Załącznik IV

„ZAŁĄCZNIK IV

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI POZIOMU DOPUSZCZONYCH DODATKÓW W PASZACH

A. OZNACZANIE WITAMINY A

Witamina A ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17547 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie zawartości witaminy A, E i D (1) – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z oczyszczaniem (HPLC) za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub fluorescencyjnego, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy A (retinolu) w paszy. Metoda pozwala na oznaczenie witaminy A obejmującej wszystkie formy alkoholowe trans-retinolu i wszystkie jej izomery cis. Zawartość witaminy A jest wyrażana w jednostkach międzynarodowych (IU) na kg. Jedna IU odpowiada aktywności 0,300 μg wszystkich form alkoholowych trans-witaminy A lub 0,344 μg wszystkich form octanowych trans-witaminy A lub 0,550 μg wszystkich form palmitynianowych trans-witaminy A.

Granica oznaczalności metody wynosi 2 000 IU witaminy A/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana w etanolowym roztworze wodorotlenku potasu, a witamina A ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy A jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub detektora fluorescencyjnego. Parametry chromatograficzne zostały tak dobrane, że nie zachodzi rozdział pomiędzy wszystkimi formami alkoholowymi trans-witaminy A i jej izomerami cis.

3. Odczynniki

3.1.

Etanol, σ = 96 %

3.2.

Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia 40–60 °C

3.3.

Metanol

3.4.

Roztwór wodorotlenku potasu, c = 50 g/100 ml

3.5.

Roztwór askorbinianu sodu, c = 10 g/100 ml (zob. objaśnienia pkt 7.7)

3.6.

Siarczek sodu, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1.

Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, ß = 120 g/l (dla x = 9) (zob. objaśnienia pkt 7.8)

3.7.

Roztwór fenoloftaleiny, c = 2 g/100 ml w etanolu (pkt 3.1)

3.8.

2-propanol

3.9.

Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.10.

Azot wolny od tlenu

3.11.

Wszystkie formy octanowe trans-witaminy A, ekstra czyste, o certyfikowanej aktywności, np. 2,80 × 106 IU/g

3.11.1.

Roztwór podstawowy wszystkich form octanowych trans-witaminy A: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg octanu witaminy A (pkt 3.11) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (pkt 3.8) i uzupełnić do pełnej objętości tym samym rozpuszczalnikiem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 1 400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość oznacza się w sposób określony w pkt 5.6.3.1.

3.12.

Wszystkie formy palmitynianowe trans-witaminy A, ekstra czyste, o certyfikowanej aktywności, np. 1,80 × 106 IU/g

3.12.1.

Roztwór podstawowy wszystkich form palmitynianowych trans-witaminy A: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 80 mg palmitynianu witaminy A (pkt 3.12) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (pkt 3.8) i uzupełnić do pełnej objętości tym samym rozpuszczalnikiem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 1 400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość oznacza się w sposób określony w pkt 5.6.3.2.

3.13.

2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (BHT) (zob. objaśnienia pkt 7.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Próżniowa wyparka rotacyjna

4.2.

Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1.

Kolby płaskodenne lub stożkowe o pojemności 500 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.2.2.

Kolby miarowe o wąskich szyjkach o pojemnościach 10, 25, 100 i 500 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.3.

Rozdzielacze stożkowe o pojemności 1 000 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.4.

Kolby gruszkowe o pojemności 250 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.3.

Chłodnica kulkowa o długości płaszcza 300 mm, ze szlifem szklanym, z nasadką do podłączenia gazu

4.4.

Sączek karbowany do rozdzielania faz o średnicy 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.

Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm lub równoważna (kryterium wydajności: pojedynczy pik dla wszystkich izomerów retinolu w warunkach HPLC)

4.5.2.

Detektor UV lub fluorescencyjny, z regulacją długości fali

4.6.

Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami o długości drogi optycznej 10 mm

4.7.

Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8.

Aparat ekstrakcyjny (zob. rys. 1) zawierający:

4.8.1.

Szklany cylinder o pojemności 1 l, z szyjką ze szlifem i z korkiem

4.8.2.

Nasadkę szklaną ze szlifem z ramieniem i ruchomą nastawną rurką przesuwającą się przez środek nasadki. Nastawna rurka musi mieć zakończenie w kształcie litery U na dole i ujście na górze, tak aby górna warstwa cieczy w cylindrze mogła być przeniesiona do rozdzielacza.

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina A jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1. Przygotowanie próbki

Zmielić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 1 mm, uważając, aby podczas mielenia nie wydzielało się ciepło. Mielenie musi być przeprowadzone tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić straty witaminy A. Próbki nie należy mielić, jeżeli rozkład wielkości cząstek jest odpowiedni (np. premiksy i dodatki paszowe).

5.2. Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy A zważyć, z dokładnością do 1 mg, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1). W przypadku niskich stężeń masa próbki może zostać zwiększona w celu uzyskania wystarczającej ilości cząstek w naważce. Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (pkt 3.1), około 100 mg BHT (pkt 3.13), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (pkt 3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (pkt 3.6). Założyć chłodnicę (pkt 4.3) na kolbę i umieścić kolbę w łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (pkt 4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez pięć minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4) przez chłodnicę (pkt 4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając w trakcie powolnego przepływu strumienia azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3. Ekstrakcja

Przenieść ilościowo, dekantując, zmydlony roztwór, spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3) lub do aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (pkt 3.1) i 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu ekstrakcyjnego. Proporcja wody i etanolu w łąc_zonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1. Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza (pkt 4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (zob. objaśnienia pkt 7.3) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (pkt 4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie z użyciem 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i dwukrotnie z użyciem 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu 100 ml porcjami wody, ostrożnie mieszając, aby zapobiec powstawaniu emulsji, a następnie, wielokrotnie wstrząsając, powtórzyć przemywanie kolejnymi 100 ml porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (pkt 3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). Aby usunąć suspensję wodną, filtrować przemyty ekstrakt przez suchy karbowany filtr do rozdzielania faz (pkt 4.4) do kolby miarowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.2). Spłukać rozdzielacz i filtr przy użyciu 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), uzupełnić do pełnej objętości kolby eterem naftowym (pkt 3.2) i dobrze zmieszać.

5.3.2. Ekstrakcja przy użyciu aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (zob. objaśnienia pkt 7.3), zastąpić korek szklanego cylindra (pkt 4.8.1) nasadką ze szlifem (pkt 4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez aplikację ciśnienia azotu dopływającego przez ramię nasadki przenieść eter naftowy z górnej warstwy do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3). Do szklanego cylindra dodać 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), zamknąć i dobrze wstrząsnąć. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza w sposób opisany powyżej. Powtórzyć postępowanie ekstrakcyjne, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), a następnie stosując dwukrotnie porcję 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), i dodać warstwy eteru naftowego do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego w sposób określony w pkt 5.3.1 i postępować w sposób tam określony.

5.4. Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (pkt 4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na wyparce rotacyjnej (pkt 4.1) przy obniżonym ciśnieniu w temperaturze łaźni nie wyższej niż 40 °C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (pkt 3.10) i zdjąć kolbę z wyparki rotacyjnej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.10) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości (10–100 ml) metanolu (pkt 3.3) (stężenie witaminy A musi wynosić od 5 IU/ml do 30 IU/ml).

5.5. Oznaczanie HPLC

Witamina A jest rozdzielana na kolumnie w odwróconym układzie faz C18 (pkt 4.5.1), a stężenie jest mierzone z użyciem detektora UV (325 nm) lub detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie: 325 nm; emisja: 475 nm) (pkt 4.5.2).

Zadozować podwielokrotną część roztworu metanolowego (np. 20 μl) otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4 i wymywać fazą ruchomą (pkt 3.9). Obliczyć średnią wysokość (powierzchnię) piku kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (pkt 5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.5.1):

250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważne

Faza ruchoma (pkt 3.9):

mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody np. 980 + 20 (v + v)

Prędkość przepływu:

1–2 ml/min

Detektor (pkt 4.5.2):

detektor UV (325 nm) lub detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 325 nm/emisja: 475 nm)

5.6. Kalibracja

5.6.1. Przygotowanie roboczych roztworów wzorcowych

Pobrać pipetą 20 ml podstawowego roztworu octanowej witaminy A (pkt 3.11.1) lub 20 ml podstawowego roztworu palmitynianowej witaminy A (pkt 3.12.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2, lecz bez dodawania BHT. Następnie ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (pkt 3.2). Odparować prawie do sucha 100 ml tego ekstraktu na wyparce rotacyjnej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.10) i ponownie rozpuścić pozostałość w 10,0 ml metanolu (pkt 3.3). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 560 IU witaminy A w 1 ml. Należy oznaczyć dokładną zawartość w sposób określony w pkt 5.6.3.3. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

Przenieść pipetą 2,0 ml tego roboczego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 20 ml, uzupełnić metanolem (pkt 3.3) do pełnej objętości kolby i zmieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego wynosi 56 IU witaminy A na 1 ml.

5.6.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 5,0 i 10,0 ml rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,8, 5,6, 14,0 i 28,0 IU witaminy A na 1 ml.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną, uwzględniając wyniki kontroli UV (pkt 5.6.3.3).

5.6.3. Standaryzacja UV roztworów wzorcowych

5.6.3.1. Roztwór podstawowy octanowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego octanowej witaminy A (pkt 3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A w 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu octanowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

5.6.3.2. Roztwór podstawowy palmitynianowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego palmitynianowej witaminy A (pkt 3.12.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A w 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu palmitynianowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

5.6.3.3. Roboczy roztwór wzorcowy witaminy A

Pobrać pipetą 3,0 ml nierozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego witaminy A, przygotowanego w sposób określony w pkt 5.6.1, do kolby miarowej o pojemności 50 ml (pkt 4.2.2) i uzupełnić 2-propanolem (pkt 3.8) do pełnej objętości kolby. Pobrać pipetą 5,0 ml tego roztworu do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (pkt 3.8). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A w 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (pkt 3.8) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy A roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w IU/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.6.2).

Zawartość witaminy A w IU/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w IU/ml witaminy A w roztworze próbki (pkt 5.4)

V1

=

objętość w ml roztworu próbki (pkt 5.4)

V2

=

objętość w ml pobranej podwielokrotnej części, o której mowa w pkt 5.4

m

=

masa naważki w g

7. Objaśnienia

7.1.

W przypadku próbek o niskim stężeniu witaminy A jest wskazane połączenie ekstraktów eteru naftowego dwóch zmydlanych naważek (o masie 25 g każda) w jeden roztwór próbki przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2.

Próbka pobrana do analizy nie może zawierać więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3.

Jeżeli nie dochodzi do rozdzielenia faz, dodać około 10 ml etanolu (pkt 3.1), aby rozwarstwić emulsję.

7.4.

W przypadku oleju z wątroby dorsza i innych czystych tłuszczów czas zmydlania należy przedłużyć do 45–60 minut.

7.5.

Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6.

Przy zastosowaniu kolumny do chromatografii w normalnym układzie faz możliwe jest oddzielenie izomerów retinolu. W tym wypadku do obliczeń sumuje się jednak wysokości (powierzchnie) pików wszystkich izomerów trans i cis.

7.7.

Zamiast roztworu askorbinianu sodu można zastosować około 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8.

Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

7.9.

W przypadku analizy witaminy A w preparatach mlekozastępczych należy zwrócić szczególną uwagę na:

— zmydlanie (pkt 5.2): ze względu na zawartość tłuszczu w próbce konieczne może być zwiększenie ilości roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4),

— ekstrakcję (pkt 5.3): ze względu na obecność emulsji konieczne może być dostosowanie proporcji wody i etanolu wynoszącej 2:1.

