Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2015/1375 z dnia 10 sierpnia 2015 r. ustanawiające szczególne przepisy dotyczące urzędowych kontroli w odniesieniu do włośni (Trichinella) w mięsie (tekst jednolity)

Załącznik I

W mocy

Metody wykrywania

ROZDZIAŁ I

REFERENCYJNA METODA WYKRYWANIA

1. Referencyjną metodą wykrywania do celów badania próbek na obecność włośni jest ISO 18743:2015/Amd1:2023.

2. Następujące zasady mają zastosowanie wyłącznie do badania mięsa świń domowych:

a) Z całych tusz świń domowych – z wyjątkiem macior hodowlanych i knurów – pobiera się próbkę o masie przynajmniej 1 g z filaru przepony w przejściu części mięśniowej w część ścięgnistą. Do pobierania próbek można użyć specjalnej pincety pod warunkiem zagwarantowania dokładności pobierania pomiędzy 1,00 a 1,15 g.

W przypadku całych tusz macior hodowlanych i knurów pobiera się większą próbkę o masie przynajmniej 2 g z filaru przepony w przejściu części mięśniowej w część ścięgnistą.

W przypadku braku filarów przepony pobiera się próbkę o masie 2 g z części żebrowej lub części mostkowej przepony lub z mięśni szczęki, języka lub mięśni brzucha świń domowych – z wyjątkiem macior hodowlanych i knurów, a z tych samych tkanek macior hodowlanych i knurów pobiera się próbkę o masie 4 g.

b) W przypadku kawałków mięsa pobiera się próbkę o masie przynajmniej 5 g z mięśni poprzecznie prążkowanych i o małej zawartości tłuszczu, w miarę możliwości z miejsca w pobliżu kości lub ścięgien. Próbkę o tej samej masie należy pobrać z mięsa, które nie będzie poddawane pełnej obróbce cieplnej ani nie jest przeznaczone do innych rodzajów przetwarzania poubojowego.

ROZDZIAŁ II

RÓWNOWAŻNE METODY BADAŃ

Metoda mechanicznie wspomaganego wytrawiania próbki zbiorczej/technika sedymentacji

1. Aparatura oraz odczynniki

a) Nóż lub nożyczki do pobierania próbek.

b) Tacki z oznaczonymi 50 polami, z których każde może pomieścić próbki o masie około 2 g mięsa, lub inne narzędzia zapewniające równorzędne gwarancje w odniesieniu do identyfikacji pochodzenia próbek.

c) Maszynka do mięsa lub malakser elektryczny.

d) Homogenizator Stomacher Lab 3500 thermo model.

e) Plastikowe torebki do homogenizatora Stomacher.

f) Stożkowe rozdzielacze o pojemności 2 litrów, w miarę możliwości zaopatrzone w teflonowe zatyczki bezpieczeństwa.

g) Statywy, pierścienie i uchwyty.

h) Sita z siatką ze stali nierdzewnej, z oczkami 180 mikronów, o średnicy zewnętrznej 11 cm.

i) Lejki o średnicy wewnętrznej nie mniejszej niż 12 cm, do umieszczenia sit.

j) Cylindry miarowe szklane o pojemności 100 ml.

k) Termometr o dokładności 0,5 °C i o zakresie pomiaru 20–70 °C.

l) Wibrator, np. elektryczny potrząsacz z odejmowaną głowicą.

m) Minutnik włączający się i wyłączający się w odstępach jednominutowych.

n) Trychinoskop z poziomym pulpitem lub stereomikroskop optyczny z zespołem lusterkowym oraz źródłem światła o regulowanej intensywności.

o) Płytki Petriego o średnicy około 90 mm, podzielone na kwadraty o boku około 1 cm, lub równoważne wyposażenie do liczenia larw, jak określono w pkt 6.14 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 .

p) Kwas chlorowodorowy 17,5 %.

q) Pepsyna o następującej mocy:

— w postaci proszku lub granulatu: 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadająca 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) oraz 2 000 FIP (Międzynarodowa Federacja Farmacji), lub

— w postaci płynnej: stabilizowana pepsyna płynna – minimum 660 j./ml (Farmakopea Europejska).

Można stosować inną aktywność pepsyny, pod warunkiem że ostateczna aktywność w płynie wytrawiającym jest równoważna aktywności 10 g wynoszącej 1:10 000 NF, jak określono w pkt 5.3 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 .

r) Kilka 10-litrowych zbiorników używanych podczas odkażania sprzętu, np. formaliną, oraz dla pozostałego płynu wytrawiającego w przypadku pozytywnych wyników badań.

s) Skalibrowana waga do ważenia próbek lub pepsyny (dokładność ±0,1 g).

