby zaleca się umieścić losowo i codziennie zmieniać ich położenie w inkubatorze.

pH pożywki kontrolnej nie powinno wzrosnąć w trakcie badania o więcej niż 1,5 jednostek. W przypadku metali i związków, które częściowo jonizują się przy pH w pobliżu pH badania może być konieczne ograniczenie dryftu pH, aby otrzymać odtwarzalne oraz dobrze określone wyniki. Dryft < 0,5 jednostek pH jest technicznie możliwy i może być osiągnięty przez zapewnienie należytej szybkości wnikania masy CO2 z otaczającego powietrza do roztworu testowego, np. przez zwiększanie szybkości wstrząsania. Inną możliwością jest zmniejszenie zapotrzebowania na CO2 przez zmniejszenie początkowej biomasy lub skrócenie czasu trwania badania.

Powierzchnia, na której następuje inkubacja kultur, powinna otrzymywać ciągłe, równomierne oświetlenie np. typu „chłodnego światła białego” lub „światła dziennego”. Szczepy glonów i cyjanobakterii różnią się pod względem swojego zapotrzebowania na światło. Natężenie światła należy dobrać w taki sposób, aby odpowiadało ono organizmowi wybranemu do badania. Dla zalecanych gatunków zielonych glonów natężenie światła na poziomie roztworów testowych wybiera się z zakresu 60–120 µE·m–2·s–1, mierząc w skutecznym dla fotosyntezy przedziale długości fali 400–700 nm przy użyciu odpowiedniego receptora. Niektóre gatunki, w szczególności Anabaena flos-aquae, rosną dobrze przy mniejszych natężeniach światła, a przy wyższych mogą ulec uszkodzeniu. Dla takich gatunków należy wybrać średnie natężenie światła w zakresie 40–60 µE·m–2·s–1. (Dla przyrządów do pomiaru światła wykalibrowanych w luksach, zalecanemu natężeniu światła 60–120 µE·m–2·s–1 odpowiada w przybliżeniu równoważny zakres 4440–8880 luksów dla chłodnego światła białego). Natężenie światła nie powinno wahać się bardziej niż ±15 % od średniego natężenia światła na powierzchni inkubacji.

1.8.10. Czas trwania badania

Badanie zwykle trwa 72 godzin. Jednakże, można zastosować krótsze lub dłuższe czasy trwania badania, pod warunkiem że mogą być spełnione kryteria ważności podane w sekcji 1.7.

1.8.11. Pomiary i oznaczenia analityczne

Biomasę glonów w każdej kolbie określa się co najmniej raz dziennie podczas okresu badania. Jeżeli pomiary dokonywane są na małych objętościach pobranych z roztworu testowego za pomocą pipety, to nie należy wprowadzać ich z powrotem do roztworu.

Pomiar biomasy wykonuje się poprzez ręczne zliczanie komórek przy pomocy mikroskopu lub elektronicznego licznika cząstek (określając liczbę komórek lub bioobjętość). Można zastosować alternatywne techniki, np. cytometrię przepływową, fluorescencję chlorofilu in vitro lub in vivo (6) (7) lub gęstość optyczną, pod warunkiem że można wykazać zadowalającą korelację z biomasą w całym zakresie biomasy występującym w badaniu.

pH roztworów mierzy się na początku i na końcu badania.

Jeśli dostępna jest procedura analityczna dla oznaczania badanej substancji w zastosowanym zakresie stężenia, roztwory testowe należy analizować celem sprawdzenia początkowych stężeń i utrzymania stężeń ekspozycji podczas badania.

W przypadku gdy jest prawdopodobne, że stężenie będą w trakcie badania odbiegać od nominalnych wartości o mniej niż 20 %, może być wystarczająca analiza stężenia substancji testowej na początku i końcu badania niskiego i wysokiego stężenia testowego oraz stężenia około spodziewanego EC50. Gdy natomiast jest mało prawdopodobne, że stężenia pozostaną w granicach 80–120 % nominalnej wartości, to zaleca się analizę wszystkich stężeń testowych na początku i końcu badania. Dla substancji lotnych, nietrwałych lub silnie adsorbujących zaleca się dodatkowe pobieranie próbek do analizy w odstępach 24-godzinnych w ciągu okresu ekspozycji, aby lepiej określić stratę substancji testowej. Dla tych substancji potrzebne będą dodatkowe replikaty. We wszystkich przypadkach oznaczenie stężeń substancji testowej musi być wykonywane tylko na jednym naczyniu z replikatem przy każdym stężeniu testowym (lub na zawartościach naczyń połączonych według replikatu).

Pożywkę testową sporządzoną specjalnie do analizy stężeń ekspozycji podczas badania należy potraktować identycznie, jak pożywki użyte do badania, tzn. należy je zaszczepić glonami i inkubować w identycznych warunkach. Jeżeli wymagana jest analiza stężenia rozpuszczonej substancji testowej, to może być konieczne oddzielenie glonów od pożywki. Oddzielenia należy dokonać najlepiej przez odwirowanie przy małej sile grawitacji, wystarczającej do osadzenia się glonów.

Jeśli istnieją dowody, że stężenie substancji testowej zostało zadowalająco utrzymane w granicach ±20 % nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia w ciągu całego badania, to analizę wyników można oprzeć na nominalnych lub zmierzonych wartościach początkowych. Jeśli odchylenie od nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia jest większe niż ±20 %, to analizę wyników należy oprzeć na średnim geometrycznym stężeniu w ciągu ekspozycji lub na modelach opisujących spadek stężenia substancji testowej (3)(8).

Badanie inhibicji wzrostu glonów odbywa się w bardziej dynamicznym układzie próbnym niż większość innych krótkookresowych badań toksyczności wodnej. W rezultacie rzeczywiste stężenia ekspozycji mogą być trudne do określenia, zwłaszcza dla substancji adsorbujących badanych w niskich stężeniach. W takich przypadkach zniknięcie substancji z roztworu przez adsorpcję do rosnącej masy glonów nie oznacza, że jest ona utracona z badanego układu. Podczas analizowania wyniku badania należy sprawdzić, czy zmniejszeniu stężenia substancji testowej w trakcie badania towarzyszy zmniejszenie inhibicji wzrostu. Jeżeli tak się dzieje, to można rozważyć zastosowanie odpowiedniego modelu opisującego spadek stężenia substancji testowej (8). Jeżeli nie, to odpowiednim może być oparcie analizy wyników na początkowych (nominalnych lub zmierzonych) stężeniach.

1.8.12. Inne obserwacje

Należy przeprowadzić obserwacje mikroskopowe w celu sprawdzenia, czy wygląd kultury inokulacyjnej jest normalny i zdrowy oraz zaobserwowania ewentualnego anormalnego wyglądu glonów (który może być spowodowany ekspozycją na substancję testową) na końcu badania.