Aby sprawdzić, czy zastosowana metoda analizy daje wiarygodne wyniki w odniesieniu do tej konkretnej matrycy (preparat mlekozastępczy), na dodatkowej naważce należy przeprowadzić test odzysku. Jeżeli stopień odzysku jest niższy niż 80 %, wyniki analizy należy skorygować o odzysk.

8. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego (2)

Premiks

Pasza z premiksem

Mieszanka paszowa mineralna

Pasza białkowa

Pasza dla prosiąt

L

13

12

13

12

13

n

48

45

47

46

49

średnia [IU/kg]

17,02 × 106

1,21 × 106

537 100

151 800

18 070

sr [IU/kg]

0,51 × 106

0,039 × 106

22 080

12 280

682

r [IU/kg]

1,43 × 106

0,109 × 106

61 824

34 384

1 910

CVr [%]

3,0

3,5

4,1

8,1

3,8

sR [IU/kg]

1,36 × 106

0,069 × 106

46 300

23 060

3 614

R [IU/kg]

3,81 × 106

0,193 × 106

129 640

64 568

10 119

CVR [%]

8,0

6,2

8,6

15

20

L:

liczba laboratoriów

n:

liczba pojedynczych wartości

sr:

odchylenie standardowe powtarzalności

sR:

odchylenie standardowe odtwarzalności

r:

powtarzalność

R;

odtwarzalność

CVr:

współczynnik zmienności powtarzalności

CVR:

współczynnik zmienności odtwarzalności

Rysunek 1

Aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

B. OZNACZANIE WITAMINY E

Witamina E ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17547 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie zawartości witaminy A, E i D (3) – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z oczyszczaniem (HPLC) za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub fluorescencyjnego, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy E w paszy. Zawartość witaminy E jest wyrażana w mg octanu DL-α-tokoferolu na kg. 1 mg octanu DL-α-tokoferolu odpowiada 0,91 mg DL-α-tokoferolu (witamina E).

Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg witaminy E/kg. Granica oznaczalności jest osiągalna jedynie przy pomocy detektora fluorescencyjnego. W przypadku detektora UV granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana etanolowym roztworem wodorotlenku potasu, a witamina E jest ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy E jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z zastosowaniem detektora UV lub detektora fluorescencyjnego.

3. Odczynniki

3.1.

Etanol, σ = 96 %

3.2.

Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia 40–60 °C

3.3.

Metanol

3.4.

Roztwór wodorotlenku potasu, c = 50 g/100 ml

3.5.

Roztwór askorbinianu sodu, c = 10 g/100 ml (zob. objaśnienia pkt 7.7)

3.6.

Siarczek sodu, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1.

Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, β = 120 g/l (dla x = 9) (zob. objaśnienia pkt 7.8)

3.7.

Roztwór fenoloftaleiny, c = 2 g/100 ml w etanolu (pkt 3.1)

3.8.

Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.9.

Azot wolny od tlenu

3.10.

Octan DL-α-tokoferolu ekstra czysty, o certyfikowanej aktywności

3.10.1.

Roztwór podstawowy octanu DL-α-tokoferolu: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (pkt 3.1) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg octanu DL-α-tokoferolu (kontrola UV – zob. pkt 5.6.1.3; stabilizacja – zob. objaśnienia pkt 7.4).

3.11.

DL-α-tokoferol ekstra czysty, o certyfikowanej aktywności

3.11.1.

Roztwór podstawowy DL-α-tokoferolu: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferolu (pkt 3.11) do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (pkt 3.1) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg DL-α-tokoferolu (kontrola UV – zob. pkt 5.6.2.3; stabilizacja – zob. objaśnienia pkt 7.4).

3.12.

2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (BHT) (zob. objaśnienia pkt 7.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Obrotowa wyparka warstwowa

4.2.

Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1.

Kolby płaskodenne lub stożkowe o pojemności 500 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.2.2.

Kolby miarowe o wąskich szyjkach o pojemnościach 10, 25, 100 i 500 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.3.

Rozdzielacze stożkowe o pojemności 1 000 ml, ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.2.4.

Kolby gruszkowe o pojemności 250 ml, ze szlifem szklanym wewnętrznym

4.3.

Chłodnica kulkowa o długości płaszcza 300 mm, ze szlifem szklanym, z nasadką do podłączenia gazu

4.4.

Sączek karbowany do rozdzielania faz o średnicy 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.

Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm lub równoważna

4.5.2.

Detektor UV lub fluorescencyjny, z regulacją długości fali

4.6.

Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami o długości drogi optycznej 10 mm

4.7.

Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8.

Aparat ekstrakcyjny (zob. rys. 1) zawierający:

4.8.1.

Szklany cylinder o pojemności 1 l, z szyjką ze szlifem i z korkiem

4.8.2.

Nasadkę szklaną ze szlifem z ramieniem i ruchomą nastawną rurką przesuwającą się przez środek nasadki. Nastawna rurka musi mieć zakończenie w kształcie litery U na dole i ujście na górze, tak aby górna warstwa cieczy w cylindrze mogła być przeniesiona do rozdzielacza.

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina E jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1. Przygotowanie próbki

Zmielić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 1 mm, uważając, aby podczas mielenia nie wydzielało się ciepło. Mielenie musi być przeprowadzone tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić straty witaminy E.

5.2. Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy E odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1). Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (pkt 3.1), około 100 mg BHT (pkt 3.12), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (pkt 3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (pkt 3.6). Założyć chłodnicę (pkt 4.3) na kolbę i umieścić kolbę na łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (pkt 4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.4) przez chłodnicę (pkt 4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając w trakcie powolnego przepływu strumienia azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3. Ekstrakcja

Przenieść ilościowo, dekantując, zmydlony roztwór, spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3) lub do aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (pkt 3.1) i 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu ekstrakcyjnego. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1. Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza (pkt 4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (zob. objaśnienia pkt 7.3) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (pkt 4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie z użyciem 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2) i dwukrotnie z użyciem 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu 100 ml porcjami wody, ostrożnie mieszając, aby zapobiec powstawaniu emulsji, a następnie, wielokrotnie wstrząsając, powtórzyć przemywanie kolejnymi 100 ml porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (pkt 3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). Aby usunąć suspensję wodną, filtrować przemyty ekstrakt przez suchy karbowany filtr do rozdzielania faz (pkt 4.4) do kolby miarowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.2). Spłukać rozdzielacz i filtr przy użyciu 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), uzupełnić do pełnej objętości kolby eterem naftowym (pkt 3.2) i dobrze zmieszać.

5.3.2. Ekstrakcja przy użyciu aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (zob. objaśnienia pkt 7.3), zastąpić korek szklanego cylindra (pkt 4.8.1) nasadką ze szlifem (pkt 4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez aplikację ciśnienia azotu dopływającego przez ramię nasadki przenieść eter naftowy z górnej warstwy do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (pkt 4.2.3). Do szklanego cylindra dodać 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), zamknąć i dobrze wstrząsnąć. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza w sposób opisany powyżej. Powtórzyć postępowanie ekstrakcyjne, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (pkt 3.2), a następnie stosując dwukrotnie porcję 50 ml eteru naftowego (pkt 3.2), i dodać warstwy eteru naftowego do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego w sposób określony w pkt 5.3.1 i postępować w sposób tam określony.

5.4. Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (pkt 4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na wyparce rotacyjnej (pkt 4.1) przy obniżonym ciśnieniu w temperaturze łaźni nie wyższej niż 40 °C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (pkt 3.9) i zdjąć kolbę z wyparki rotacyjnej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.9) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości (10–100 ml) metanolu (pkt 3.3) (stężenie DL-α-tokoferolu musi wynosić od 5 do 30 μg/ml).

5.5. Oznaczanie HPLC

Witamina E jest rozdzielana na kolumnie w odwróconym układzie faz C18 (pkt 4.5.1), a stężenie jest mierzone z użyciem detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie: 295 nm; emisja: 330 nm) lub detektora UV (292 nm) (pkt 4.5.2).

Zadozować podwielokrotną część roztworu metanolowego (np. 20 μl) otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4 i wymywać fazą ruchomą (pkt 3.8). Obliczyć średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (pkt 5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.5.1):

250 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.8):

mieszanina metanolu (pkt 3.3) i wody np. 980 + 20 (v + v)

Prędkość przepływu:

1–2 ml/min

Detektor (pkt 4.5.2):

detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 295 nm/ emisja: 330 nm) lub detektor UV (292nm)

5.6. Kalibracja (octan DL-α-tokoferolu lub DL-α-tokoferol)

5.6.1. Wzorzec octanu DL-α-tokoferolu

5.6.1.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 25 ml roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (pkt 4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2. Następnie ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do pełnej objętości kolby 500 ml eterem naftowym. Odparować prawie do sucha 25 ml tego ekstraktu na wyparce rotacyjnej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (pkt 3.9) i ponownie rozpuścić pozostałość w 25,0 ml metanolu (pkt 3.3). Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 45,5 μg DL-α-tokoferolu na ml, co odpowiada 50 μg octanu DL-α-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

5.6.1.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Stężenia nominalne tych roztworów wynoszą odpowiednio 2,5, 5,0, 10,0 i 25,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu, co odpowiada stężeniom 2,28, 4,55, 9,10 i 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.1.3. Standaryzacja UV roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1)

Rozcieńczyć 5,0 ml roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (pkt 3.10.1) do 25,0 ml etanolem i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (pkt 3.1) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 250 i 320 nm.

Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 284 nm:

Przy tym rozcieńczeniu wartość ekstynkcji musi wynosić od 0,84 do 0,88.

5.6.2. Wzorzec DL-α-tokoferolu

5.6.2.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 2 ml roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, rozpuścić w metanolu (pkt 3.3) i uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem. Stężenie nominalne tego roztworu wynosi 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, co odpowiada 44,0 μg octanu DL-α-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

5.6.2.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (pkt 3.3) i zmieszać. Stężenia nominalne tych roztworów wynoszą odpowiednio 2,0, 4,0, 8,0 i 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, co odpowiada stężeniom 2,20, 4,40, 8,79 i 22,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.2.3. Standaryzacja UV roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1)

Rozcieńczyć 2,0 ml roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (pkt 3.11.1) do 25,0 ml etanolem i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (pkt 3.1) w spektrofotometrze (pkt 4.6) pomiędzy 250 i 320 nm. Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 292 nm:

Przy tym rozcieńczeniu wartość ekstynkcji musi wynosić 0,6.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy E roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml (obliczone jako octan DL-α-tokoferolu), odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.6.1.2 lub 5.6.2.2).

Zawartość witaminy E w mg/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml witaminy E (jako octan DL-α-tokoferolu) w roztworze próbki (pkt 5.4)

V1

=

objętość w ml roztworu próbki (pkt 5.4)

V2

=

objętość w ml pobranej podwielokrotnej części, o której mowa w pkt 5.4

m

=

masa naważki w g

7. Objaśnienia

7.1.

W przypadku próbek o niskim stężeniu witaminy E wskazane jest połączenie ekstraktów eteru naftowego dwóch zmydlonych naważek (o masie 25 g każda) w jeden roztwór próbki przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2.

Próbka pobrana do analizy nie może zawierać więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3.

Jeżeli nie dochodzi do rozdzielenia faz, dodać około 10 ml etanolu (pkt 3.1), aby rozwarstwić emulsję.

7.4.

Po pomiarze spektrofotometrycznym roztworu octanu DL-α-tokoferolu lub DL-α-tokoferolu, wykonanym odpowiednio w sposób określony w pkt 5.6.1.3 lub 5.6.2.3, dodać około 10 mg BHT (pkt 3.12) do roztworu (pkt 3.10.1 lub 3.10.2) i roztwór przechowywać w lodówce (nie dłużej niż przez 4 tygodnie).

7.5.

Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6.