2. Pobieranie próbek do badania metodą wytrawiania i ich gramatura

Jak określono w rozdziale I i w pkt 4.2 normy ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy).

3. Procedura

I. Rozdrabnianie

Wcześniejsze rozdrobnienie próbek mięsa w maszynce do mięsa poprawi jakość wytrawiania. W przypadku stosowania malaksera elektrycznego włącza się go od trzech do czterech razy na około sekundę za każdym razem.

II. Procedura wytrawiania

Procedura ta może dotyczyć próbek zbiorczych (100 g próbek jednocześnie) lub próbek o masie mniejszej niż 100 g.

a) Próbki zbiorcze (100 próbek jednocześnie):

(i) homogenizator Stomacher 3500 jest zaopatrzony w podwójną plastikową torebkę i urządzenie do utrzymywania temperatury na poziomie 40–41 °C;

(ii) półtora litra wody podgrzanej do temperatury 40–41 °C przelewa się do wewnętrznej plastikowej torebki;

(iii) do wody w Stomacherze dodaje się 25 ml 17,5 % kwasu chlorowodorowego;

(iv) następnie dodaje się 100 próbek o masie około 1 g każda (o temperaturze 25–30 °C), pobranych z każdej indywidualnej próbki zgodnie z pkt 2;

(v) na koniec dodaje się 6 g pepsyny lub 18 ml pepsyny płynnej. Należy ściśle przestrzegać wskazanego porządku postępowania, aby uniknąć rozkładu pepsyny;

(vi) następnie Stomacher rozdrabnia zawartość torebki przez 25 minut;

(vii) plastikową torebkę wyjmuje się ze Stomachera, a płyn wytrawiający filtruje się przez sito do 3-litrowej zlewki;

(viii) plastikową torebkę przepłukuje się w około 100 ml wody, którą następnie przelewa się przez sito i na końcu dodaje do przesączu w zlewce;

(ix) jeżeli jest mniej niż 15 indywidualnych próbek, mogą być one dodane do całkowitej próbki zbiorczej składającej się ze 100 próbek i badane razem z tymi próbkami.

b) Próbka zbiorcza złożona z mniej niż 100 próbek:

(i) homogenizator Stomacher 3500 jest zaopatrzony w podwójną plastikową torebkę i urządzenie do utrzymywania temperatury na poziomie 40–41 °C;

(ii) płyn wytrawiający sporządza się przez wymieszanie około półtora litra wody, 25 ml 17,5 % kwasu chlorowodorowego i 6 g pepsyny, przy zachowaniu temperatury 40–41 °C. Należy ściśle przestrzegać wskazanego porządku postępowania, aby uniknąć rozkładu pepsyny;

(iii) z płynu wytrawiającego odmierza się 15 ml na 1 g próbki (np. dla 30 próbek wymagana objętość wynosi 30 × 15 ml = 450 ml) i tę ilość płynu przenosi do dwóch wewnętrznych plastikowych torebek wraz z próbkami mięsa ważącymi około 1 g (o temperaturze 25–30 °C), pobranymi z każdej z indywidualnych próbek zgodnie z pkt 2;

(iv) wodę o temperaturze około 41 °C przelewa się do zewnętrznej torebki, tak aby całkowita objętość w obu torebkach wynosiła półtora litra. Następnie Stomacher rozdrabnia zawartość torebki przez 25 minut;

(v) plastikową torebkę wyjmuje się ze Stomachera, a płyn wytrawiający filtruje się przez sito do 3-litrowej zlewki;

(vi) plastikową torebkę przepłukuje się w około 100 ml wody (w temperaturze 25–30 °C), którą następnie przelewa się przez sito i na końcu dodaje do przesączu w zlewce.

III. Oddzielanie larw metodą sedymentacji

— Lód (o masie 300–400 g w płatkach, łuskach lub pokruszony) dodaje się do płynu wytrawiającego, doprowadzając jego objętość do około 2 litrów. Następnie płyn ten miesza się do chwili rozpuszczenia lodu. W przypadku mniejszych próbek zbiorczych (zob. sekcja II lit. b)) ilość lodu zmniejsza się odpowiednio.

— Wychłodzony płyn wytrawiający przenosi się do dwulitrowego rozdzielacza, wyposażonego w wibrator z dodatkowym uchwytem.

— Sedymentacja powinna trwać 30 minut, przy czym rozdzielacz poddawany jest wibracjom w sposób przerywany, tj. 1 minuta wibracji, po czym następuje 1 minuta przerwy.