1.8.13. Badanie graniczne

W pewnych okolicznościach, np. gdy wstępne badanie wskazuje, że substancja testowa nie ma toksycznych skutków w stężeniach do 100 mg·l–1 lub do jej granicznej rozpuszczalności w pożywce testowej (zależnie od tego, co jest niższe), można przeprowadzić badanie graniczne polegające na porównaniu odpowiedzi grupy kontrolnej i jednej grupy poddawanej zabiegowi (o stężeniu 100 mg·l–1 lub równym granicznej rozpuszczalności). Bardzo zalecane jest, aby było to poparte analizą stężenia ekspozycji. Do badania granicznego stosują się wszystkie poprzednio opisane warunki badania i kryteria ważności, poza tym że liczba replikatów poddawanych zabiegowi powinna wynosić co najmniej sześć. Zmienne odpowiedzi w grupie poddawanemu zabiegowi i w grupie kontrolnej można analizować przy użyciu testu statystycznego do porównania średnich, np. testu t Studenta. Jeżeli wariancje obydwu grup są nierówne, to należy wykonać test t skorygowany dla nierównych wariancji.

1.8.14. Modyfikacja w odniesieniu do mocno zabarwionych substancji

Napromienienie (intensywność światła) powinno być bliskie najwyższych wartości zakresu przewidzianego w tej metodzie badania: 120µE m-2 s-1 lub wyższe.

Drogę strumienia światła należy skrócić poprzez ograniczenie objętości roztworów testowych (zakres od 5 do 25 ml).

Należy zapewnić częste poruszanie (np. poprzez umiarkowane potrząsanie), tak by glony były często wystawione na intensywne napromienienie na powierzchni kultury.

2. DANE

2.1. WYKREŚLENIE KRZYWYCH WZROSTU

Biomasa w naczyniach badawczych może być wyrażona w jednostkach surogatowego parametru użytego do pomiaru (np. liczby komórek, fluorescencji).

Należy zestawić w postaci tabelarycznej oszacowane stężenie biomasy w kulturach testowych i w kulturach kontrolnych wraz ze stężeniami badanego materiału i czasami pomiaru zarejestrowanymi z dokładnością co najmniej do pełnych godzin, aby sporządzić wykresy krzywych wzrostu. Na tym pierwszym etapie mogą być przydatne skale zarówno logarytmiczne, jak liniowe, lecz skale logarytmiczne są obowiązkowe i na ogół dają lepszą reprezentację zmienności przebiegu wzrostu podczas okresu badania. Należy zwrócić uwagę, że nachylenie linii (tangens kąta nachylenia) oznacza właściwą szybkość wzrostu.

Przy pomocy wykresów należy zbadać, czy kultury kontrolne wzrastają wykładniczo ze spodziewaną szybkością w ciągu całego badania. Należy krytycznie zbadać wszystkie punkty danych oraz wygląd wykresów i sprawdzić dane pierwotne i procedury pod kątem możliwych błędów. Sprawdzić w szczególności wszelkie punkty danych, które wydają się odchylać o błąd systematyczny. Jeżeli jest oczywiste, że można stwierdzić i/lub uznać za wysoce prawdopodobne błędy proceduralne, to określony punkt danych oznacza się jako wartość oddaloną i nie ujmuje się w późniejszej analizie statystycznej. (Zerowe stężenie glonów w jednym z dwóch lub trzech naczyniach replikatów może oznaczać, że naczynie to nie zostało poprawnie zaszczepione lub zostało niewłaściwie wyczyszczone). Powody odrzucenia punktu danych jako wartości oddalonej należy wyraźnie podać w sprawozdaniu z badania. Akceptowanymi powodami są jedynie (rzadkie) błędy proceduralne, a nie tylko niedostateczna dokładność. Procedury statystyczne dotyczące identyfikacji wartości oddalonych mają ograniczone zastosowanie do zagadnienia tego typu i nie mogą zastąpić specjalistycznej opinii. Wartości oddalone (zaznaczone jako takie) należy najlepiej zachować wśród punktów danych przedstawionych w późniejszej graficznej lub tabelarycznej prezentacji danych.

2.2. ZMIENNE ODPOWIEDZI

Celem badania jest określenie wpływów substancji testowej na wzrost glonów. Niniejsza metoda badawcza opisuje dwie zmienne odpowiedzi, gdyż państwa członkowskie mają różne preferencje i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania były możliwe do przyjęcia we wszystkich państwach członkowskich, skutki należy oceniać używając obydwu opisanych poniżej zmiennych odpowiedzi a) i b).

a) Średnia właściwa szybkość wzrostu: tę zmienną odpowiedzi oblicza się na podstawie logarytmicznego przyrostu biomasy w ciągu okresu badania, wyrażonego na dzień.

b) Uzysk: tą zmienną odpowiedzi jest biomasa na końcu badania minus początkowa biomasa.

Do celów stosowania tej metody w ramach unijnego prawodawstwa, z powodów opisanych poniżej, obliczanie wyników powinno opierać się na średniej właściwej szybkości wzrostu. Należy zwrócić uwagę, że wartości toksyczności obliczone przy użyciu tych dwu zmiennych odpowiedzi nie są porównywalne i różnica musi być rozpoznana, gdy używa się wyników badania. Jeżeli zachowane są warunki badania określone w niniejszej metodzie badawczej, to wartości ECx oparte o średnią właściwą szybkość wzrostu (ErCx) zwykle bywają wyższe od wartości opartych o uzysk (EyCx), ze względu na podstawę matematyczną odnośnych podejść. Nie należy tego interpretować jako różnicę czułości pomiędzy dwiema zmiennymi odpowiedzi, lecz jedynie że wartości te są matematycznie różne. Pojęcie średniej właściwej szybkości wzrostu oparte jest o ogólny wykładniczy przebieg wzrostu glonów w nieograniczonych kulturach, gdzie toksyczność jest szacowana na podstawie wpływów na szybkość wzrostu, nie będąc zależną od bezwzględnego poziomu właściwej szybkości wzrostu kultury kontrolnej, nachylenia krzywej stężenie–odpowiedź lub czasu trwania badania. Natomiast wyniki oparte o zmienną odpowiedzi w postaci uzysku są zależne od wszystkich tych pozostałych zmiennych. EyCx jest zależne od właściwej szybkości wzrostu gatunków glonów użytych w każdym badaniu oraz od maksymalnej właściwej szybkości wzrostu, która może być różna dla różnych gatunków, a nawet dla różnych szczepów glonów. Tej zmiennej odpowiedzi nie powinno się używać do porównywania czułości na czynniki toksyczne pomiędzy gatunkami glonów lub nawet różnymi ich szczepami. Choć do szacowania toksyczności naukowo preferowane jest posługiwanie się średnią właściwą szybkością wzrostu, to oszacowania toksyczności na podstawie uzysku są również ujęte w niniejszej metodzie badawczej, aby uczynić zadość obecnym wymogom regulacyjnym istniejącym w niektórych krajach.