Przy zastosowaniu kolumny do chromatografii w normalnym układzie faz możliwe jest oddzielenie α-, β-, γ- i δ-tokoferolu.

7.7.

Zamiast roztworu askorbinianu sodu można zastosować około 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8.

Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

7,9

Octanowa witamina E ulega bardzo szybkiej hydrolizie w warunkach zasadowych i dlatego jest ona wrażliwa na utlenianie, szczególnie w obecności takich pierwiastków śladowych jak żelazo lub miedź. W przypadku oznaczania witaminy E w premiksach na poziomach wyższych niż 5 000 mg/kg konsekwencją może być degradacja witaminy E. Dlatego też do celów potwierdzenia zaleca się metodę HPLC obejmującą rozkład enzymatyczny witaminy E bez zmydlania zasadą.

8. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego (4)

Premiks

Pasza z premiksem

Mieszanka paszowa mineralna

Pasza białkowa

Pasza dla prosiąt

L

12

12

12

12

12

n

48

48

48

48

48

Średnia [mg/kg]

17 380

1 187

926

315

61,3

sr [mg/kg]

384

45,3

25,2

13,0

2,3

r [mg/kg]

1 075

126,8

70,6

36,4

6,4

CVr [%]

2,2

3,8

2,7

4,1

3,8

sR [mg/kg]

830

65,0

55,5

18,9

7,8

R [mg/kg]

2 324

182,0

155,4

52,9

21,8

CVR [%]

4,8

5,5

6,0

6,0

12,7

L:

liczba laboratoriów

n:

liczba pojedynczych wartości

sr:

odchylenie standardowe powtarzalności

sR:

odchylenie standardowe odtwarzalności

r:

powtarzalność

R:

odtwarzalność

CVr:

współczynnik zmienności powtarzalności

CVR:

współczynnik zmienności odtwarzalności

Rysunek 2

Aparatu ekstrakcyjnego (pkt 4.8)

C) OZNACZANIE PIERWIASTKÓW ŚLADOWYCH: ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

Zawartość żelaza, miedzi, manganu i cynku ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 15510 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, kobaltu, molibdenu i ołowiu z zastosowaniem ICP-AES lub

— metody analizy przewidzianej w normie EN 15621 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, siarki, żelaza, cynku, miedzi, manganu i kobaltu po mineralizacji ciśnieniowej metodą ICP-AES, lub

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17053 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pierwiastków śladowych, metali ciężkich i innych pierwiastków w paszy metodą ICP-MS (metoda wielopierwiastkowa), lub

— metody analizy przewidzianej w normie EN ISO 6869 Pasze: Oznaczanie zawartości wapnia, miedzi, żelaza, magnezu, manganu, potasu, sodu i cynku. Metoda absorpcyjnej spektrometrii atomowej, lub

— metody atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją w płomieniu (FAAS), jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1) Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości pierwiastków śladowych: żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszy (5). Dolne granice oznaczalności metody wynoszą dla:

— żelaza (Fe): 20 mg/kg,

— miedzi (Cu): 10 mg/kg,

— manganu (Mn): 20 mg/kg,

— cynku (Zn): 20 mg/kg,

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę wprowadza się do roztworu kwasu chlorowodorowego po zniszczeniu ewentualnej substancji organicznej. Pierwiastki śladowe: żelazo, miedź, mangan i cynk są oznaczane, po odpowiednim rozcieńczeniu, z użyciem atomowej spektrometrii absorpcyjnej.

3. Odczynniki

Uwagi wstępne

Do przygotowania odczynników i roztworów używanych w postępowaniu analitycznym stosuje się wodę wolną od oznaczanych kationów, otrzymaną w drodze podwójnej destylacji w destylarce ze szkła borokrzemowego lub kwarcowego lub w wyniku podwójnego traktowania na żywicy jonowymiennej.

Stosować odczynniki o czystości co najmniej analitycznej. Nieobecność oznaczanych pierwiastków należy sprawdzać poprzez próbę ślepą. Odczynniki, jeżeli to konieczne, poddaje się oczyszczeniu przed zastosowaniem.

Zamiast przygotowania wzorcowych roztworów opisanych poniżej dopuszcza się stosowanie innych dostępnych w handlu wzorcowych roztworów, pod warunkiem że mają one gwarancję i zostały sprawdzone przed użyciem.

3.1.

Kwas chlorowodorowy (d:1,19 g/ml)

3.2.

Kwas chlorowodorowy (6 mol/litr)

3.3.

Kwas chlorowodorowy (0,5 mol/litr)

3.4.

Kwas fluorowodorowy od 38 do 40 % (v/v), o zawartości żelaza (Fe) niższej niż 1 mg/l i pozostałości po odparowaniu niższej niż 10 mg (jako siarczanu)/l.

3.5.

Kwas siarkowy (d: 1,84 g/ml)

3.6.

Nadtlenek wodoru (około 100 objętości tlenu (30 % w/w))

3.7.

Roztwór wzorcowy żelaza (1 000 μg Fe/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu: rozpuścić 1 g drutu żelaznego w 200 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), dodać 16 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.7.1.

Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (100 μg Fe/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.7) wodą w stosunku 1:9

3.8.

Roztwór wzorcowy miedzi (1 000 μg Cu/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g sproszkowanej miedzi w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.8.1.

Roboczy roztwór wzorcowy miedzi (10 μg Cu/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.8) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą stosunku 1:9

3.9.

Roztwór wzorcowy manganu (1 000 μg Mn/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g sproszkowanego manganu w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.9.1.

Roboczy roztwór wzorcowy manganu (10 μg Mn/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.9) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą w stosunku 1:9

3.10.

Roztwór wzorcowy cynku (1 000 μg Zn/ml) przygotowany w następujący sposób lub równoważny roztwór dostępny w handlu:

— rozpuścić 1 g cynku w postaci paska lub listka w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.10.1.

Roboczy roztwór wzorcowy cynku (10 μg Zn/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (pkt 3.10) wodą w stosunku 1:9, a następnie przez rozcieńczenie jednej części uzyskanego roztworu wodą w stosunku 1:9

3.11.

Roztwór chlorku lantanu: rozpuścić 12 g tlenku lantanu w 150 ml wody, dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Piec muflowy z regulacją temperatury i w miarę możliwości z rejestratorem

4.2.

Naczynie szklane z odpornego borokrzemowego szkła; zalecane jest stosowanie sprzętu przeznaczonego wyłącznie do oznaczania mikroelementów.

4.3.

Spektrofotometr do pomiaru absorpcji atomowej o czułości i precyzji w zakresie prezentowanej metody

5. Sposób postępowania (6)

5.1. Próbki zawierające substancję organiczną

5.1.1.

Spopielanie i przygotowanie roztworu do analizy

(7) 5.1.1.1.

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 5 do 10 g próbki i umieścić w kwarcowym lub platynowym tyglu (zob. uwaga b)), wysuszyć w suszarce w temperaturze 105 °C i wstawić tygiel do zimnego pieca muflowego (pkt 4.1). Zamknąć piec, (zob. uwaga c)) i stopniowo podwyższać temperaturę do 450–475 °C w czasie około 90 minut. Utrzymywać tę temperaturę od 4 do 16 godzin, np. przez noc, aby usunąć materiał zawierający węgiel, następnie otworzyć piec i pozostawić do schłodzenia (zob. uwaga d)).

Zwilżyć spopielałe pozostałości wodą i przenieść do zlewki o pojemności 250 ml. Przemyć tygiel z użyciem około 5 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) i dodawać kwas powoli i ostrożnie do zlewki (może zajść gwałtowna reakcja w wyniku powstania CO2). Dodawać kroplami kwas chlorowodorowy (pkt 3.1) mieszając do zaniku burzenia się mieszaniny. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając szklanym prętem.

Następnie dodać do pozostałości 15 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2), a następnie około 120 ml wody. Zamieszać szklanym prętem, który należy pozostać w zlewce, i przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym. Doprowadzić ostrożnie do wrzenia i pozostawić w tym stanie aż do całkowitego rozpuszczenia popiołu. Przefiltrować przez sączek bezpopiołowy i zebrać filtrat w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Spłukać zlewkę i filtr z użyciem 5 ml gorącego kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2) i dwukrotnie wrzącą wodą. Uzupełnić kolbę miarową do pełnej objętości wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

5.1.1.2.

Jeżeli pozostałość na filtrze jest czarna (węgiel), wstawić z powrotem do pieca i ponownie spopielać w temperaturze od 450 do 475 °C. Spopielanie, które wymaga jedynie kilku godzin (od trzech do pięciu), uważa się za zakończone, gdy popiół ma barwę białą lub białawą. Rozpuścić pozostałość w około 2 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1), odparować do sucha i dodać 5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (pkt 3.2). Podgrzać, przefiltrować roztwór do kolby miarowej i uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

Uwagi:

a) Przy oznaczaniu pierwiastków śladowych należy zwrócić szczególną uwagę na ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza cynkiem, miedzią i żelazem. Dlatego sprzęt stosowany podczas przygotowania próbki nie może zawierać tych metali.

W celu zmniejszenia ogólnego ryzyka zanieczyszczenia należy wykonywać oznaczenie w środowisku wolnym od kurzu, dokładnie czyszcząc wyposażenie i myjąc naczynia szklane. Zwłaszcza przy oznaczaniu cynku występuje ryzyko zanieczyszczeń, np. z naczynia szklanego, odczynników, kurzu.

b) Masę próbki, która ma być spopielona, szacuje się na podstawie przybliżonej zawartości pierwiastka śladowego w paszy, w stosunku do czułości stosowanego spektrofotometru. W przypadku pasz ubogich w pierwiastki śladowe może zaistnieć konieczność rozpoczęcia oznaczania od odważenia od 10 do 20 g próbki i sporządzenia roztworu o końcowej objętości 100 ml.

c) Spopielanie należy przeprowadzać w zamkniętym piecu bez dostępu powietrza lub tlenu.

d) Temperatura według wskazań pirometru nie może być wyższa niż 475 °C.

5.1.2. Spektrofotometryczne oznaczanie

5.1.2.1. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych

Dla każdego z oznaczanych pierwiastków śladowych przygotować, z roboczych roztworów wzorcowych określonych w pkt 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 i 3.10.1, roztwory kalibracyjne o stężeniu kwasu chlorowodorowego około 0,5 mol/l i – w przypadku żelaza, manganu i cynku – chlorek lantanu o stężeniu 0,1 % La (w/v).

Wybrane stężenia pierwiastków śladowych muszą mieścić się w zakresie czułości stosowanego spektrofotometru. W poniższych tabelach podano przykładowy skład typowych zakresów stężeń roztworów kalibracyjnych; w zależności od typu i czułości stosowanego spektrofotometru może zachodzić konieczność wyboru innych stężeń.

Żelazo

μg Fe/ml

0

0,5

1

2

3

4

5

ml roboczego roztworu wzorcowego (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)

0

0,5

1

2

3

4

5

ml HCl (pkt 3.2)

7

7

7

7

7

7

7

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

Miedź

μg Cu/ml

0

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)

0

1

2

4

6

8

10

ml HCl (pkt 3.2)

8

8

8

8

8

8

8

Mangan

μg Mn/ml

0

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)

0

1

2

4

6

8

10

ml HCl (pkt 3.2)

7

7

7

7

7

7

7

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

Cynk

μg Zn/ml

0

0,05

0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

ml roboczego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)

0

0,5

1

2

4

6

8

ml HCl (pkt 3.2)

7

7

7

7

7

7

7

+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

5.1.2.2. Przygotowanie roztworu do analizy

W przypadku oznaczania miedzi zazwyczaj może być wykorzystany roztwór przygotowany w sposób określony w pkt 5.1.1. W przypadku konieczności dostosowania jego stężenia do zakresu stężeń roztworów kalibracyjnych pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (pkt 3.3).

Przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku pobrać pipetą podwielokrotną część roztworu przygotowanego w sposób określony w pkt 5.1.1 do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dodać 10 ml roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (pkt 3.3) (zob. objaśnienia pkt 8).

5.1.2.3. Próba ślepa

Próbę ślepą przeprowadzić zgodnie z kolejnością wykonywania czynności metody, ale bez użycia materiału próbki. Nie stosować roztworu kalibracyjnego »0« do ślepej próby.

5.1.2.4. Pomiar absorpcji atomowej

Zmierzyć absorpcję atomową roztworów kalibracyjnych i badanego roztworu z użyciem utleniającego płomienia powietrzno-acetylenowego przy następujących długościach fal:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Każdy pomiar przeprowadzić czterokrotnie.

5.2. Mieszanki paszowe mineralne

Jeżeli próbka nie zawiera substancji organicznych, wcześniejsze spopielanie nie jest konieczne. Postępować w sposób określony w pkt 5.1.1.1, poczynając od akapitu drugiego. Można pominąć etap odparowania z kwasem fluorowodorowym.

6. Obliczanie wyników

Przy zastosowaniu krzywej wzorcowej obliczyć stężenie pierwiastka śladowego w roztworze do analizy i wyrazić wynik w mg pierwiastka śladowego na kg próbki (ppm).

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie może przekraczać:

— 5 mg/kg w wartości bezwzględnej, dla zawartości danego pierwiastka śladowego nie wyższej niż 50 mg/kg,

— 10 % wyższego wyniku, dla zawartości danego pierwiastka śladowego od 50 do 100 mg/kg,

— 10 mg/kg w wartości bezwzględnej, dla zawartości danego pierwiastka śladowego od 100 do 200 mg/kg,

— 5 % wyższego wyniku, dla zawartości danego pierwiastka śladowego wyższej niż 200 mg/kg.

8. Objaśnienia

Obecność znacznych ilości fosforanów może interferować przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku. Takie interferencje należy skorygować przez dodanie chlorku lantanu (pkt 3.11). Jeżeli jednak w próbce stosunek wagowy Ca + Mg/P jest > 2, to dodanie roztworu chlorku lantanu (pkt 3.11) do analizowanego roztworu i roztworów kalibracyjnych może być pominięte.

D) OZNACZANIE HALOFUGINONU

Bromowodorek DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazolin-4-(3H)-onu

Zawartość halofuginonu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości halofuginonu w paszach. Granica oznaczalności wynosi 1 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Po potraktowaniu gorącą wodą halofuginon ekstrahuje się w postaci wolnej zasady w octanie etylu, a następnie rozdziela jako chlorowodorek w wodnym roztworze kwasu. Ekstrakt jest oczyszczany z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej. Zawartość halofuginonu określa się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1.

Acetonitryl do HPLC

3.2.

Żywica Amberlit XAD-2

3.3.

Octan amonu

3.4.

Octan etylu

3.5.

Kwas octowy lodowaty

3.6.

Substancja wzorcowa halofuginonu (bromowodorek DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazolin-4-(3H)-onu, E 764)

3.6.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy halofuginonu o stężeniu 100 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg halofuginonu (pkt 3.6) do kolby miarowej o pojemności 500 ml, rozpuścić w roztworze buforowym octanu amonu (pkt 3.18), uzupełnić do pełnej objętości kolby roztworem buforowym i wymieszać. Roztwór zachowuje stabilność do trzech tygodni, jeżeli jest przechowywany bez dostępu światła w temperaturze 5 °C.

3.6.2.

Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml przenieść kolejno 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego halofuginonu (pkt 3.6.1). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (pkt 3.21) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 μg/ml halofuginonu. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.7.

Kwas chlorowodorowy (ρ20 około 1,16 g/ml)

3.8.

Metanol

3.9.

Azotan srebra

3.10.

Askorbinian sodu

3.11.

Węglan sodu

3.12.

Chlorek sodu

3.13.

EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól dwusodowa)

3.14.

Woda do HPLC

3.15.

Roztwór węglanu sodu, c = 10 g/100 ml

3.16.

Roztwór węglanu sodu nasyconego chlorkiem sodu, c = 5 g/100 ml

Rozpuścić 50 g węglanu sodu (pkt 3.11) w wodzie, rozcieńczyć do objętości 1 l i dodać chlorek sodu (pkt 3.12), aż do otrzymania roztworu nasyconego.

3.17.

Kwas chlorowodorowy, stężenie około 0,1 mol/l

Rozcieńczyć 10 ml HCI (pkt 3.7) wodą do objętości 1 l.

3.18.

Roztwór buforowy octanu amonu, około 0,25 mol/l

Rozpuścić 19,3 g octanu amonu (pkt 3.3) i 30 ml kwasu octowego (pkt 3.5) w wodzie (pkt 3.14) i rozcieńczyć do objętości 1 l.

3.19.

Przygotowanie żywicy Amberlit XAD-2

Odpowiednią ilość żywicy (pkt 3.2) przemywać wodą aż do zaniku wszystkich jonów chlorku, co sprawdza się z użyciem azotanu srebra (pkt 3.20) w odrzucanej fazie wodnej. Następnie przemyć żywicę 50 ml metanolu (pkt 3.8), usunąć metanol i przechowywać żywicę w świeżym metanolu.

3.20.

Roztwór azotanu srebra około 0,1 mol/l

Rozpuścić 0,17 g azotanu srebra (pkt 3.9) w 10 ml wody.

3.21.

Faza ruchoma HPLC

Zmieszać 500 ml acetonitrylu (pkt 3.1) z 300 ml roztworu buforowego octanu amonu (pkt 3.18) i 1 200 ml wody (pkt 3.14). Przy użyciu kwasu octowego (pkt 3.5) dostosować pH do 4,3. Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (pkt 4.8), a następnie odgazować roztwór (np. poprzez zastosowanie ultradźwięków przez 10 minut). Roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc, jeżeli jest przechowywany w zamkniętym naczyniu, bez dostępu światła.

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Łaźnia ultradźwiękowa

4.2.

Obrotowa wyparka warstwowa

4.3.

Wirówka

4.4.

Sprzęt do HPLC z detektorem UV z regulacją długości fali lub z detektorem diodowym

4.4.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej o wymiarach 300 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 10 μm lub równoważna kolumna

4.5.

Kolumna szklana o wymiarach 300 mm × 10 mm z kranem i filtrem ze spiekanego szkła

4.6.

Filtry z włókna szklanego o średnicy 150 mm

4.7.

Filtry membranowe, 0,45 μm

4.8.

Filtry membranowe, 0,22 μm

5. Sposób postępowania

Uwaga

Halofuginon w formie wolnej zasady jest niestabilny w roztworach zasadowych i octanu etylu. Nie może pozostawać w octanie etylu dłużej niż przez 30 minut.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1.

Ślepą próbkę paszy należy przeanalizować w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona halofuginonu i innych substancji interferujących.

5.1.2.

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconej znaną ilością halofuginonu, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Aby wzbogacić na poziomie 3 mg/kg, dodać 300 μl podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.6.1) do 10 g ślepej próbki paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Uwaga:

dla celów niniejszej metody ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności halofuginonu.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,1 g, 10 g przygotowanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 ml. Dodać 0,5 g askorbinianu sodu (pkt 3.10), 0,5 g EDTA (pkt 3.13), 20 ml wody i zmieszać. Probówkę umieścić na 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodu (pkt 3.15) i zmieszać. Niezwłocznie dodać 100 ml octanu etylu (pkt 3.4) i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) na trzy minuty i obluzować korek. Wirować przez dwie minuty i zdekantować fazę octanu etylu przez filtr z włókna szklanego (pkt 4.6) do rozdzielacza o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję tej próbki drugą porcją 100 ml octanu etylu. Przemywać połączone ekstrakty przez minutę 50 ml roztworu chlorku sodu nasyconego węglanem sodu (pkt 3.16) i usunąć warstwę wodną.

Warstwę organiczną ekstrahować przez minutę 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.17). Dolną kwasową warstwę spuścić do rozdzielacza o pojemności 250 ml. Przez 1,5 minuty powtarzać ekstrakcję warstwy organicznej przy użyciu kolejnej porcji 50 ml kwasu chlorowodorowego i połączyć z ekstraktem uzyskanym z pierwszego procesu. Przemyć połączone ekstrakty kwasu, wirując z 10 ml octanu etylu (pkt 3.4) przez około 10 sekund.

Warstwę wodną przenieść ilościowo do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml i usunąć warstwę organiczną. Znajdujący się jeszcze w roztworze kwasu octan etylu odparować na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.2). Temperatura łaźni wodnej nie może przekraczać 40 °C. W warunkach podciśnienia wynoszącego około 25 mbar i w temperaturze 38 °C cała pozostała część octanu etylu zostanie usunięta w ciągu 5 min.

5.3. Oczyszczanie

5.3.1. Przygotowanie kolumny z Amberlitem

Dla każdego ekstraktu próbki przygotować kolumnę XAD-2. Przygotowany Amberlit o masie 10 g (pkt 3.19) umieścić w szklanej kolumnie (pkt 4.5) z metanolem (pkt 3.8). Wprowadzić mały zwitek szklanej waty w górną część warstwy żywicy. Odprowadzić metanol z kolumny, a następnie przemyć żywicę 100 ml wody, zatrzymując proces, gdy ciecz dosięgnie górnej części warstwy żywicy. Pozostawić kolumnę do ustabilizowania na 10 minut przed użyciem. Nie dopuścić do osuszenia kolumny.

5.3.2. Oczyszczanie próbki

Ekstrakt (pkt 5.2) przenieść ilościowo na górną powierzchnię kolumny z Amberlitem (pkt 5.3.1) i eluować, usuwając eluat. Prędkość elucji nie może przekraczać 20 ml/min. Przemyć kolbę okrągłodenną 20 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.17). Użyć tego kwasu do przemycia kolumny z żywicą. Usunąć pozostałości roztworu kwasu strumieniem powietrza. Wylać popłuczyny. Dodać 100 ml metanolu (pkt 3.8) na kolumnę i pozwolić na elucję od 5 do 10 ml, zbierając eluat w kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml. Pozostawić pozostały metanol na 10 minut w celu ustabilizowania z żywicą, a następnie kontynuować elucję, której prędkość nie może przekraczać 20 ml/min, zbierając eluat do tej samej kolby okrągłodennej. Odparować metanol na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.2), przy czym temperatura wody w łaźni nie może być wyższa niż 40 °C. Za pomocą fazy ruchomej (pkt 3.21) przenieść ilościowo pozostałość do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Uzupełnić do pełnej objętości fazą ruchomą i zmieszać. Podwielokrotna część jest filtrowana przez filtr membranowy (pkt 4.7). Roztwór ten zastosować do oznaczania HPLC (pkt 5.4).

5.4. Oznaczanie HPLC

5.4.1. Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (pkt 3.21)

Prędkość przepływu: od 1,5 do 2 ml/min

Długość fali przy detekcji: 243 nm

Dozowana objętość: 40 do 100 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (pkt 3.6.2) o stężeniu 3,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.4.2. Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.6.2) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Nakreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3. Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.3.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików halofuginonu.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików halofuginonu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w in μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.4.2).

Zawartość halofuginonu w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

:

stężenie w μg/ml halofuginonu w roztworze próbki

m

:

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1. Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.6.2) zawierającego 6,0 μg/ml.

7.1.1. Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki jest wzbogacany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu musi być podobna do szacowanej ilości halofuginonu obecnego w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku halofuginonu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach ± 2 nm;

b) w zakresie pomiędzy 225 a 300 nm widma próbki i wzorca zapisane przy maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 225 do 300 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,5 mg/kg dla zawartości halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej próbki ślepej odzysk nie może być mniejszy niż 80 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego osiem laboratoriów przeprowadziło analizę (8) trzech próbek.