— Po 30 minutach sedymentacji 60 ml próbkę osadu przenosi się bezzwłocznie do 100 ml cylindra miarowego (po użyciu rozdzielacz zostaje przemyty roztworem detergentu).

— 60 ml próbkę odstawia się na co najmniej 10 minut, a następnie ciecz sklarowaną nad osadem odsysa się, pozostawiając 15 ml do badania na obecność larw.

— Do odsysania można zastosować strzykawkę jednorazowego użytku połączoną z plastikowym przewodem. Długość przewodu powinna być taka, aby w cylindrze miarowym pozostawało 15 ml, gdy stopka strzykawki spoczywa na krawędzi cylindra.

— Pozostałe 15 ml przelewa się na płytkę Petriego lub równoważne wyposażenie do liczenia larw i bada się pod trychinoskopem lub stereomikroskopem.

— Cylinder miarowy przepłukuje się 5–10 ml wody z kranu, którą następnie dodaje się do próbki.

— Badanie należy wykonywać bezzwłocznie. W żadnym wypadku badania nie można odkładać na dzień następny.

Jeżeli płyny są mętne, należy oczyścić je w następujący sposób:

— końcową próbkę o objętości 60 ml przelewa się do cylindra miarowego i pozostawia na 10 minut. Po upływie tego czasu odsysa się 45 ml cieczy sklarowanej nad osadem, a pozostałe 15 ml uzupełnia się wodą z kranu do 45 ml,

— po upływie następnych 10 minut odsysa się 30 ml cieczy sklarowanej nad osadem, a pozostałe 15 ml przelewa się na płytkę Petriego lub równoważne wyposażenie do liczenia larw i bada się pod trychinoskopem lub stereomikroskopem,

— cylinder miarowy przepłukuje się 10 ml wody z kranu, którą następnie dodaje się do próbki na płytce Petriego lub równoważnym wyposażeniu do liczenia larw i bada się pod trychinoskopem lub stereomikroskopem.

IV. Wyniki dodatnie lub wątpliwe

W przypadku dodatniego lub wątpliwego wyniku badania próbki zbiorczej pobiera się kolejne 20 g próbki od każdej świni, jak określono w pkt 4.2 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej szczegółowych informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy). 20 g próbek z pięciu świń należy połączyć i poddać badaniu za pomocą metody opisanej w niniejszym rozdziale. W ten sposób zostaną przebadane próbki z 20 grup trzody chlewnej, po 5 świń każda. W przypadku wykrycia włośni w próbce zbiorczej od 5 świń, od pojedynczych sztuk z grupy pobiera się dalsze 20 g próbki i każdą z nich poddaje się oddzielnemu badaniu z zastosowaniem metody opisanej w niniejszym rozdziale. Próbki z pasożytami przechowuje się w alkoholu etylowym 70–90 % (końcowe stężenie) w celu konserwacji i identyfikacji na poziomie gatunku w laboratorium referencyjnym UE lub krajowym laboratorium referencyjnym. Procedura dekontaminacji została opisana w pkt 12 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 .

Metoda mechanicznie wspomaganego wytrawiania próbki zbiorczej/technika „izolacji filtrowej”

1. Aparatura oraz odczynniki

Jak określono w sekcji A 1.

Sprzęt dodatkowy:

a) litrowy rozdzielacz Gelmana, wyposażony w uchwyt filtra (średnica 45 mm);

b) filtry składające się z okrągłej siatki ze stali nierdzewnej z oczkami o średnicy 35 mikronów (średnica filtra 45 mm), dwóch gumowych pierścieni grubości 1 mm (średnica zewnętrzna 45 mm, a wewnętrzna 38 mm), okrągłej siatki umocowanej między dwoma gumowymi pierścieniami oraz przymocowanej do nich dwuskładnikowym klejem odpowiednim dla tych materiałów;

c) kolba Erlenmeyera o pojemności 3 litrów, zaopatrzona w boczną rurkę do odsysania;

d) pompka próżniowa;

e) plastikowe torebki o pojemności co najmniej 80 ml;

f) sprzęt do zgrzewania plastikowych torebek;

g) podpuszczka (rennina) o mocy 1:150 000 jednostek Soxleta na 1 g.

2. Pobieranie próbek do badania metodą wytrawiania i ich gramatura

Jak określono w rozdziale I i w pkt 4.2 normy ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy).

3. Procedura

I. Rozdrabnianie

II. Procedura wytrawiania

Procedura ta może dotyczyć próbek zbiorczych (100 g próbek jednocześnie) lub próbek o masie mniejszej niż 100 g.

a) Próbki zbiorcze (100 próbek jednocześnie)

Zob. sekcja A 3 II lit. a).

b) Próbka zbiorcza złożona z mniej niż 100 próbek

Zob. sekcja A 3 II lit. b).