2.2.1. Średnia szybkość wzrostu

Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza się jako logarytmiczny przyrost biomasy z równania dla każdego pojedynczego naczynia kultur kontrolnych i poddawanych zabiegowi:

(dzień–1)

gdzie:

µ

i–j

:

jest średnią właściwą szybkością wzrostu od czasu i do j,

X

i

:

jest biomasą o czasie i,

X

j

:

jest biomasą o czasie j.

Dla każdej grupy poddawanej zabiegowi i grupy kontrolnej należy obliczyć średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji.

Obliczyć średnią właściwą szybkość wzrostu w ciągu całego czasu trwania badania (zwykle dni 0–3), jako początkową wartość używając nominalnie zaszczepioną biomasę, zamiast zmierzonej początkowej wartości, ponieważ w ten sposób zwykle uzyskuje się większą dokładność. Jeżeli urządzenie używane do pomiaru biomasy pozwala na dostatecznie dokładne określenie małej biomasy inokulum (np. cytometr przepływowy), to można użyć zmierzonego początkowego stężenia biomasy. Ocenić również szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, obliczoną jako właściwe szybkości wzrostu dla każdego dnia w trakcie badania (dni 0–1, 1–2 i 2–3) oraz zbadać, czy szybkość wzrostu w kulturze kontrolnej pozostaje stała (zob. kryteria walidacji, sekcja 1.7). Znacząco niższa właściwa szybkość wzrostu w pierwszym dniu od ogólnej średniej właściwej szybkości wzrostu może oznaczać fazę zwłoki. Podczas gdy fazę zwłoki można zminimalizować i praktycznie wyeliminować w kulturach kontrolnych przez odpowiednie rozmnożenie kultury pierwotnej, to faza zwłoki w kulturach poddanych ekspozycji może oznaczać regenerację po początkowym stresie toksycznym lub zmniejszoną ekspozycję wskutek straty substancji testowej (w tym jej sorpcji na biomasie glonów) po początkowej ekspozycji. Stąd, można określić szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, aby ocenić skutki substancji testowej występujące w ciągu okresu ekspozycji. Istotne różnice pomiędzy szybkością wzrostu dla poszczególnych odcinków a średnią szybkością wzrostu oznaczają odchylenie od stałego wykładniczego wzrostu i uzasadniają dokładne zbadanie krzywych wzrostu.

Należy obliczyć procentową inhibicję szybkości wzrostu dla każdego replikatu poddawanego zabiegowi, według następującego równania:

gdzie:

%Ir:

procentowa inhibicja średniej właściwej szybkości wzrostu,

µC:

wartość średnia średniej właściwej szybkości wzrostu (µ) w grupie kontrolnej,

µT:

średnia właściwa szybkość wzrostu dla replikatu poddawanego zabiegowi.

Gdy do sporządzenia roztworów testowych użyte są rozpuszczalniki, w obliczeniu procentowej inhibicji należy użyć grup kontrolnych z rozpuszczalnikiem zamiast grup kontrolnych bez rozpuszczalnika.

2.2.2. Uzysk

Uzysk oblicza się jako biomasę na końcu badania minus biomasa na początku badania dla każdego pojedynczego naczynia z replikatami kontrolnymi i replikatami poddawanymi zabiegowi. Dla każdego stężenia testowego i grupy kontrolnej należy obliczyć średnią wartość uzysku wraz z oszacowaniami wariancji. Dla każdego replikatu poddawanemu zabiegowi można obliczyć procentową inhibicję uzysku (%Iy) w następujący sposób:

gdzie:

% Iy:

procentowa inhibicja uzysku,

YC:

średnia wartość uzysku w grupie kontrolnej,

YT:

wartość uzysku dla replikatu poddawanemu zabiegowi.

2.3. WYKREŚLENIE KRZYWEJ ODPOWIEDZI STĘŻENIOWEJ

Należy wykreślić procent inhibicji w zależności od logarytmu stężenia substancji testowej i dokładnie zbadać wykres, pomijając każdy punkt danych, który został potraktowany jako wartość oddalona w pierwszej fazie. Należy dopasować linię gładką pomiędzy punktami danych na oko lub za pomocą komputerowej interpolacji, aby uzyskać pierwsze wrażenie zależności odpowiedzi stężeniowej, a następnie kontynuować z zastosowaniem bardziej szczegółowej metody, najlepiej komputerowej metody statystycznej. W zależności od zamierzonego wykorzystania danych, jakości (dokładności) i ilości danych, jak również dostępności narzędzi do analizy danych, można postanowić (co niekiedy jest należycie uzasadnione), aby przerwać analizę danych na tym etapie i po prostu odczytać główne wielkości EC50 i EC10 (oraz/lub EC20) z dopasowanej na oko krzywej (zob. również poniżej — sekcja dotycząca skutków stymulacyjnych). Do ważnych powodów niezastosowania metody statystycznej mogą należeć następujące:

— Dane nie są odpowiednie do tego, aby metody komputerowe przyniosły wyniki bardziej wiarygodne od uzyskanych na podstawie specjalistycznej oceny — w takich sytuacjach, niektóre programy komputerowe mogą nawet nie dostarczyć wiarygodnego rozwiązania (iteracje mogą nie osiągnąć zbieżności, itp.).

— Odpowiedzi stymulacyjnego wzrostu nie mogą być w zadowalający sposób poddane obróbce przy użyciu dostępnych programów komputerowych (zob. poniżej).

2.4. PROCEDURY STATYSTYCZNE

Celem jest uzyskanie ilościowej zależności stężenie–odpowiedź za pomocą analizy regresji. Możliwe jest zastosowanie ważonej regresji liniowej po przeprowadzeniu linearyzującej transformacji danych odpowiedzi — na przykład do jednostek probit lub logit albo Weibulla (9), lecz preferowane są procedury regresji nieliniowej, które lepiej znoszą nieuniknione nieregularności danych i odchylenia od gładkich rozkładów. Przy zbliżaniu się do zerowej lub do całkowitej inhibicji, nieregularności takie mogą zostać powiększone przez transformację, zakłócając analizę (9). Należy zwrócić uwagę, że standardowe metody analizy przy użyciu transformat probit, logit lub Weibulla są przeznaczone do stosowania do danych kwantalowych (np. śmiertelności lub przeżywalności) i muszą zostać zmodyfikowane z dostosowaniem do danych szybkości wzrostu lub biomasy. Szczegółowe procedury wyznaczania wartości ECx na podstawie ciągłych danych można znaleźć w (10), (11) i (12). Zastosowanie analizy regresji nieliniowej jest dalej opisane szczegółowo w dodatku 4.