Wyniki

Próbka A (ślepa)

Przy odbiorze

Próbka B (mączka)

Próbka C (granulki)

Przy odbiorze

Po dwóch miesiącach

Przy odbiorze

Po dwóch miesiącach

Średnia [mg/kg]

n.w.

2,80

2,42

2,89

2,45

SR [mg/kg]

– 0,45

0,43

0,40

0,42

CVR [%]

– 16

18

14

17

Odzysk [%]

86

74

88

75

n.w.=

nie wykryto

SR=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR=

współczynnik zmienności odtwarzalności (%)

Rec.=

odzysk (%)

E) OZNACZANIE ROBENIDYNY

Chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny

Zawartość robenidyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości robenidyny w paszach. Granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę poddaje się ekstrakcji zakwaszonym metanolem. Ekstrakt osusza się, a podwielokrotną część oczyszcza na kolumnie z tlenkiem glinu. Robenidynę z kolumny wymywa się metanolem, zatęża i uzupełnia do odpowiedniej objętości fazą ruchomą. Robenidynę oznacza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1.

Metanol

3.2.

Zakwaszony metanol

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml umieścić 4,0 ml kwasu chlorowodorowego (ρ20 = 1,18 g/ml), uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.3.

Acetonitryl do HPLC

3.4.

Sito molekularne

Typ 3 A, granulki 8–12 mesh (granulki z glinokrzemianu krystalicznego 1,6–2,5 mm, średnica porów 0,3 mm).

3.5.

Tlenek glinu I stopnia aktywności kwasowej do chromatografii kolumnowej

100 g tlenku glinu umieścić w odpowiednim pojemniku i dodać 2,0 ml wody. Zakorkować i wstrząsać przez około 20 minut. Przechowywać w dobrze zamkniętym pojemniku.

3.6.

Roztwór diwodorofosforanu potasu, c = 0,025 mol/l

Rozpuścić 3,40 g diwodorofosforanu potasu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby i wymieszać.

3.7.

Roztwór wodorofosforanu disodu, c = 0,025 mol/l

Rozpuścić 3,55 g bezwodnego lub 4,45 g dihydratu, lub 8,95 g dodekahydratu wodorofosforanu disodu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 l, uzupełnić do pełnej objętości kolby i wymieszać.

3.8.

Faza ruchoma HPLC

Zmieszać razem:

650 ml acetonitrylu (pkt 3.3),

250 ml wody do HPLC,

50 ml roztworu diwodorofosforanu potasu (pkt 3.6),

50 ml roztworu wodorofosforanu disodu (pkt 3.7).

Filtrować przez filtr 0,22 μm (pkt 4.6) i odgazować roztwór, np. poprzez zastosowanie ultradźwięków przez 10 minut.

3.9.

Substancja wzorcowa

Czysta robenidyna: chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny

3.9.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy robenidyny: 300 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 30 mg substancji wzorcowej robenidyny (pkt 3.9). Rozpuścić w zakwaszonym metanolu (pkt 3.2) w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby tym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.2.

Pośredni roztwór wzorcowy robenidyny: 12 μg/ml

Przenieść 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 250 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby fazą ruchomą (pkt 3.8) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.3.

Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 i 25,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego robenidyny (pkt 3.9.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 i 6,0 μg/ml robenidyny. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.

Woda do HPLC

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Kolumna szklana

Przygotować kolumnę ze szkła oranżowego o średnicy wewnętrznej od 10 do 15 mm i długości 250 mm, wyposażoną w kran i zbiorniczek o pojemności około 150 ml.

4.2.

Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.3.

Obrotowa wyparka warstwowa

4.4.

Wyposażenie do HPLC z detektorem promieniowania ultrafioletowego z regulacją długości fali lub detektorem diodowym pracującym w zakresie od 250 do 400 nm

4.4.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej: 300 mm x 4 mm, C18 wypełnienie10 μm lub równoważna

4.5.

Bibuła filtracyjna z włóknem szklanym (Whatman GF/A lub równoważna)

4.6.

Filtry membranowe, 0,22 μm

4.7.

Filtry membranowe, 0,45 μm

5. Sposób postępowania

Uwaga:

Robenidyna jest wrażliwa na światło. Wszystkie czynności należy przeprowadzać z zastosowaniem szkła oranżowego.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1.

Należy przebadać ślepą próbkę paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera robenidyny ani substancji interferujących.

5.1.2.

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy (pkt 5.1.1) wzbogaconą znaną ilością robenidyny, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 60 mg/kg, przenieść 3,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego robenidyny (pkt 3.9.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Odparować roztwór w strumieniu azotu do około 0,5 ml. Dodać 15 g ślepej próbki paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Uwaga:

Na potrzeby tej metody ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności robenidyny.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 15 g przygotowanej próbki. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.2), zakorkować i wstrząsać przez godzinę na wstrząsarce (pkt 4.2). Roztwór filtrować przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym (pkt 4.5), a filtrat zebrać do kolby stożkowej o pojemności 150 ml. Dodać 7,5 g sita molekularnego (pkt 3.4), zamknąć i wstrząsać przez pięć minut. Natychmiast filtrować przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym. Roztwór zachowuje się do etapu oczyszczania (pkt 5.3).

5.3. Oczyszczanie

5.3.1. Przygotowanie kolumny z tlenkiem glinu

Umieścić w dolnym końcu szklanej kolumny (pkt 4.1) zwitek szklanej waty i wbić ją, używając szklanego pręcika. Odważyć 11,0 g przygotowanego tlenku glinu (pkt 3.5) i przenieść do kolumny. Czynność tę należy wykonywać tak, aby ograniczyć do minimum działanie powietrza atmosferycznego. Delikatnie postukać w napełnioną kolumnę od strony dna w celu osadzenia tlenku glinu.

5.3.2. Oczyszczanie próbki

Używając pipety, przenieść do kolumny 5,0 ml ekstraktu próbki otrzymanego w sposób określony w pkt 5.2. Zakończenie pipety przyłożyć blisko do ścianki kolumny i pozwolić, aby roztwór został wchłonięty przez tlenek glinu. Wymyć robenidynę z kolumny przy użyciu 100 ml metanolu (pkt 3.1) przy prędkości przepływu od 2 do 3 ml na minutę, a eluat zebrać do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Na obrotowej wyparce warstwowej (pkt 4.3) odparować roztwór metanolu do sucha, przy zmniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40 °C. Pozostałość ponownie rozpuścić w 3–4 ml fazy ruchomej (pkt 3.8) i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Kolbę przemyć kilkakrotnie 1–2 ml porcjami fazy ruchomej, a popłuczyny wlać do kolby miarowej. Uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Podwielokrotna część jest filtrowana przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.7). Roztwór zastosować do oznaczania HPLC (pkt 5.4).

5.4. Oznaczanie HPLC

5.4.1. Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (pkt 3.8)

Prędkość przepływu: 1,5 do 2 ml/min

Długość fali przy detekcji: 317 nm

Dozowana objętość: 20 do 50 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (pkt 3.9.3) zawierający 3,6 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości pików i czasów retencji.

5.4.2. Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.9.3) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3. Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.3.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików robenidyny.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików robenidyny roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.4.2).

Zawartość robenidyny (w mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml robenidyny w roztworze próbki

m

=

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1. Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.9.3) zawierającego 6 μg/ml.

7.1.1. Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki jest wzbogacany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.9.3). Ilość dodanej robenidyny musi być podobna do szacowanej ilości robenidyny w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku robenidyny. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ok. 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku zarejestrowanego na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm;

b) w zakresie pomiędzy 250 a 400 nm widma próbki i wzorca zapisane przy maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest wyższa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 250 do 400 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest wyższa niż 15 % widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % wyższego wyniku dla zawartości robenidyny powyżej 15 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej próbki ślepej odzysk nie może być mniejszy niż 85 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego na szczeblu UE, w którym uczestniczyło 12 laboratoriów, przeprowadzono analizę czterech próbek paszy dla drobiu i królików, w postaci mączki lub granulatu. Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Pasza dla drobiu

Pasza dla królików

Mączka

Granulat

Mączka

Granulat

Średnia [mg/kg]

27,00

27,99

43,6

40,1

sr [mg/kg]

1,46

1,26

1,44

1,66

CVr [%]

5,4

4,5

3,3

4,1

SR [mg/kg]

4,36

3,36

4,61

3,91

CVR [%]

16,1

12,0

10,6

9,7

Odzysk [%]

90,0

93,3

87,2

80,2

sr=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr=

współczynnik zmienności powtarzalności w %

SR=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR=

współczynnik zmienności odtwarzalności w %

F) OZNACZANIE DIKLAZURILU

(±)4-chlorofenylo[2,6-dwuchloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro–3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl

Zawartość diklazurilu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz z potrójnym gradientem (HPLC) z zastosowaniem detektora UV, jak opisano w pkt 1–9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości diklazurilu w mieszankach paszowych i premiksach (9). Granica wykrywalności wynosi 0,1 mg/kg, granica oznaczalności 0,5 mg/kg. Możliwe jest osiągnięcie niższych granic oznaczalności, ale musi to zostać zwalidowane przez użytkownika.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Po dodaniu wzorca wewnętrznego próbka jest ekstrahowana zakwaszonym metanolem. W przypadku pasz podwielokrotna część ekstraktu zostaje oczyszczona na wkładzie do ekstrakcji fazy stałej C18. Diklazuril jest eluowany z wypełnienia mieszaniną zakwaszonego metanolu i wody. Po odparowaniu pozostałość jest rozpuszczana w DMF/woda. W przypadku premiksów ekstrakt jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana w DMF/woda. Zawartość diklazurilu jest oznaczana za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz z potrójnym gradientem (HPLC) z zastosowaniem detektora UV.

3. Odczynniki

3.1.

Woda do HPLC

3.2.

Octan amonu

3.3.

Wodorosiarczan tetrabutyloamoniowy (TBHS)

3.4.

Acetonitryl do HPLC

3.5.

Metanol do HPLC

3.6.

N, N-dwumetyloformamid (DMF)

3.7.

Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8.

Substancja wzorcowa: diklazuril: (±)4-chlorofenylo[2,6-dwuchloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro–3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl o gwarantowanej czystości

3.8.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy diklazurilu, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej (pkt 3.8) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc (10).

3.8.2.

Roztwór wzorcowy diklazurilu, 50 μg/ml

Przenieść 5,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9.

Substancja wzorcowa wewnętrzna: 2,6-dichloro-α-(4-chlorofenylo)-4-(4,5-dihydro–3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2(3H) -yl) α-metylobenzeno-acetonitryl (diklazuril metylu)

3.9.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy wzorca wewnętrznego, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej wewnętrznej (pkt 3.9), do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9.2.

Roztwór wzorca wewnętrznego, 50 μg/ml

Przenieść 5,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (pkt 3.6) i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.9.3.

Roztwór wzorca wewnętrznego dla premiksów, p/1 000 mg/ml (p = zawartość nominalna diklazurilu w premiksie w mg/kg)

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, p/10 mg substancji wzorcowej wewnętrznej do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w DMF (pkt 3.6) w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.7), uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze 4 °C lub niższej roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.10.

Roztwory kalibracyjne

3.10.1.

Roztwór kalibracyjny, 1 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 1,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 17 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2.

Roztwór kalibracyjny, 2 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 2,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3.

Roztwór kalibracyjny, 3 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 3,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.4.

Roztwór kalibracyjny, 4 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 4,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 14 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.5.