III. Oddzielanie larw przez filtrowanie

a) Lód (o masie 300–400 g w płatkach, łuskach lub pokruszony) dodaje się do płynu wytrawiającego, doprowadzając jego objętość do około 2 litrów. W przypadku mniejszej próbki zbiorczej ilość lodu zmniejsza się odpowiednio.

b) Płyn ten miesza się do chwili rozpuszczenia lodu. Następnie wychłodzony płyn wytrawiający pozostawia się co najmniej na trzy minuty, aby larwy mogły się zwinąć.

c) Rozdzielacz Gelmana, zaopatrzony w uchwyt i filtr umieszcza się na kolbie Erlenmeyera podłączonej do pompki próżniowej.

d) Płyn wytrawiający przelewa się do rozdzielacza Gelmana, a następnie filtruje. Pod koniec filtrowania przechodzenie płynu wytrawiającego przez filtr może być wspomagane zasysaniem z pompki próżniowej. Zasysanie należy przerwać, zanim filtr stanie się suchy, tj. kiedy w rozdzielaczu pozostanie 2–5 ml płynu.

e) Po zakończeniu filtrowania płynu wytrawiającego, filtr wyjmuje się i umieszcza w torebce plastikowej o pojemności 80 ml razem z 15–20 ml roztworu podpuszczki. Roztwór podpuszczki sporządza się przez dodanie 2 g podpuszczki do 100 ml wody z kranu.

f) Torebkę plastikową zgrzewa się dwukrotnie i umieszcza w Stomacherze, między wewnętrzną a zewnętrzną torebką.

g) Stomacher pozostawia się na 3 minuty, niezależnie od tego, czy pracuje na pełnej czy niepełnej próbce zbiorczej.

h) Po trzech minutach torebkę plastikową z filtrem i roztworem podpuszczki wyjmuje się ze Stomachera i otwiera nożyczkami. Płyn przelewa się na płytkę Petriego lub równoważne wyposażenie do liczenia larw. Torebkę natomiast przepłukuje się 5–10 ml wody, którą następnie przelewa się na płytkę Petriego lub równoważne wyposażenie do liczenia larw i bada się pod trychinoskopem lub stereomikroskopem.

i) Badanie należy wykonywać bezzwłocznie. W żadnym wypadku badania nie można odkładać na dzień następny.

Uwaga: Filtry nie mogą być używane, jeśli nie są zupełnie czyste. Nie należy nigdy dopuścić do wysuszenia nieoczyszczonych filtrów. Filtry czyści się przez pozostawienie ich w roztworze podpuszczki na noc. Przed użyciem myje się je w świeżym roztworze podpuszczki z użyciem Stomachera.

IV. Wyniki dodatnie lub wątpliwe

Jak określono w pkt A.3 sekcja IV.

Metoda automatycznego wytrawiania próbek zbiorczych do 35 g

1. Aparatura oraz odczynniki

a) Nóż lub nożyczki do pobierania próbek.

c) Homogenizator Trichomatic 35® z wkładem filtracyjnym.

d) Kwas chlorowodorowy 8,5 ± 0,5 % masy.

e) Przezroczyste filtry membranowe poliwęglanowe o średnicy 50 mm i rozmiarze porów 14 mikronów.

f) Pepsyna o następującej mocy:

— w postaci proszku lub granulatu: 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadająca 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) oraz 2 000 FIP (Międzynarodowa Federacja Farmacji), lub

— w postaci płynnej: stabilizowana pepsyna płynna – minimum 660 j./ml (Farmakopea Europejska).

ISO 18743:2015/Amd1:2023 .

g) Skalibrowana waga do ważenia próbek lub pepsyny (dokładność ±0,1 g).

h) Pinceta z płaskimi końcówkami.

i) Kilka szkiełek mikroskopowych o długości boku co najmniej 5 cm lub kilka płytek Petriego o średnicy co najmniej 6 cm podzielonych od spodu na pola do badań 10 × 10 mm przy użyciu spiczastego przyrządu.

j) Stereomikroskop optyczny z zespołem lusterkowym (powiększenie 15–60 razy) lub trichinoskop ze stołem poziomym.

k) Zbiornik do zlewania odpadów płynnych.

l) Kilka 10-litrowych zbiorników używanych podczas odkażania sprzętu (np. formaliną) oraz dla pozostałego płynu wytrawiającego w przypadku pozytywnych wyników badań.

m) Termometr o dokładności 0,5 °C i o zakresie pomiaru 20–70 °C.