Dla każdej zmiennej odpowiedzi, która ma być analizowana należy użyć zależności stężenie–odpowiedź do obliczenia oszacowań punktowych wartości ECx. Gdy to możliwe, dla każdego oszacowania należy określić granice ufności 95 %. Dokładność dopasowania danych odpowiedzi do modelu regresji należy ocenić graficznie lub statystycznie. Analizę regresji należy przeprowadzić używając odpowiedzi indywidualnych replikatów, a nie średnich z grup poddawanych zabiegowi. Jeśli jednak dopasowanie krzywej nieliniowej jest trudne lub nie udaje się z powodu zbyt dużego rozrzutu danych, to problem można ominąć wykonując regresję na średnich z grup, jako praktyczny sposób ograniczenia wpływu podejrzewanych wartości oddalonych. Wybranie tej opcji należy zaznaczyć w sprawozdaniu z badania jako odstępstwo od normalnej procedury wynikłe stąd, że dopasowania krzywej przy pomocy indywidualnych replikatów nie dały dobrego rezultatu.

Oszacowania EC50 i granice ufności można również otrzymać przy użyciu interpolacji liniowej z ładowaniem początkowym (13), jeżeli dostępne modele/metody regresji są nieodpowiednie do danych.

W celu oszacowania LOEC, a stąd NOEC, oraz wpływów substancji testowej na szybkość wzrostu, konieczne jest porównanie średnich z grup poddawanych zabiegowi przy użyciu technik analizy wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia należy następnie porównać ze średnią kontrolną przy użyciu odpowiedniej metody wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny może być test Dunnetta lub Williamsa (14)(15)(16)(17)(18). Należy ocenić, czy przyjęte w ANOVA założenie homogeniczności wariancji pozostaje w mocy. Ocenę tę można przeprowadzić graficznie lub za pomocą formalnego testu (18). Odpowiednimi do tego celu testami są testy Levene’a lub Bartletta. Niespełnienie założenia o homogeniczności wariancji można niekiedy skorygować za pomocą logarytmicznego przekształcenia danych. Jeżeli heterogeniczność wariancji jest skrajnie duża i nie może być skorygowana przez transformację, to należy rozważyć analizę za pomocą metod takich, jak testy trendu stopniowego obniżania Jonkheere’a. Dodatkowe wskazówki dotyczące wyznaczania NOEC można znaleźć w (12).

Rozwój naukowy, jaki ostatnio nastąpił, doprowadził do zalecenia zarzucenia pojęcia NOEC i zastąpienia go regresją opartą o oszacowania punktowe ECx. Dla niniejszego badania glonów nie ustalono odpowiedniej wartości x. Odpowiednim wydaje się przedział 10–20 % (w zależności od wybranej zmiennej odpowiedzi), a najlepiej należy podać zarówno EC10, jak i EC20.

2.5. STYMULACJA WZROSTU

Niekiedy obserwuje się stymulację wzrostu (ujemna inhibicja) przy niskich stężeniach. Może to wynikać z hormezy („toksycznej stymulacji”) lub z dodania stymulujących czynników wzrostu z badanym materiałem do użytej minimalnej pożywki. Należy zwrócić uwagę, że dodanie nieorganicznych składników odżywczych nie powinno mieć żadnego bezpośredniego wpływu, ponieważ badana pożywka powinna zachować nadmiar składników odżywczych w ciągu całego badania. Stymulację niskodawkową można zwykle pominąć w obliczeniach EC50, chyba że jest skrajna. Jednakże, jeśli jest ona skrajna lub ma być obliczona wartość ECx dla małego x, to mogą być wymagane specjalne procedury. Należy unikać usuwania odpowiedzi stymulacyjnych z analizy danych, jeśli to możliwe i jeżeli dostępne oprogramowania do dopasowywania krzywych nie może przyjąć drobnej stymulacji, to można posłużyć się interpolacją liniową z ładowaniem początkowym (19).

2.6. NIETOKSYCZNE HAMOWANIE WZROSTU

Materiały badane pochłaniające światło mogą przyczyniać się do redukcji szybkości wzrostu, ponieważ zacienienie zmniejsza ilość dostępnego światła. Takie fizyczne typy oddziaływań należy oddzielić od oddziaływań toksycznych przez zmodyfikowanie warunków badania i podać je odrębnie w sprawozdaniu. Wskazówki można znaleźć w (2) i (3).

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Substancja testowa:

— fizyczny charakter i stosowne własności fizykochemiczne, w tym graniczna rozpuszczalność w wodzie,

— dane identyfikacyjne substancji chemicznej, w tym czystość.

Badane gatunki:

— szczep, dostawca lub źródło oraz zastosowane warunki kultury.

Warunki badania:

— data rozpoczęcia badania i czas jego trwania,

— opis planu badania: naczynia badawcze, objętości kultur, gęstość biomasy na początku badania,

— skład pożywki,

— stężenia testowe i replikaty (np. liczba replikatów, liczba stężeń testowych oraz zastosowany postęp geometryczny),

— opis sporządzania roztworów testowych, w tym użycia rozpuszczalników, itp.,

— aparatura do hodowli kultur,

— natężenie i jakość światła (źródło, jednorodność),

— temperatura,

— stężenia testowe: nominalne stężenia testowe oraz wszelkie wyniki analiz określania stężenia substancji testowej w naczyniach badawczych. Należy podać sprawność odzyskową metody oraz granicę kwantyfikacji w zestawie badawczym,

— wszelkie odstępstwa od niniejszej metody badawczej,

— metoda określania biomasy oraz dowody korelacji pomiędzy mierzonym parametrem a ciężarem masy suchej.

Wyniki:

— wartości pH na początku i na końcu badania przy wszystkich zabiegach,

— biomasa dla każdej kolby w każdym punkcie pomiarowym oraz metoda pomiaru biomasy,

— krzywe wzrostu (wykres zależności biomasy od czasu),

— obliczone zmienne odpowiedzi dla każdego replikatu poddawanemu zabiegowi, wraz z wartościami średnimi i współczynnikami zmienności dla replikatów,

— graficzne przedstawienie zależności stężenie/skutek,

— oszacowania toksyczności dla zmiennych odpowiedzi, np. EC50, EC10, EC20 oraz związane z nimi przedziały ufności. W przypadku obliczenia — LOEC i NOEC oraz metody statystyczne użyte do ich wyznaczenia,

— jeżeli zastosowana została ANOVA — wielkość skutku, który można wykryć (np. najmniejsza znacząca różnica),

— wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którejkolwiek próbie,

— wszelkie zaobserwowane skutki, np. morfologiczne zmiany glonów,

— omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania wynikający z odstępstw od niniejszej metody badawczej.