Roztwór kalibracyjny, 5 μg/ml (diklazuril)

Odmierzyć pipetą 5,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (pkt 3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 13 ml DMF (pkt 3.6), uzupełnić do pełnej objętości wodą (pkt 3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

UWAGA:

roztwory kalibracyjne (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) obejmują stężenie diklazurilu w paszy wynoszące od 0,5 do 2,5 mg/kg przy stosowaniu obecnego protokołu.

3.11.

C18, wkład do ekstrakcji fazy stałej np. Mega Bond Elut, rozmiar: 20 cc, masa sorbentu: 5 000 mg (kondycjonowanie wstępne zgodnie z wytycznymi dostawcy).

3.12.

Rozpuszczalnik ekstrakcyjny: zakwaszony metanol

Odmierzyć pipetą 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.7) do 1 000 ml metanolu (pkt 3.5) i wymieszać.

3.13.

Faza ruchoma do HPLC

3.13.1.

Eluent A: roztwór octan amonu – wodorosiarczan tetrabutyloamoniowy

Rozpuścić 5 g octanu amonu (pkt 3.2) i 3,4 g TBHS (pkt 3.3) w 1 000 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać.

3.13.2.

Eluent B: acetonitryl (pkt 3.4)

3.13.3.

Eluent C: metanol (pkt 3.5)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Wytrząsarka mechaniczna

4.2.

Sprzęt do HPLC z potrójnym gradientem

4.2.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej, Hypersil ODS, wypełnienie 3 μm, 100 mm × 4,6 mm lub równoważna

4.2.2.

Detektor UV z regulacją długości fali lub detektor diodowy

4.3.

Obrotowa wyparka warstwowa

4.4.

Filtr membranowy (np. chemicznie odporny Nylon), 0,45 μm

4.5.

Strzykawka jednorazowa, 5 ml

4.6.

Rozdzielnik próżni do jednoczesnej próżniowej izolacji

4.7.

Łaźnia ultradźwiękowa

5. Sposób postępowania

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy

Należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona diklazurilu ani substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności diklazurilu i substancji interferujących.

5.1.2. Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością diklazurilu, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 1 mg/kg, należy dodać 0,1 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.8.1) do 50 g ślepej próbki paszy, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie ponownie kilkakrotnie wymieszać przed przejściem do następnego etapu (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością diklazurilu o masie zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niewzbogaconej.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Mieszanki paszowe

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 50 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.2), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (pkt 4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przelać 20 ml podwielokrotnej części supernatantu do odpowiedniego szklanego pojemnika i rozcieńczyć 20 ml wody (pkt 3.1). Przenieść ten roztwór na wkład do ekstrakcji (pkt 3.11) i przepuścić przez niego, stosując rozdzielnik próżni (pkt 4.6). Przepłukać wkład 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i wody (pkt 3.1), 65 + 35 (V + V). Odrzucić zebrane frakcje i eluować związki, stosując 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i wody, 80 + 20 (V + V). Odparować tę frakcję do osuszenia przy zastosowaniu wyparki rotacyjnej (pkt 4.3) w temperaturze 60 °C. Rozpuścić pozostałość w 1,0 ml DMF (pkt 3.6), dodać 1,5 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać. Przefiltrować przez filtr membranowy (pkt 4.4) zamontowany na jednorazowej strzykawce (pkt 4.5). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2. Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 1 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.9.3), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (pkt 4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przenieść podwielokrotną część 10 000/p ml (p = zawartość nominalna diklazurilu w premiksie w mg/kg) supernatantu do kolby okrągłodennej o odpowiedniej pojemności. Odparować do osuszenia, pod obniżonym ciśnieniem, w temperaturze 60 °C przy użyciu wyparki rotacyjnej (pkt 4.3). Ponownie rozpuścić pozostałość w 10,0 ml DMF (pkt 3.6), dodać 15,0 ml wody (pkt 3.1) i wymieszać. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3. Oznaczanie HPLC

5.3.1. Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych lub lepszych wyników.

— Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.2.1): 100 × 4,6 mm, Hypersil ODS, wypełnienie 3 μm, lub równoważna

— Faza ruchoma

— Eluent A (pkt 3.13.1): wodny roztwór octanu amonu i wodorosiarczanu tetrabutyloamoniowego

— Eluent B (pkt 3.13.2): acetonitryl

— Eluent C (pkt 3.13.3): metanol

— Elucja – gradient liniowy

— warunki początkowe: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)

— po 10 minutach elucja gradientowa przez 30 minut do: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)

— następnie płukać eluentem B przez 10 minut

— Prędkość przepływu: 1,5–2 ml/min

— Dozowana objętość: 20 μl

— Długość fali przy detekcji: 280 nm

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.10.2) zawierający 2 μg/ml diklazurilu i wzorca wewnętrznego, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2. Analiza chromatograficzna roztworów kalibracyjnych

Zadozować dwukrotnie 20 μl roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5), zidentyfikować i zintegrować piki diklazurilu i wzorca wewnętrznego oraz sporządzić krzywą wzorcową na podstawie stosunku średniej wysokości lub powierzchni piku diklazurilu do średniej wysokości lub powierzchni piku wzorca wewnętrznego w odniesieniu do stężenia diklazurilu w roztworach kalibracyjnych (μg/ml).

5.3.3. Analiza chromatograficzna roztworów próbki

Zadozować dwukrotnie 20 μl roztworu próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) i określić średnią wysokość (powierzchnię) pików diklazurilu i wzorca wewnętrznego.

6. Obliczanie wyników

6.1. Mieszanki paszowe

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) oblicza się według następującego wzoru:

=lub

gdzie:

— Wysokość(d,s) jest wysokością piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Powierzchnia(d,s) jest powierzchnią piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Wysokość(i,s) jest wysokością piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— Powierzchnia(i,s) jest powierzchnią piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

— b oznacza punkt przecięcia krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— a oznacza nachylenie krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— m oznacza masę naważki gramach

— V oznacza końcową objętość ekstraktu próbki w mililitrach po ponownym rozpuszczeniu zgodnie z pkt 5.2.1 (tj. 2,5 ml)

6.2. Premiksy

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) oblicza się według następującego wzoru:

lub

gdzie:

— Wysokość(d,s) jest wysokością piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Powierzchnia(d,s) jest powierzchnią piku diklazurilu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Wysokość(i,s) jest wysokością piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— Powierzchnia(i,s) jest powierzchnią piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

— b oznacza punkt przecięcia krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— a oznacza nachylenie krzywej wzorcowej wykreślonej z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 i 3.10.5) zgodnie z pkt 5.3.2

— m oznacza masę naważki gramach

— V oznacza końcową objętość ekstraktu próbki w mililitrach po ponownym rozpuszczeniu zgodnie z pkt 5.2.2 (tj. 25 ml)

— p oznacza zawartość nominalną w mg/kg diklazurilu w premiksie

7. Sprawdzenie metody

7.1. Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.2).

7.1.1. Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) wzbogaca się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.2). Ilość dodanego diklazurilu musi odpowiadać ilości diklazurilu znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku diklazurilu i piku wzorca wewnętrznego. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku diklazurilu lub piku wzorca wewnętrznego niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach ± 2 nm;

b) w zakresie od 230 do 320 nm widma próbki i wzorca zapisane w maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 230 do 320 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch niezależnych pomiarów wykonanych dla dwóch podpróbek nie może przekraczać:

— 30 % względem wyższej wartości, dla zawartości diklazurilu od 0,5 mg/kg do 2,5 mg/kg,

— 0,75 mg/kg dla zawartości diklazurilu od 2,5 mg/kg do 5 mg/kg,

— 15 % względem wyższej wartości, dla zawartości diklazurilu powyżej 5 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki odzysk musi wynosić co najmniej 80 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

Zorganizowano dwa porównania międzylaboratoryjne. W pierwszym, przeprowadzonym przez inną grupę laboratoriów w 1994 r., zbadano próbki dwóch premiksów (O 100, A 100) i trzy próbki mieszanek paszowych uzupełniających dla drobiu (L1, Z1, K1). Próbkę jednego premiksu wymieszano z matrycą organiczną (O 100), a drugiego – z matrycą nieorganiczną (A 100). Zawartość teoretyczna diklazurilu wynosiła 100 mg/kg. Analizę każdej próbki przeprowadzono raz lub dwukrotnie (bardziej szczegółowe informacje dotyczące pierwszego porównania międzylaboratoryjnego można znaleźć w Journal of AOAC International, tom 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361).

W drugim porównaniu międzylaboratoryjnym przeanalizowano trzy mieszanki paszowe dla drobiu zawierające diklazuril w stężeniach 0,9 mg/kg (MAT 1), 1,5 mg/kg (MAT 2) i ślepą próbkę paszy (MAT 3) (szczegółowe informacje dotyczące drugiego porównania można znaleźć w sprawozdaniu technicznym JRC (2016) i w Journal of AOAC International, tom 102, nr 2, 2019, s. 646–652). Wyniki obu porównań międzylaboratoryjnych przedstawiono w poniższej tabeli.

Próbka 1 A 100

Próbka 2O 100

Próbka 3 L1

Próbka 4 Z1

Próbka 5 K1

Próbka 6

MAT 1

Próbka 7

MAT 2

Próbka 8

MAT 3

L

11

11

11

11

6

10

9

10

n

19

18

19

19

12

20

18

10

Średnia (mg/kg)

100,8

103,5

0,89

1,15

0,89

1,0

1,5

< LOQ

Sr (mg/kg)

5,88

7,64

0,15

0,02

0,03

0,11

0,07

— CVr (%)

5,83

7,38

17,32

1,92

3,34

11,2

4,5

— SR (mg/kg)

7,59

7,64

0,17

0,11

0,12

0,18

0,21

— CVR (%)

7,53

7,38

18,61

9,67

13,65

18,1

14,3

— Zawartość nominalna (mg/kg)

100

100

1,0

1,0

1,0

0,9

1,5

— Źródło (*1)

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Pierwsze porównanie z 1 994 r.

Drugie porównanie z 2 015 r.

Drugie porównanie z 2 015 r.

Drugie porównanie z 2 015 r.

L =

liczba laboratoriów

n =

liczba pojedynczych wartości

Sr =

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr =

współczynnik zmienności powtarzalności

SR =

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR =

współczynnik zmienności odtwarzalności

LOQ =

granica oznaczalności

9. Uwagi ogólne

Należy uprzednio wykazać, że reakcja diklazurilu jest liniowa w zakresie mierzonych stężeń.

Przynajmniej w przypadku analizy diklazurilu w mieszankach paszowych o wysokiej zawartości tłuszczu (w tym przypadku przekraczającej 12 % tłuszczu) metodę analityczną można zastąpić innymi metodami opartymi na HPLC, np. metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS), pod warunkiem że metoda alternatywna ma równoważne parametry wydajności (stopień odzysku, precyzja w warunkach powtarzalności i odtwarzalności).

G) OZNACZANIE SOLI SODOWEJ LASALOCIDU

Sól sodowa polieterowego kwasu karboksylowego wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis

Zawartość soli sodowej lasalocidu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) z zastosowaniem detektora spektrofluometrycznego (fluorescencyjnego), jak opisano w pkt 1–8 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości soli sodowej lasalocidu w paszy. Granica wykrywalności wynosi 5 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Sól sodowa lasalocidu jest ekstrahowana z próbki zakwaszonym metanolem i oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (HPLC) przy wykorzystaniu detektora spektrofluorometrycznego (fluorescencyjnego).

3. Odczynniki

3.1.

Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)

3.2.

Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %

3.3.

Roztwór kwasu ortofosforowego, c = 20 %

Rozcieńczyć 23,5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.2) wodą do objętości 100 ml.

3.4.

6-metylo-2-heptyloamina(1,5-dimetyloheksyloamina), w (w/w) = 99 %

3.5.

Metanol do HPLC

3.6.

Kwas chlorowodorowy, gęstość = 1,19 g/ml

3.7.