2. Pobieranie próbek do badania metodą wytrawiania i ich gramatura

Jak określono w rozdziale I i w pkt 4.2 normy ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy).

3. Procedura

I. Procedura wytrawiania

a) Umieścić wkład filtracyjny w malakserze, podłączyć rurkę odpływową i umieścić jej drugi koniec w zbiorniku do zlewania odpadów płynnych.

b) Po włączeniu malaksera rozpocznie się podgrzewanie.

c) Przed rozpoczęciem pracy zawór, umieszczony pod komorą reakcyjną, należy otworzyć i zamknąć.

d) Następnie dodać do 35 próbek o masie około 1 g każda (przy temperaturze 25–30 °C) pobranych z każdej indywidualnej próbki, zgodnie z pkt 2. Upewnić się, że większe kawałki ścięgien są usunięte, ponieważ w przeciwnym wypadku może nastąpić zatkanie filtra membranowego.

e) Komorę płynów podłączoną do malaksera napełnić wodą do krawędzi (ok. 400 ml).

f) Do mniejszej komory płynów połączonej z malakserem wlać około 30 ml kwasu chlorowodorowego (8,5 %) do krawędzi.

g) Umieścić filtr membranowy pod filtrem wstępnym w uchwycie znajdującym się we wkładzie filtracyjnym.

h) Na koniec dodać 7 g pepsyny lub 21 ml pepsyny płynnej. Należy ściśle przestrzegać wskazanego porządku postępowania, aby uniknąć rozkładu pepsyny.

i) Zamknąć pokrywy komory reakcyjnej i komory płynów.

j) Wybrać okres trawienia. Krótki okres trawienia (5 minut) dla próbek pobranych od świń ubitych w zwyczajowym wieku uboju i przedłużony okres trawienia (8 minut) dla pozostałych próbek.

k) Po naciśnięciu przycisku „start” w malakserze proces dozowania i trawienia rozpoczyna się automatycznie, a po nim następuje filtracja. Po 10–13 minutach proces jest zakończony i zatrzymuje się automatycznie.

l) Otwórz pokrywę komory reakcji po sprawdzeniu, że jest ona pusta. Jeśli na dnie komory widać pozostałości piany lub płynu wytrawiającego, powtórzyć procedurę zgodnie z sekcją V.

II. Oddzielanie larw

a) Zdjąć uchwyt filtra i przenieść filtr membranowy na szkiełko mikroskopowe lub płytkę Petriego.

b) Zbadać filtr membranowy przy użyciu stereomikroskopu lub trychinoskopu.

III. Sprzęt do czyszczenia

a) W przypadku dodatnich wyników badania napełnić komorę reakcji malaksera wrzącą wodą do pojemności dwóch trzecich. Do podłączonej komory płynów wlewać wodę z kranu do momentu przykrycia dolnego czujnika. Następnie odbywa się czyszczenie automatyczne. Odkazić pojemnik na filtr i cały pozostały sprzęt, np. przy użyciu formaliny.

b) Po zakończeniu pracy na dany dzień wypełnić komorę płynów malaksera wodą i przeprowadzić cykl standardowy.

IV. Użycie filtrów membranowych

Każdy poliwęglanowy filtr membranowy może być użyty nie więcej niż pięć razy. Filtr należy obrócić po każdym użyciu. Dodatkowo filtr należy sprawdzić po każdym użyciu pod kątem wszelkich uszkodzeń, które uniemożliwiałyby jego dalsze używanie.

V. Postępowanie w przypadku niekompletnego trawienia i niemożności przeprowadzenia filtracji.

Po przeprowadzeniu automatycznego cyklu malaksera zgodnie z sekcją I otworzyć pokrywę komory reakcyjnej i sprawdzić, czy na jej dnie widać pozostałości piany lub płynu wytrawiającego. Jeżeli tak, należy postępować w sposób następujący:

a) zamknąć dolny zawór pod komorą reakcyjną;

b) zdjąć uchwyt filtra i przenieść filtr membranowy na szkiełko mikroskopowe lub płytkę Petriego;

c) włożyć nowy filtr membranowy do uchwytu filtra i założyć uchwyt;

d) wypełnić komorę płynów malaksera wodą do momentu przykrycia dolnego czujnika;

e) przeprowadzić automatyczny program czyszczenia;

f) po zakończeniu programu czyszczenia otworzyć pokrywę komory reakcyjnej i sprawdzić obecność pozostałości płynu;

g) jeśli komora jest pusta, zdjąć uchwyt filtra i przenieść filtr membranowy pincetą na szkiełko mikroskopowe lub płytkę Petriego;

h) zbadać dwa filtry membranowe zgodnie z sekcją II. Jeśli nie można zbadać filtrów, powtórzyć cały proces trawienia w przedłużonym czasie trawienia, zgodnie z sekcją I.