4. LITERATURA

(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test.

(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.

(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.

(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General Guidance for Biotesting. ISO 5667–16.

(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 8692.

(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22,5 (1977), pp. 919–925.

(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.

(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.

(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.

(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.

(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.

(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.

(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Dodatek 1

Szczepy wykazane jako odpowiednie do badania

Zielenice

— Pseudokirchneriella subcapitata, (poprzednio znana pod nazwą Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

— Desmodesmus subspicatus (poprzednio znana pod nazwą Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Okrzemki

— Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cyjanobakterie

— Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

— Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Źródła szczepów

Zalecane szczepy są dostępne w postaci kultur jednoalgowych z następujących kolekcji (w kolejności alfabetycznej):

ATCC: American Type Culture Collection (Amerykańska kolekcja typokulturowa)

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110–2209

USA

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa (Kolekcja kulturowa glonów i pierwotniaków)

Institute of Freshwater Ecology (Instytut Wód Słodkich),

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria

LA22 0LP

ZJEDNOCZONE KRÓLESTWO

SAG: Collection of Algal Cultures (Kolekcja kultur glonów)

Inst. Plant Physiology (Instytut Fizjologii Roślin)

University of Göttingen (Uniwersytet w Getyndze)

Nicholausberger Weg 18

D-3400 Göttingen

NIEMCY

UTEX Culture Collection of Algae (Kulturowa kolekcja glonów)

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology (Sekcja Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej)

School of Biological Sciences (Wydział Nauk Biologicznych)

the University of Texas at Austin (Uniwersytet Teksański w Austin)

Austin, Texas 78712

USA

Wygląd i charakterystyka zalecanych gatunków

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Wygląd

Zakrzywione, skręcone pojedyncze komórki

Owalne, przeważnie pojedyncze komórki

Pałeczki

Łańcuchy owalnych komórek

Pałeczki

Rozmiar (L × W) µm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Objętość komórki (µm3/komórkę)

40–60 (1)

60–80 (1)

40–50 (1)

30–40 (1)

2,5 (2)

Ciężar masy suchej (mg/komórkę)

2–3 × 10–8

3–4 × 10–8

3–4 × 10–8

1–2 × 10–8

2–3 × 10–9

Szybkość wzrostu (3) (dzień–1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Szczególne zalecenia dotyczące hodowli kultur i postępowania z zalecanymi gatunkami próbnymi

Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus

Te zielenice są na ogół łatwe do utrzymania w różnych pożywkach do hodowli kultur. Informacje dotyczące odpowiednich pożywek dostępne są od kolekcji kultur. Komórki są zazwyczaj odosobnione i pomiary gęstości komórek można łatwo wykonać przy użyciu elektronicznego licznika cząstek lub mikroskopu.

Anabaena flos-aquae

Do hodowania kultury podstawowej można używać różnych pożywek. Szczególnie ważne jest niedopuszczenie, aby podczas odnawiania kultura seryjna nie przekroczyła logarytmicznej fazy wzrostu, gdyż powrót do normy w tym momencie jest trudny.

Anabaena flos-aquae tworzy skupiska wchodzących w siebie nawzajem łańcuchów komórek. Rozmiar tych skupisk może zmieniać się w zależności od warunków hodowania kultury. Może być konieczne rozbicie tych skupisk, gdy do określania biomasy stosuje się liczenie mikroskopowe lub elektroniczny licznik cząstek.

Do rozbicia łańcuchów w celu zmniejszenia zmienności zliczania można zastosować nadźwiękawianie. Nadźwiękawianie dłuższe niż wymagane do rozbicia łańcuchów na krótsze odcinki może zniszczyć komórki. Natężenie i czas trwania nadźwiękawiania muszą być identyczne dla każdego zabiegu.

Aby pozwolić skompensować zmienność, należy zliczyć na hemocytometrze dostateczną ilość pól (co najmniej 400 komórek). Poprawi to rzetelność mikroskopowych oznaczeń gęstości.

Do wyznaczenia całkowitej objętości komórek Anabaena można użyć elektronicznego licznika cząstek, po uprzednim rozbiciu łańcuchów komórek za pomocą ostrożnego nadźwiękawiania. Należy wyregulować energię nadźwiękawiania, aby uniknąć rozerwania komórek.

Należy użyć mieszadła wirowego lub podobnej odpowiedniej metody dla zapewnienia, że zawiesina glonów użyta do zaszczepienia naczyń badawczych jest dobrze wymieszana i jednorodna.

Naczynia badawcze należy ustawić na orbitalnym lub posuwno-zwrotnym stole wibracyjnym przy około 150 obrotach na minutę. Alternatywnie, aby zmniejszyć tendencję Anabaena do tworzenia skupisk, można stosować przerywane mieszanie. Jeżeli występuje tworzenie się skupisk, należy dołożyć starań, aby uzyskać reprezentatywne próbki do pomiarów biomasy. Aby rozbić skupiska glonów, przed pobraniem próbek może być konieczne energiczne mieszanie.

Synechococcus leopoliensis

Do hodowania kultury podstawowej można używać różnorodnych pożywek wzrostowych. Informacje o odpowiednich pożywkach są dostępne od kolekcji kultur.

Synechococcus leopoliensis rośnie w postaci odosobnionych komórek w kształcie pałeczek. Komórki są bardzo małe, co komplikuje stosowanie zliczania mikroskopowego do pomiarów biomasy. Przydatne są tu elektroniczne liczniki cząstek z wyposażeniem do liczenia cząstek o rozmiarach do około 1 µm. Można również stosować pomiary fluorometryczne in vitro.

Navicula pelliculosa

Do hodowania kultury podstawowej można używać różnorodnych pożywek wzrostowych. Informacje o odpowiednich pożywkach są dostępne od kolekcji kultur. Należy zwrócić uwagę, że w pożywce wymagany jest krzemian.

Navicula pelliculosa w pewnych warunkach wzrostu może tworzyć skupiska. Z uwagi na wytwarzanie lipidów komórki glonów wykazują niekiedy tendencję do zbierania się w warstewce powierzchniowej. W takich warunkach, podczas pobierania podpróbek do oznaczania biomasy należy podjąć szczególne środki, aby uzyskać reprezentatywne próbki. Może być potrzebne energiczne mieszanie, np. przy użyciu mieszadła wirowego.

(1) Zmierzono za pomocą elektronicznego licznika cząstek.

(2) Obliczono na podstawie rozmiaru.

(3) Najczęściej obserwowana szybkość wzrostu w pożywce OECD przy natężeniu światła ok. 70 µE·m–2·s–1 i w temp. 21 °C.