Roztwór buforu fosforanowego, c = 0,01 mol/l

Rozpuścić 1,36 g KH2PO4 (pkt 3.1) w 500 ml wody (pkt 3.11), dodać 3,5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.2) i 10,0 ml 6-metylo-2-heptyloaminy (pkt 3.4). Dostosować pH do 4,0 przy użyciu roztworu kwasu ortofosforowego (pkt 3.3) i rozcieńczyć wodą (pkt 3.11) do objętości 1 000 ml.

3.8.

Zakwaszony metanol

Przenieść 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6) do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (pkt 3.5) i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.9.

Faza ruchoma HPLC: roztwór buforu fosforanowego i metanolu w stosunku 5 + 95 (V +V)

Zmieszać 5 ml roztworu buforu fosforanowego (pkt 3.7) i 95 ml metanolu (pkt 3.5).

3.10.

Substancja wzorcowa soli sodowej lasalocidu o gwarantowanej czystości, C34H53O8Na (sól sodowa polieterowego kwasu karboksylowego wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis), E 763.

3.10.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy soli sodowej lasalocidu, 500 μg/ml

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg soli sodowej lasalocidu (pkt 3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w zakwaszonym metanolu (pkt 3.8), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2.

Pośredni roztwór wzorcowy soli sodowej lasalocidu, 50 μg/ml

Przenieść pipetą 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego soli sodowej lasalocidu (pkt 3.10.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3.

Roztwory kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 μg soli sodowej lasalocidu w 1 ml. Roztwory sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.11.

Woda do HPLC

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Łaźnia ultradźwiękowa (lub łaźnia wodna z wytrząsaniem), z możliwością kontroli temperatury

4.2.

Filtry membranowe, 0,45 μm

4.3.

Zestaw HPLC z systemem dozowania, umożliwiający dozowanie 20 μl

4.3.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, w odwróconym układzie faz C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna

4.3.2.

Spektrofluorymetr z regulacją długości fali wzbudzenia i emisji

5. Sposób postępowania

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy

W celu przeprowadzenia testu odzysku (pkt 5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy, aby sprawdzić, czy badana pasza nie zawiera soli sodowej lasalocidu i substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana i nie może zawierać lasalocidu sodu ani interferujących substancji.

5.1.2. Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością soli sodowej lasalocidu, zbliżoną do tej, która znajduje się w próbce. Aby wzbogacić na poziomie 100 mg/kg, przenieść 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.10.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g paszy użytej do ślepej próbki, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie kilkakrotnie zamieszać i przejść do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością soli sodowej lasalocidu, o masie zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk oblicza się przez odjęcie od próbki wzbogaconej masy próbki niewzbogaconej.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Pasze

Zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 do 10 g próbki do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wyposażonej w korek. Dodać przy użyciu pipety 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.8). Zamknąć luźno korkiem i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) w temperaturze około 40 °C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Pozostawić kolbę na około godzinę, dopóki zawiesina nie opadnie, następnie przefiltrować podwielokrotną część przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.2) do odpowiedniego naczynia. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2. Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 2 g nierozdrobnionego premiksu do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (pkt 3.8) i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę z zawartością w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.1) w temperaturze około 40 °C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć do pełnej objętości zakwaszonym metanolem (pkt 3.8) i dokładnie wymieszać. Pozostawić kolbę na godzinę, dopóki zawiesina nie opadnie, następnie przefiltrować podwielokrotną część przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.2). Rozcieńczyć odpowiednią objętość klarownego filtratu przy użyciu zakwaszonego metanolu (pkt 3.8) w celu otrzymania finalnego roztworu do badań zawierającego około 4 μg/ml soli sodowej lasalocidu. Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3. Oznaczanie HPLC

5.3.1. Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile pozwalają uzyskać równoważne wyniki:

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.3.1):

125 mm × 4 mm, w odwróconym układzie faz C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.9):

Mieszanina roztworu buforu fosforanowego (pkt 3.7) i metanolu (pkt 3.5), 5 + 95 (V + V)

Prędkość przepływu:

1,2 ml/min

Długość fali przy detekcji:

Wzbudzenie: 310 nm

Emisja: 419 nm

Dozowana objętość:

20 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.10.3) zawierający 4,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.3.2. Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (pkt 3.10.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) piku na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3. Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakty próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików soli sodowej lasalocidu.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) piku otrzymanej po zadozowaniu roztworu próbki (pkt 5.3.3) określić stężenie soli sodowej lasalocidu (w μg/ml), odnosząc się do krzywej kalibracyjnej.

6.1. Pasze

Zawartość soli sodowej lasalocidu: w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (pkt 5.2.1)

V1

=

objętość w ml ekstraktu próbki zgodnie z pkt 5.2.1 (tj. 100)

m

=

masa naważki w g

6.2. Premiksy

Zawartość soli sodowej lasalocidu: w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (pkt 5.2.2)

V2

=

objętość w ml ekstraktu próbki zgodnie z pkt 5.2.2 (tj. 250)

f

=

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2.2

m

=

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1. Sprawdzenie tożsamości

Metody bazujące na detekcji spektrofluorometrycznej są mniej podatne na interferencje niż metody z zastosowaniem detekcji UV. Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą.

7.1.1. Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2.1 lub 5.2.2) jest wzbogacany odpowiednią ilością roztworu kalibracyjnego (pkt 3.10.3). Ilość dodanej soli sodowej lasalocidu musi odpowiadać ilości soli sodowej lasalocidu w ekstrakcie próbki. Po uwzględnieniu ilości dodanej soli sodowej lasalocidu i rozcieńczenia ekstraktu zwiększyć się może tylko wysokość piku soli sodowej lasalocidu. Szerokość piku w połowie wysokości musi mieścić się w zakresie ± 10 % oryginalnej szerokości piku niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 15 % względem wyższej wartości, dla zawartości soli sodowej lasalocidu od 30 mg/kg do 100 mg/kg,

— 15 mg/kg dla zawartości soli sodowej lasalocidu od 100 mg/kg do 200 mg/kg,

— 7,5 % względem wyższej wartości, dla zawartości soli sodowej lasalocidu powyżej 200 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki paszy odzysk nie może być niższy niż 80 %. W przypadku wzbogaconych próbek premiksów odzysk nie może być niższy niż 90 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego (*2) laboratoriów przeprowadziło analizę 2 premiksów (próbki 1 i 2) oraz 5 pasz (próbki 3–7). Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 1

Premiks dla kurcząt

Próbka 2

Premiks dla indyków

Próbka 3

Śruty dla indyków

Próbka 4

Granulki dla kurcząt

Próbka 5

Pasza dla indyków

Próbka 6

Pasza dla drobiu A

Próbka 7

Pasza dla drobiu B

L

12

12

12

12

12

12

12

n

23

23

23

23

23

23

23

Średnia [mg/kg]

5 050

16 200

76,5

78,4

92,9

48,3

32,6

sr [mg/kg]

107

408

1,71

2,23

2,27

1,93

1,75

CVr [%]

2,12

2,52

2,24

2,84

2,44

4,00

5,37

sR [mg/kg]

286

883

3,85

7,32

5,29

3,47

3,49

CVR [%]

5,66

5,45

5,03

9,34

5,69

7,18

10,70

Zawartość nominalna [mg/kg]

5 000 (*3)

16 000 (*3)

80 (*3)

105 (*3)

120 (*3)

50 ((+))

35 ((+))

L=

liczba laboratoriów

n=

liczba poszczególnych wyników

sr=

odchylenie standardowe powtarzalności

sR=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVr=

współczynnik zmienności powtarzalności w %

CVR=

współczynnik zmienności odtwarzalności w %

H) OZNACZANIE CHLOROWODORKU AMPROLIUM

monochlorowodorek chlorku 1-[(4-amino-2-propylo-5-pirymidynylo)metylo]-2-metylopirydyny

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości amprolium w paszy. Granica wykrywalności wynosi 1 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana mieszaniną metanolu i wody. Po rozcieńczeniu fazą ruchomą i filtrowaniu przez filtr membranowy zawartość amprolium jest oznaczana metodą kationowymiennej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy wykorzystaniu detektora UV.

3. Odczynniki

3.1.

Metanol

3.2.

Acetonitryl do HPLC

3.3.

Woda do HPLC

3.4.

Roztwór diwodorofosforanu sodu, c = 0,1 mol/l

Rozpuścić 13,80 g monohydratu diwodorofosforanu sodu w wodzie (pkt 3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (pkt 3.3) i wymieszać.

3.5.

Roztwór nadchloranu sodu, c = 1,6 mol/l

Rozpuścić 224,74 g monohydratu nadchloranu sodu w wodzie (pkt 3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (pkt 3.3) i wymieszać.

3.6.

Faza ruchoma do HPLC (zob. objaśnienia pkt 9.1)

Mieszanina acetonitrylu (pkt 3.2), roztworu diwodorofosforanu sodu (pkt 3.4) i roztworu nadchloranu sodu (pkt 3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Przed użyciem przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm (pkt 4.3) i odgazować roztwór (np. przy zastosowaniu łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) co najmniej przez 15 minut).

3.7.

Substancja wzorcowa: czyste amprolium, chlorek 1-[(4-amino-2-propylo-5-pirymidynylo)metylo]-2-metylopirydyny, E 750 (zob. pkt 9.2)

3.7.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy amprolium, 500 μg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg amprolium (pkt 3.7) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w 80 ml metanolu (pkt 3.1) i umieścić kolbę na 10 minut w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4). Następnie doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Roztwór w temperaturze ≤ 4 °C zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.7.2.

Pośredni roztwór wzorcowy amprolium, 50 μg/ml

Przenieść pipetą 5,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym (pkt 3.8) i wymieszać. Roztwór w temperaturze ≤ 4 °C zachowuje stabilność przez miesiąc.

3.7.3.

Roztwory kalibracyjne

Przenieść 0,5, 1,0 i 2,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.2) do kolb miarowych o pojemności 50 ml. Uzupełnić do pełnej objętości fazą ruchomą (pkt 3.6) i wymieszać. Roztwory odpowiadają odpowiednio 0,5, 1,0 i 2,0 μg/ml amprolium. Roztwory sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.8.

Rozpuszczalnik ekstrakcyjny

Mieszanina metanolu (pkt 3.1) i wody, 2 + 1 (v + v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Zestaw HPLC z systemem dozowania, umożliwiający dozowanie 100 μl

4.1.1.

Kolumna do chromatografii cieczowej o wymiarach 125 mm × 4 mm, wymieniacz kationowy Nucleosil 10 SA, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

4.1.2.

Detektor UV z regulacją długości fali lub detektor diodowy

4.2.

Filtr membranowy, PTFE, 0,45 μm

4.3.

Filtr membranowy, 0,22 μm

4.4.

Łaźnia ultradźwiękowa

4.5.

Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

5. Sposób postępowania

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy

W celu przeprowadzenia testu odzysku (pkt 5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy, aby sprawdzić, czy nie zawiera ona amprolium i substancji interferujących. Ślepa próbka paszy musi być podobnego rodzaju co próbka badana, a jej analiza nie może potwierdzać obecności amprolium lub substancji interferujących.

5.1.2. Test odzysku

Należy przeprowadzić test odzysku, analizując ślepą próbkę paszy wzbogaconą znaną ilością amprolium, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Aby wzbogacić na poziomie 100 mg/kg, dodać 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (pkt 3.7.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g paszy przeznaczonej do ślepej próbki, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie kilkakrotnie zamieszać i przejść do etapu ekstrakcji (pkt 5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próbki paszy podobnego rodzaju co próbka badana (zob. pkt 5.1.1), można przeprowadzić test odzysku, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana znaną ilością amprolium, zbliżoną do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niewzbogaconą próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki wzbogaconej masy próbki niewzbogaconej.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Premiksy (zawartość amprolium < 1 %) i pasza

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 do 40 g próbki, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (pkt 4.5). Rozcieńczyć podwielokrotną część ekstraktu fazą ruchomą (pkt 3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i wymieszać (zob. objaśnienia pkt 9.3). Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (pkt 4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.2.2. Premiksy (zawartość amprolium ≥ 1 %)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 1 do 4 g premiksu, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (pkt 3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (pkt 4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (pkt 4.5). Rozcieńczyć podwielokrotną część ekstraktu fazą ruchomą (pkt 3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i wymieszać. Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (pkt 4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (pkt 5.3).