VI. Wyniki dodatnie lub wątpliwe

Jak określono w pkt A.3 sekcja IV.

Metoda wytrawiania próbki zbiorczej z zastosowaniem metody magnetycznego mieszania/„izolacja na filtrze” i wykrywanie larw testem aglutynacji lateksowej

Metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w odniesieniu do badania mięsa świń domowych.

1. Aparatura oraz odczynniki

a) Nóż lub nożyczki i pinceta do pobierania próbek.

c) Malakser z ostrym tnącym ostrzem. Jeżeli próbki są większe niż 3 g, należy użyć maszynki do mięsa z otworami o wymiarach 2–4 mm lub nożyczek. W przypadku mięsa zamrożonego lub mięśni języka (po usunięciu warstwy wierzchniej, która nie ulega wytrawieniu) potrzebna jest maszynka do mięsa, a rozmiar próbki należy znacznie zwiększyć.

d) Mieszadła magnetyczne, z płytką grzejną o temperaturze regulowanej termostatem i pokrytymi teflonem mieszadełkami, o długości około 5 cm.

e) Szklane zlewki o pojemności 3 litrów.

f) Sita ze stali nierdzewnej o średnicy oczek 180 mikronów i średnicy zewnętrznej 11 cm.

g) Stalowy aparat do filtracji na filtry z siatką 20 μm z lejkiem stalowym.

h) Pompka próżniowa.

i) Zbiorniki z metalu lub tworzywa sztucznego o pojemności 10–15 litrów do zbierania płynu trawiącego.

j) Wytrząsarka 3D.

k) Folia aluminiowa.

l) Kwas chlorowodorowy 25 %.

m) Pepsyna o następującej mocy:

— w postaci proszku lub granulatu: 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadająca 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) oraz 2 000 FIP (Międzynarodowa Federacja Farmacji), lub

— w postaci płynnej: stabilizowana pepsyna płynna – minimum 660 j./ml (Farmakopea Europejska).

ISO 18743:2015/Amd1:2023 .

n) Woda z kranu podgrzana do temperatury 46–48 °C.

o) Skalibrowana waga do ważenia próbek lub pepsyny (dokładność ±0,1 g).

p) Pipety wielowymiarowe (1, 10 i 25 ml), mikropipety zgodnie z instrukcjami producenta testu aglutynacji lateksowej oraz uchwyty do pipet.

q) Filtry nylonowe z siatką o średnicy oczek 20 mikronów i o średnicy dopasowanej do systemu filtracji.

r) Pinceta z tworzywa sztucznego lub stali 10–15 cm.

s) Probówki stożkowe o pojemności 15 ml.

t) Tłuczek o teflonowym lub stalowym zakończeniu w kształcie stożka pasujący do probówek stożkowych.

u) Termometr o dokładności 0,5 °C i o zakresie pomiaru 20–70 °C.

v) Karty zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011.

w) Roztwór buforowy ze środkiem konserwującym (rozcieńczalnik) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011.

x) Roztwór buforowy z dodanym środkiem konserwującym (kontrola ujemna) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011.

y) Roztwór buforowy z dodanymi antygenami Trichinella spiralis i środkiem konserwującym (kontrola dodatnia) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011.

z) Roztwór buforowy z cząstkami polistyrenu powleczonymi przeciwciałami z dodanym środkiem konserwującym (kuleczki lateksowe) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011.

aa) Pałeczki jednorazowego użytku.

2. Pobieranie próbek do badania metodą wytrawiania i ich gramatura

Jak określono w rozdziale I i w pkt 4.2 normy ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy).

3. Procedura

I. W przypadku próbek zbiorczych (100 g próbek jednocześnie)

a) 16 ± 0,5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 25 % (końcowe 0,2 %) dodać do zlewki o pojemności 3 litrów zawierającej 2,0 litra ± 200 ml wody z kranu podgrzanej do temperatury 46–48 °C; w zlewce umieszcza się mieszadełko, zlewkę umieszcza się na podgrzanej płytce grzejnej i zaczyna się proces mieszania.

b) Dodać 10 ± 1 g pepsyny w proszku (lub 30 ± 3 ml płynnej pepsyny).

c) Rozdrobnić 100–115 g próbek pobranych zgodnie z pkt 2 w malakserze wraz z 150 ml ± 15 ml podgrzanego buforu do trawienia.

d) Rozdrobnione mięso przenosi się do zlewki o pojemności 3 litrów, zawierającej wodę, pepsynę i kwas chlorowodorowy.