Dodatek 2

Pożywki wzrostowe

Można używać jednej z następujących dwu pożywek wzrostowych:

Pożywka OECD: Oryginalna pożywka OECD TG 201, również zgodna z ISO 8692

Pożywka AAP (EPA USA), również zgodna z ASTM.

Sporządzając te pożywki, należy użyć substancji chemicznych o czystości do analizy oraz wody dejonizowanej.

Skład pożywki AAP (EPA USA) oraz pożywki OECD TG 201

Składnik

EPA

OECD

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

NH4Cl

15,0

0,280

MgCl2·6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2·2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4·7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

KH2PO4

1,60

0,00919

FeCl3·6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA·2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269 (*1)

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2·4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2·6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4·2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2·2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

W badaniu z użyciem okrzemka Navicula pelliculosa, obydwie pożywki należy uzupełnić Na2SiO3·9H2O, aby uzyskać stężenie 1,4 mg Si/l.

pH pożywki uzyskuje się przy równowadze pomiędzy układem węglanowym pożywki a ciśnieniem cząstkowym CO2 w powietrzu atmosferycznym. Przybliżona zależność pomiędzy pH w temp. 25 °C a stężeniem molowym wodorowęglanu jest następująca:

PHeq = 11,30 + log [HCO3]

Przy 15 mg NaHCO3, pHeq = 7,5 (amerykańska pożywka EPA), a przy 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (pożywka OECD).

Skład pierwiastkowy pożywek

Pierwiastek

EPA

OECD

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Sporządzenie pożywki OECD

Składnik odżywczy

Stężenie w roztworze podstawowym

Roztwór podstawowy 1: makroskładniki odżywcze

NH4Cl

MgCl2·6H2O

CaCl2·2H2O

MgSO4·7H2O

KH2PO4

1,5 g·l–1

1,2 g·l–1

1,8 g·l–1

1,5 g·l–1

0,16 g·l–1

Roztwór podstawowy 2: żelazo

FeCl3·6H2O

Na2EDTA·2H2O

64 mg·l–1

100 mg·l–1

Roztwór podstawowy 3: pierwiastki śladowe

H3BO3

MnCl2·4H2O

ZnCl2

CoCl2·6H2O

CuCl2·2H2O

Na2MoO4·2H2O

185 mg·l–1

415 mg·l–1

3 mg·l–1

1,5 mg·l–1

0,01 mg·l–1

7 mg·l–1

Roztwór podstawowy 4: wodorowęglan

NaHCO3

50 g·l–1

Na2SiO3·9H20

Roztwory podstawowe należy wysterylizować przez filtrację przeponową (średnia średnica poru 0,2 µm) lub przez obróbkę w autoklawie (120 °C, 15 min). Roztwory należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.

Roztworów 2 i 4 nie poddawać obróbce w autoklawie, lecz wysterylizować je przez filtrację przeponową.

Sporządzić pożywkę wzrostową dodając odpowiednią objętość roztworów podstawowych 1–4 do wody:

Dodać do 500 ml sterylizowanej wody:

— 10 ml roztworu podstawowego 1,

— 1 ml roztworu podstawowego 2,

— 1 ml roztworu podstawowego 3,

— 1 ml roztworu podstawowego 4.

Uzupełnić wodą sterylizowaną do 1 000 ml.

Odczekać należyty czas na utworzenie się równowagi pomiędzy pożywką a CO2, jeśli potrzeba, stosując barbotaż sterylnym filtrowanym powietrzem przez kilka godzin.

Sporządzenie pożywki AAP

A1.1.

Dodać 1 ml każdego roztworu podstawowego wymienionego w A1.2.1–A1.2.7 do około 900 ml wody dejonizowanej lub destylowanej, a następnie rozcieńczyć do 1 l.

A1.2.

Roztwory podstawowe makroskładników odżywczych sporządza się, rozpuszczając poniższe składniki w 500 ml wody dejonizowanej lub destylowanej. Reagenty A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 oraz A1.2.4 można połączyć w jeden roztwór podstawowy.

A1.2.1.

NaNO3

—12,750 g.

A1.2.2.

MgCL2

·6H2O—6,082 g.

A1.2.3.

CaCl2

·2H2O—2,205 g.

A1.2.4.

Roztwór podstawowy mikroskładników odżywczych—(zob. A1.3).

A1.2.5.

MgSO4·7H2O—7,350 g.

A1.2.6.

K2HPO4

—0,522 g.

A1.2.7.

NaHCO3

—7,500 g.

A1.2.8.

Na2SiO3·9H2O—Zob. uwaga A1.1.

UWAGA A1.1 — Użyć tylko do badanych gatunków okrzemków. Można dodać bezpośrednio (202,4 mg) lub za pomocą roztworu podstawowego, aby otrzymać końcowe stężenie w pożywce wynoszące 20 mg/l Si.

A1.3.

Roztwór podstawowy mikroskładników odżywczych sporządza się, rozpuszczając poniższe składniki w 500 ml wody dejonizowanej lub destylowanej:

A1.3.1.

H3BO3

—92,760 mg.

A1.3.2.

MnCl2·4H2O—207,690 mg.

A1.3.3.

ZnCl2

—1,635 mg.

A1.3.4.

FeCl3·6H2O—79,880 mg.

A1.3.5.

CoCl2·6H2O—0,714 mg.

A1.3.6.

Na2MoO4·2H2O—3,630 mg.

A1.3.7.

CuCl2·2H2O—0,006 mg.

A1.3.8.

Na2EDTA·2H2O—150,000 mg.

[(Etylenodwunitrylo)czterooctan dwusodowy].

A1.3.9.

Na2SeO4·5H2O—0,005 mg. Zob. uwaga A1.2.

UWAGA A1.2 — Użyć tylko w pożywce dla kultur podstawowych gatunków okrzemków.

A1.4.

Wyregulować pH do 7,5 ± 0,1 za pomocą 0,1 N lub 1,0 N NaOH lub HCl.

A1.5.

Przefiltrować pożywkę do sterylnego pojemnika przez filtr przeponowy 0,22 μm, jeżeli ma być użyty licznik cząstek, lub filtr 0,45 μm, jeśli nie ma być użyty licznik cząstek.

A1.6.

Pożywkę należy przechowywać w ciemności w temperaturze około 4 °C do czasu użycia.

(*1) Stosunek molowy EDTA do żelaza przekracza nieco jeden. Zapobiega to wytrąceniu się żelaza, a jednocześnie zminimalizowana jest chelatacja jonów metali ciężkich.

Dodatek 3

Przykład procedury hodowania kultur glonów

Ogólne spostrzeżenia

Celem hodowania kultur w oparciu o poniższą procedurę jest otrzymanie kultur glonów do badań toksyczności.