5.3. Oznaczanie HPLC

5.3.1. Parametry:

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.1.1):

125 mm × 4 mm, wymieniacz kationowy Nucleosil 10 SA, wypełnienie 5 lub 10 μm, lub równoważna

Faza ruchoma (pkt 3.6):

mieszanina acetonitrylu (pkt 3.2), roztworu diwodorofosforanu sodu (pkt 3.4) i roztworu nadchloranu sodu (pkt 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v)

Prędkość przepływu:

0,7 –1 ml/min

Długość fali przy detekcji:

264 nm

Dozowana objętość:

100 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (pkt 3.7.3) zawierający 1,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2. Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z kalibracyjnych roztworów (pkt 3.7.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych i odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3. Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (pkt 5.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików amprolium.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików amprolium roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (pkt 5.3.2).

Zawartość amprolium: w (w mg/kg) próbki oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

V

=

objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego w ml (pkt 3.8) zgodnie z pkt 5.2 (tj. 200 ml)

c

=

stężenie amprolium w μg/ml w ekstrakcie próbki (5.2)

f

=

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2

m

=

masa naważki w g

7. Sprawdzenie metody

7.1. Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (pkt 5.2) i roztworu kalibracyjnego (pkt 3.7.3) zawierającego 2,0 μg/ml.

7.1.1. Chromatografia równoległa

Ekstrakt próbki (pkt 5.2) wzbogaca się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (pkt 3.7.3). Ilość dodanego amprolium musi odpowiadać ilości amprolium znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku amprolium. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku amprolium niewzbogaconego ekstraktu próbki.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

a) długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widm próbki i wzorca zapisana w maksimum piku na chromatogramie musi być taka sama, w granicach marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach ± 2 nm;

b) w zakresie od 210 do 320 nm widma próbki i wzorca zapisane w maksimum piku na chromatogramie nie mogą się różnić dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % względnej absorbancji. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między dwoma widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji wzorca analitycznego;

c) w zakresie od 210 do 320 nm widma strony wstępującej, maksimum i strony zstępującej piku ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie od 10 do 100 % absorbancji względnej. Kryterium jest spełnione, jeżeli występują te same maksymalne wartości i w ramach żadnego z obserwowanych punktów rozbieżność między widmami nie jest większa niż 15 % absorbancji widma maksimum piku.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 15 % względem wyższej wartości dla zawartości amprolium od 25 mg/kg do 500 mg/kg,

— 75 mg/kg dla zawartości amprolium od 500 do 1 000 mg/kg,

— 7,5 % względem wyższej wartości dla zawartości amprolium powyżej 1 000 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki odzysk musi wynosić co najmniej 90 %.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W ramach porównania międzylaboratoryjnego przeprowadzono analizę trzech pasz dla drobiu (próbki 1–3), mieszanki paszowej mineralnej (próbka 4) i premiksu (próbka 5). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

Próbka 1 (ślepa próbka paszy)

Próbka 2

Próbka 3

Próbka 4

Próbka 5

L

14

14

14

14

15

n

56

56

56

56

60

Średnia [mg/kg]

– 45,5

188

5 129

25 140

sr [mg/kg]

– 2,26

3,57

178

550

CVr [%]

– 4,95

1,90

3,46

2,20

sR [mg/kg]

– 2,95

11,8

266

760

CVR [%]

– 6,47

6,27

5,19

3,00

Zawartość nominalna [mg/kg]

– 50

200

5 000

25 000

L:

liczba laboratoriów

n:

liczba pojedynczych wartości

sr:

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr:

współczynnik zmienności powtarzalności

sR:

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR:

współczynnik zmienności odtwarzalności

9. Objaśnienia

9.1.

Jeżeli próbka zawiera tiaminę, pik tiaminy na chromatogramie ukazuje się na krótko przed pikiem amprolium. W tej metodzie amprolium i tiaminę należy rozdzielić. Jeżeli amprolium i tiamina nie zostaną rozdzielone w kolumnie (pkt 4.1.1) użytej w tej metodzie, zastąpić do 50 % acetonitrylu fazy ruchomej (pkt 3.6) metanolem.

9.2.

Według Farmakopei Brytyjskiej widmo roztworu amprolium: (c = 0,02 mol/l) w kwasie chlorowodorowym (c = 0,1 mol/l) wykazuje maksima przy 246 nm i 262 nm. Absorbancja musi wynieść 0,84 przy 246 nm i 0,80 przy 262 nm.

9.3.

Ekstrakt zawsze rozcieńcza się fazą ruchomą, gdyż w przeciwnym razie czas retencji piku amprolium może się znacznie przesunąć z uwagi na zmiany siły jonowej.

I) OZNACZANIE NARAZYNY

Zawartość narazyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

J) OZNACZANIE NIKARBAZYNY

Zawartość nikarbazyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN 15782 Pasze – Oznaczanie nikarbazyny – Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

K) OZNACZANIE DEKOKWINATU

Zawartość dekokwinatu ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN 16162 Pasze – Oznaczanie dekokwinatu metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

L) OZNACZANIE MONENZYNY

Zawartość monenzyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

M) OZNACZANIE SALINOMYCYNY

Zawartość salinomycyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN ISO 14183 Pasze – Oznaczanie zawartości monenzyny, narazyny i salinomycyny – Metoda chromatografii cieczowej z derywatyzacją pokolumnową.

N) OZNACZANIE SEMDURAMYCYNY

Zawartość semduramycyny ma być oznaczana z wykorzystaniem:

— metody analizy przewidzianej w normie EN 17299 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Badania przesiewowe i oznaczanie zautoryzowanych kokcydiostatyków na poziomie dodatków i 1 % oraz 3 % zanieczyszczeń krzyżowych a także niezarejestrowanych kokcydiostatyków oraz jednego antybiotyku na poziomie pozostałości w mieszankach paszowych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS) lub

— metody określonej w normie EN 16158 Pasze – Oznaczanie zawartości semduramycyny – Metoda chromatografii cieczowej z zastosowaniem »rozgałęzionego« podejścia analitycznego.

O) NORMY EN

Do celów stosowania art. 34 ust. 2 lit. a) rozporządzenia (UE) 2017/625 istotne są następujące normy EN:

EN ISO 30024 Pasze – Oznaczanie aktywności fitazy

EN 17050 Pasze – Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie jodu w paszach metodą ICP-MS

EN 17550 Pasze: Oznaczanie karotenoidów w mieszankach paszowych dla zwierząt i w premiksach metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej – Detekcja UV (HPLC-UV)

EN 15784 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Bacillus spp.

EN 15785 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Bifidobacterium spp.

EN 15786 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Pediococcus spp.

EN 15787 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Lactobacillus spp. stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15788 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Enterococcus (E. faecium) spp. stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15789 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Wykrywanie i oznaczanie liczby Saccharomyces cerevisiae stosowanych jako dodatek do pasz

EN 15510 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, kobaltu, molibdenu i ołowiu z zastosowaniem ICP-AES (do celów analizy dodatków paszowych kobalt i molibden)

EN 15621 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, siarki, żelaza, cynku, miedzi, manganu i kobaltu po mineralizacji ciśnieniowej metodą ICP-AES (do celów analizy kobaltu jako dodatku paszowego)

EN 16159 Pasze – Oznaczanie selenu metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z generowaniem wodorków (HGAAS) po trawieniu z zastosowaniem mikrofal (trawienie 65 % kwasem azotowym(V) i 30 % nadtlenkiem wodoru) (do analizy selenu jako dodatku paszowego)

EN 17053: Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pierwiastków śladowych, metali ciężkich i innych pierwiastków w paszy metodą ICP-MS (metoda wielopierwiastkowa) (do analizy kobaltu, molibdenu i selenu jako dodatków paszowych)

”

(1) Metoda analizy przewidziana w normie EN 17547 jest określana jako metoda alternatywna stosowana do celów urzędowej kontroli oznaczania witamin A i E zamiast metody opisanej dla oznaczania witaminy A w części A niniejszego załącznika oraz witaminy E w części B niniejszego załącznika.

(2) Przeprowadzone przez grupę roboczą ds. pasz Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3) Metoda analizy przewidziana w normie EN 17547 jest określana jako metoda alternatywna stosowana do celów urzędowej kontroli oznaczania witamin A i E zamiast metody opisanej dla oznaczania witaminy A w części A niniejszego załącznika oraz witaminy E w części B niniejszego załącznika.

(4) Przeprowadzone przez grupę roboczą ds. pasz Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(5) Metoda ta została zwalidowana w drodze porównania międzylaboratoryjnego obejmującego różne matryce paszowe. Dodatkowe informacje można znaleźć na stronie https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6) Inne metody mineralizacji mogą być stosowane, pod warunkiem iż wykazano, że zapewniają podobne wyniki (np. mineralizacja ciśnieniowo-mikrofalowa).

(7) Zielonki świeże lub suszone mogą zawierać duże ilości krzemionki roślinnej, która może zawierać pierwiastki śladowe i którą trzeba usunąć. Dlatego też w przypadku analizy próbek takich pasz należy zastosować następujące, zmodyfikowane postępowanie. Postępować w sposób określony w pkt 5.1.1.1 do etapu filtrowania. Następnie należy dwukrotnie wrzącą wodą przemyć bibułę filtracyjną zawierającą nierozpuszczalną pozostałość i umieścić w kwarcowym lub platynowym tyglu.

Należy włączyć piec muflowy (4.1), nastawić temperaturę poniżej 550 °C i poczekać, aż całkowicie zniknie wszelki materiał zawierający węgiel. Pozostawić do ostygnięcia, dodać kilka kropli wody, a następnie 10–15 ml kwasu fluorowodorowego (3.4) i odparować do osiągnięcia suchości w temperaturze około 150 °C. Jeśli w pozostałościach pozostanie krzemionka, to należy ponownie rozpuścić tę pozostałość w kilku mililitrach kwasu fluorowodorowego (3.4) i odparować aż do osiągnięcia suchości. Dodać pięć kropli kwasu siarkowego (3.5) i podgrzewać do momentu, gdy przestanie wytwarzać się biały dym. Po dodaniu 5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i około 30 ml wody podgrzać, przefiltrować roztwór do kolby miarowej o pojemności 250 ml i dopełnić wodą do pełnej objętości (stężenie HCl około 0,5 mol/l). Następnie należy wykonać oznaczenie zgodnie z pkt 5.1.2.

(8) »The Analyst« 108 z 1983 r., s. 1252–1256.

(9) Metoda ta może być również stosowana do oznaczania diklazurilu w materiałach paszowych.

(10) Większa stabilność (do 1 roku) może być możliwa, ale musi zostać potwierdzona przez dane laboratorium.

(*1) Pierwsze porównanie z 1994 r.: Journal of AOAC International, tom 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361; drugie porównanie z 2015 r.: sprawozdanie techniczne JRC Re-validation of a method for the determination of diclazuril by collaborative study [Ponowna walidacja metody oznaczania diklazurilu w ramach porównania międzylaboratoryjnego] (2016).

(*2) Analyst nr 120 z 1995 r., s. 2175–2180.

(*3) Zawartość zadeklarowana przez producenta.

((+)) Pasza przygotowana w laboratorium.