e) Nóż malaksera należy wielokrotnie przepłukać w płynie wytrawiającym znajdującym się w zlewce, a pojemnik malaksera przemyć niewielką ilością płynu wytrawiającego w celu usunięcia przyczepionych skrawków mięsa.

f) Zlewkę przykrywa się folią aluminiową.

g) Mieszadło magnetyczne należy wyregulować, tak aby utrzymywało stałą temperaturę 44–46 °C podczas całego procesu. Podczas procesu mieszania płyn wytrawiający musi wirować z dostatecznie dużą prędkością, aby uzyskać głęboki wir bez rozpryskiwania.

h) Płyn wytrawiający mieszany jest aż do rozpuszczenia kawałków tkanki mięśniowej (około 30 minut). Następnie mieszadło wyłącza się, a płyn wytrawiający przelewa się przez sito do rozdzielacza sedymentacyjnego. Przy wytrawianiu niektórych rodzajów mięsa (języka, dziczyzny itp.) może być konieczny dłuższy czas wytrawiania (nieprzekraczający 60 minut).

i) Proces wytrawiania uznaje się za zadowalający, jeżeli na sicie pozostaje nie więcej niż 5 % początkowej masy próbki.

j) W uchwycie filtra umieścić filtr nylonowy z siatką o średnicy oczek 20 mikronów. Do uchwytu z blokadą przymocować stożkowy filtracyjny lejek stalowy, a na lejku umieścić stalowe sito o średnicy oczek 180 mikronów. Pompkę próżniową łączy się z uchwytem filtra i ze zbiornikiem z metalu lub tworzywa sztucznego, do którego zbiera się płyn wytrawiający.

k) Zatrzymać mieszanie i wlać płyn wytrawiający do lejka przez sito. Zlewkę przepłukać ciepłą wodą w ilości około 250 ml. Po skutecznym przefiltrowaniu płynu wytrawiającego płyn do płukania wlać do stacji filtracyjnej.

l) Filtr membranowy chwycić pincetą za krawędź. Filtr membranowy złożyć co najmniej na cztery i umieścić w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Probówki stożkowe muszą być dopasowane do kształtu tłuczka.

m) Filtr membranowy umieścić na dnie probówki stożkowej o pojemności 15 ml za pomocą tłuczka i docisnąć około 20-krotnie tłuczkiem, zdecydowanymi ruchami w przód i w tył, przy czym tłuczek powinien być umieszczony w środku złożonej membrany, zgodnie z instrukcją producenta.

n) Dodać 0,5 ml ± 0,01 ml rozcieńczalnika próbki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety i homogenizować filtr membranowy za pomocą tłuczka powtarzalnymi ruchami o małej amplitudzie w przód i w tył przez około 30 sekund, unikając gwałtownych ruchów, aby ograniczyć rozpryskiwanie cieczy, zgodnie z instrukcją producenta.

o) Każdą próbkę, kontrolę ujemną i kontrolę dodatnią umieścić na różnych polach karty aglutynacyjnej za pomocą pipety, zgodnie z instrukcją producenta.

p) Nanieść kuleczki lateksowe na każde pole karty aglutynacyjnej za pomocą pipety, zgodnie z instrukcją producenta, tak by nie zetknęły się z próbkami i kontrolami. Następnie mieszać kuleczki lateksowe delikatnie na każdym polu patyczkiem jednorazowego użytku do momentu pokrycia przez homogeniczną ciecz całego pola.

q) Umieścić płytkę do aglutynacji na wytrząsarce 3D i poddać mieszaniu przez 10 ± 1 minut, zgodnie z instrukcjami producenta.

r) Przerwać mieszanie po upływie czasu określonego w instrukcji producenta, a kartę aglutynacyjną położyć na gładkiej powierzchni i odczytać natychmiast wyniki reakcji, zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku próbki dodatniej muszą pojawić się skupiska strątów. W przypadku próbki ujemnej zawiesina pozostaje jednorodna, a skupiska strątów nie pojawiają się.

II. Próbka zbiorcza składająca się z mniej niż 100 g, jak określono w pkt 8 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023

W razie potrzeby można dodać maksymalnie 15 g do 100 g całkowitej próbki zbiorczej i badać razem z tymi próbkami zgodnie z sekcją I. Próbki o masie większej niż 15 g muszą być badane jako próbka zbiorcza. Dla próbek zbiorczych o masie do 50 g objętość płynu wytrawiającego i składników można zredukować do 1 litra wody, 8 ml kwasu chlorowodorowego i 5 g pepsyny.