Należy użyć odpowiednich metod dla zapewnienia, że kultury glonów nie będą zakażone bakteriami. Pożądane mogą być kultury akseniczne, lecz muszą zostać utworzone i użyte kultury jednoalgowe.

Wszystkie operacje należy przeprowadzać w warunkach sterylnych, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i innymi glonami.

Sprzęt i materiały

Zob. w podsekcji „Aparatura” sekcji „Metoda badawcza”.

Procedury otrzymywania kultur glonów

Sporządzenie roztworów składników odżywczych (pożywek):

Wszystkie odżywcze sole pożywki przygotowuje się w postaci stężonych roztworów podstawowych i przechowuje się w ciemnym i zimnym miejscu. Roztwory te sterylizuje się poprzez filtrację lub obróbkę w autoklawie.

Pożywkę sporządza się, dodając odpowiednią ilość roztworu podstawowego do sterylizowanej wody destylowanej, uważając, aby nie nastąpiło zakażenie. Do odżywki w postaci stałej dodaje się 0,8 procentu agaru.

Kultura podstawowa:

Kultury podstawowe są to nieduże kultury glonów, które przenosi się regularnie do świeżej pożywki, tak aby pełniła ona rolę początkowego materiału próbnego. Jeżeli kultury nie są regularnie używane, to tworzą smużki na nachylonych rurkach agaru. Należy przenieść je do świeżej pożywki co najmniej raz na dwa miesiące.

Kultury podstawowe hoduje się w kolbach stożkowych zawierających odpowiednią pożywkę (o objętości około 100 ml). Gdy glony są inkubowane w temperaturze 20 °C przy ciągłym oświetleniu, to wymagane jest cotygodniowe przenoszenie.

Podczas przenoszenia, pewną ilość „starej” kultury przenosi się przy pomocy sterylnych pipet do kolby ze świeżą pożywką, tak aby w przypadku gatunków szybko rosnących początkowe stężenie było około 100 razy mniejsze niż w starej kulturze.

Szybkość wzrostu gatunków można wyznaczyć z krzywej wzrostu. Jeśli jest ona znana, to możliwe jest oszacowanie gęstości, przy której kulturę należy przenieść do nowego medium. Musi to zostać wykonane, zanim kultura osiągnie fazę śmierci.

Kultura pierwotna:

Kultura pierwotna służy do dostarczenia pewnej ilości glonów, odpowiedniej do zaszczepienia kultur przeznaczonych do badania. Kultura pierwotna jest inkubowana w warunkach badania i zostaje użyta w chwili, gdy nadal wykładniczo wzrasta, zwykle po okresie inkubacji wynoszącym 2 do 4 dni. Gdy kultury algowe zawierają zdeformowane lub anormalne komórki, to należy je odrzucić.

Dodatek 4

Analiza danych za pomocą regresji nieliniowej

Zasady ogólne

Odpowiedź w badaniach glonów i badaniach wzrostu innych mikroorganizmów — wzrost biomasy jest z natury zmienną ciągłą lub metryczną — szybkością procesu, jeśli użyta jest szybkość wzrostu oraz jej całką po czasie, jeśli wybrana jest biomasa. Obydwie zmienne odniesione są do odpowiedniej średniej odpowiedzi replikatowych nieeksponowanych grup kontrolnych wykazujących maksymalną odpowiedź dla narzuconych warunków — ze światłem i temperaturą jako głównymi decydującymi czynnikami w badaniu glonów. Układ jest rozłożony lub jednorodny i biomasę można rozpatrywać jako kontinuum, nie biorąc pod uwagę indywidualnych komórek. Rozkład wariancji typu odpowiedzi dla takiego układu wiąże się wyłącznie z czynnikami doświadczalnymi (zwykle opisywanymi przez logarytmiczno-normalne lub normalne rozkłady błędu). Stanowi to przeciwieństwo dla typowych odpowiedzi biooznaczania z danymi kwintalowymi, dla których często przyjmuje się, że dominującą składową wariancji jest tolerancja indywidualnych organizmów (zazwyczaj o rozkładzie dwumianowym). Odpowiedziami kontrolnymi jest tu poziom zerowy lub tła.

W nieskomplikowanej sytuacji, znormalizowana lub względna odpowiedź, r, maleje monotonicznie od 1 (zerowe hamowanie) do 0 (100-procentowe hamowanie). Należy zwrócić uwagę, że wszystkie odpowiedzi mają związany z sobą błąd i że pozorne ujemne inhibicje można obliczyć jedynie jako wynik błędu przypadkowego.

Analiza regresji

Modele

Celem analizy regresji jest ilościowe opisanie krzywej stężenie-odpowiedź w postaci matematycznej funkcji regresji Y = f (C) lub częściej F (Z), gdzie Z = log C. Zastosowana jako odwrotność C = f–1 (Y), pozwala ona na obliczenie wielkości ECx, w tym EC50, EC10 i EC20 oraz ich 95 % granic ufności. Wykazano, że kilka prostych matematycznych postaci funkcyjnych z powodzeniem opisuje zależności stężenie-odpowiedź uzyskiwane w badaniach inhibicji wzrostu glonów. Do funkcji tych należy, na przykład, równanie logarytmiczne, niesymetryczne równanie Weibula oraz funkcja rozkładu logarytmiczno-normalnego, z których wszystkie są krzywymi sigmoidalnymi dążącymi asymptotycznie do jedności dla C → 0 oraz do zera dla C → nieskończoności.

Ostatnio zaproponowaną alternatywą dla modeli asymptotycznych jest zastosowanie modeli opartych na ciągłych funkcjach progowych (np. modelu Koymana „dla inhibicji wzrostu populacji”, Kooijman i inni, 1996). Model ten zakłada brak efektów przy stężeniach poniżej pewnego progu, EC0+, który oszacowywany jest przez ekstrapolację zależności odpowiedź-stężenie z wyznaczeniem przecięcia z osią stężeń przy użyciu prostej funkcji ciągłej, która nie jest różniczkowalna w punkcie początkowym.

Należy zwrócić uwagę, że analiza ta może być prostą minimalizacją sum kwadratów resztkowych (zakładając stałą wariancję) lub kwadratów ważonych, jeżeli ma być skompensowana heterogeniczność wariancji.

Procedura

Procedurę można przedstawić następująco: wybrać odpowiednie równanie funkcyjne, Y = f (C), i dopasować je do danych za pomocą regresji nieliniowej. Najlepiej należy wykorzystać wyniki pomiarów z każdej indywidualnej kolby, zamiast średnich wartości replikatów, aby uzyskać możliwie jak najwięcej informacji z danych. Jeśli natomiast wariancja jest duża, to praktyczne doświadczenie sugeruje, iż średnie wartości replikatów mogą okazać się solidniejszą estymacją matematyczną, mniej ulegającą wpływowi systematycznych błędów w danych, niż w przypadku zachowania każdego indywidualnego punktu danych.

Należy wykreślić dopasowaną krzywą i nanieść zmierzone dane i zbadać, czy dopasowanie krzywej jest odpowiednie. Szczególnie przydatnym narzędziem o tego celu może być analiza reszt. Jeżeli wybrana zależność funkcyjna do dopasowania odpowiedzi stężenia nie opisuje dobrze całej krzywej lub istotnej jej części, takiej jak odpowiedź przy niskich stężeniach, to należy wybrać inną możliwość dopasowania krzywej — np. krzywą niesymetryczną, taką jak funkcja Weibula, zamiast symetrycznej. Ujemne inhibicje mogą stanowić problem, na przykład z funkcją rozkładu logarytmiczno-normalnego, również wymagając alternatywnej funkcji regresji. Nie jest zalecane, aby takim ujemnych wartościom przypisywać zerową lub małą dodatnią wartość, ponieważ zniekształca to rozkład błędów. Odpowiednim może być wykonanie oddzielnych dopasowań krzywej na częściach krzywej, takich jak część o małej inhibicji, aby oszacować wielkości EClow x. Obliczyć z dopasowanego równania (za pomocą „odwrotnej estymacji”, C = f–1 (Y) oszacowania punktów charakterystycznych ECx i podać, jako minimum, oszacowanie EC50 oraz jedno lub dwa oszacowania EClow x. Doświadczenie uzyskane z praktycznych badań wykazało, że dokładność badania glonów zwykle pozwala na dość dokładne oszacowanie na 10 % poziomie inhibicji, jeżeli istnieje dostateczna ilość punktów danych — o ile, jako czynnik wikłający, nie występuje stymulacja przy niskich stężeniach. Dokładność oszacowania EC20 jest często znacznie lepsza niż EC10, ponieważ EC20 zazwyczaj leży na w przybliżeniu liniowej części środkowej krzywej odpowiedzi stężeniowej. Niekiedy EC10 może być trudne do interpretacji z powodu stymulacji wzrostu. Tak więc, choć EC10 zwykle da się uzyskać z dostateczną dokładnością, to również zaleca się, aby w sprawozdaniu zawsze podawać EC20.

Współczynniki ważenia

Doświadczalna wariancja nie jest na ogół stała i zwykle zawiera składową proporcjonalną, korzystnie jest zatem rutynowo przeprowadzać regresję ważoną. Do takiej analizy przyjmuje się zazwyczaj współczynniki ważenia odwrotnie proporcjonalne do wariancji:

Wi = 1/Var(ri)

Wiele programów regresyjnych pozwala wykonywać opcję analizy regresji ważonej ze współczynnikami ważenia podanymi w tabeli. Dogodnie jest znormalizować współczynniki ważenia przez pomnożenie ich przez n/Σ wi (n jest liczbą punktów danych), tak aby ich suma równała się jedności.

Normalizowanie odpowiedzi

Normalizowanie przez średnią odpowiedź kontrolną stwarza pewne zasadnicze problemy i prowadzi do dość skomplikowanej struktury wariancji. Dzieląc odpowiedzi przez średnią odpowiedź kontrolną w celu uzyskania procentu inhibicji, wprowadza się dodatkowy błąd spowodowany błędem średniej kontrolnej. O ile błąd ten nie jest pomijalnie mały, współczynniki ważenia w regresji i granice ufności należy skorygować pod względem kowariancji za pomocą odpowiedzi kontrolnej (17). Należy zwrócić uwagę, że ważna jest wysoka dokładność oszacowanej średniej odpowiedzi kontrolnej, aby zminimalizować ogólną wariancję dla względnej odpowiedzi. Wariancja ta jest następująca:

dolny indeks i odnosi się do poziomu stężenia i a indeks dolny 0 do odpowiedzi kontrolnych)

Yi = Względna odpowiedź = ri/r0 = 1 – I = f (Ci)

z wariancją:

Var (Yi) = Var (ri/r0) ∂ (∂Yi / ∂ ri)2·Var(ri) + (∂ Yi/ ∂ r0)2·Var (r0)

a ponieważ

(∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 i (∂ Yi / ∂ r0) = ri/r0

2

mając dane o rozkładzie normalnym oraz mi i m0 replikatów:

Var(ri) = σ2/mi

całkowita wariancja względnej odpowiedzi, Yi, staje się zatem:

Var(Yi) = σ2/(r0

2 mi) + ri

2·σ2/r0

4 m0

Błąd średniej kontrolnej jest odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby uśrednionych replikatów kontrolnych i niekiedy może być uzasadnione ujęcie danych historycznych i w ten sposób znaczne zmniejszenie błędu. Alternatywna procedura polega nie na normalizowaniu danych i dopasowaniu bezwzględnych odpowiedzi, w tym danych odpowiedzi kontrolnych, lecz wprowadzeniu, jako dodatkowego parametru, wartości odpowiedzi kontrolnej, która będzie dopasowana za pomocą regresji nieliniowej. Przy zwykle 2-parametrowym równaniu regresji metoda ta stwarza konieczność dopasowania 3 parametrów, a przez to wymaga więcej punktów danych niż nieliniowa regresja danych, które są znormalizowane przy pomocy zadanej odpowiedzi kontrolnej.

Odwrotne przedziały ufności

Obliczanie przedziałów ufności regresji nieliniowej za pomocą odwrotnej estymacji jest dość złożone i nie jest dostępne jako opcja standardowa w zwykłych pakietach statystycznych programów komputerowych. Można otrzymać przybliżone granice ufności za pomocą standardowych programów regresji nieliniowej z reparametryzacją (Bruce i Versteeg, 1992), co polega na przepisaniu równania matematycznego z żądanymi oszacowaniami punktowymi, np. EC10 i EC50, jako parametrami, które mają być oszacowane. (Weźmy funkcję I = f (α, β, stężenie) i wykorzystajmy definicyjne zależności f (α, β, EC10) = 0,1 i f (α, β, EC50) = 0,5, aby w miejsce f (α, β, stężenie) podstawić równoważną funkcję g (EC10, EC50, stężenie)).

Bardziej bezpośrednie obliczenie (Andersen i inni, 1998) przeprowadza się, zachowując pierwotne równanie i stosując rozwinięcie w szereg Taylora wokół średnich ri i r0.

Ostatnio popularne stały się „metody ładowania początkowego” („boot strap methods”). Metody takie wykorzystują zmierzone dane oraz częste powtórne próbkowanie kierowane generatorem liczb losowych do szacowania empirycznego rozkładu wariancji.

Literatura

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.

Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.