III. Wyniki dodatnie lub wątpliwe

W przypadku gdy badanie próbki zbiorczej testem aglutynacji lateksowej daje wynik dodatni lub wątpliwy, pobiera się kolejne 20 g próbki od każdej świni zgodnie z pkt 4.2 normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 (aby uzyskać więcej szczegółowych informacji, zob. również załączniki A i B do tej normy). 20 g próbek od pięciu świń należy połączyć i poddać badaniu metodą opisaną w sekcji I. W ten sposób należy przebadać próbki od 20 grup po pięć świń każda.

W przypadku uzyskania dodatniego wyniku testu aglutynacji lateksowej przeprowadzonego na grupie pięciu świń należy pobrać dalsze 20 g próbki od pojedynczych świń w tej grupie i każdą poddać oddzielnemu badaniu przy zastosowaniu metody opisanej w sekcji I.

W przypadku uzyskania dodatniego lub wątpliwego wyniku testu aglutynacji lateksowej należy przesłać do krajowego laboratorium referencyjnego przynajmniej 20 g tkanki mięśniowej świni w celu potwierdzenia wyniku przy wykorzystaniu normy

ISO 18743:2015/Amd1:2023 lub jednej z równoważnych metod opisanych powyżej.

Próbki z pasożytami przechowuje się w alkoholu etylowym 70–90 % (końcowe stężenie) w celu konserwacji i identyfikacji na poziomie gatunku w laboratorium referencyjnym UE lub krajowym laboratorium referencyjnym.

Po zebraniu pasożytów płyny dodatnie należy poddać dekontaminacji przez podgrzanie do co najmniej 60 °C.

IV. Procedura czyszczenia i dekontaminacji po uzyskaniu wyniku dodatniego lub wątpliwego

W przypadku dodatniego lub wątpliwego wyniku badania próbki zbiorczej lub indywidualnej testem aglutynacji lateksowej wszystkie materiały mające styczność z mięsem (pojemnik i ostrze malaksera, tłuczek, zlewka, mieszadełko, czujnik temperatury, lejek stożkowy, sito i pincety) muszą zostać poddane starannej dekontaminacji poprzez moczenie w ciepłej wodzie (65–90 °C) przez kilka sekund. Resztki mięsa lub inaktywowane larwy, które ewentualnie zostały na powierzchni tych materiałów, można usunąć za pomocą czystej gąbki i wody z kranu. W razie potrzeby można dodać kilka kropel detergentu w celu odtłuszczenia wyposażenia. Zaleca się następnie dokładne przepłukanie każdej sztuki wyposażenia w celu usunięcia wszelkich pozostałości detergentu.

Test sztucznego trawienia do wykrywania in vitro larw włośni w próbkach mięsa, PrioCHECK®

Trichinella AAD Kit

Metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w odniesieniu do badania mięsa świń domowych.

Test PrioCHECK®

Trichinella AAD Kit stosuje się zgodnie z instrukcją do tego testu, przy zastosowaniu rozdzielaczy (Lenz NS 29/32) oraz szklanej probówki 80 ml.

Zautomatyzowane wykrywanie włośni (Trichinella spp.) metodą lumiVAST Trichinella

Metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w przypadku badania mięsa świń domowych.

Przygotowanie i analizę próbek należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Wszystkie przyrządy stosowane w tej metodzie muszą być kalibrowane i konserwowane zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta (producentów).

Jeżeli wynik badania próbki zbiorczej jest dodatni lub wątpliwy, od każdej świni należy pobrać kolejną próbkę o masie 20 g z filaru przepony lub z innej tkanki zgodnie z rozdziałem I.

Próbki o masie 20 g pobrane od pięciu świń należy połączyć i zbadać przy użyciu tej samej metody.

W przypadku uzyskania dodatniego wyniku z grupy pięciu świń należy pobrać kolejną próbkę o masie 20 g od pojedynczych świń w tej grupie i każdą z nich należy poddać oddzielnemu badaniu przy użyciu tej samej metody.

W przypadku uzyskania dodatniego lub wątpliwego wyniku należy przesłać przynajmniej 20 g tkanki mięśniowej świni do krajowego laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia wyniku przy użyciu metody referencyjnej ustanowionej w rozdziale I.

Próbki pasożytów należy przechowywać w alkoholu etylowym 70–90 % w celu konserwacji i identyfikacji na poziomie gatunku w laboratorium referencyjnym UE lub krajowym laboratorium referencyjnym.

Tekst urzędowy w EUR-Lex. Lexeva pokazuje treść przepisu, nie udziela porad prawnych. Moc prawną ma wyłącznie tekst opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.