Załącznik V

„ZAŁĄCZNIK V

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI NIEPOŻĄDANYCH SUBSTANCJI W PASZACH

A) OZNACZANIE POZIOMÓW DIOKSYN (PCDD/PCDF) I PCB

ROZDZIAŁ I

Metody pobierania próbek i interpretacja wyników analitycznych

1. Zakres i definicje

Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli poziomów polichlorowanych dibenzo-p-dioksyn (PCDD), polichlorowanych dibenzofuranów (PCDF), dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli (PCB) (1) oraz niedioksynopodobnych PCB w paszy pobiera się zgodnie z przepisami załącznika I. Należy stosować wymagania ilościowe w stosunku do kontroli substancji lub produktów jednorodnie rozmieszczonych w paszy, zgodnie z załącznikiem I pkt 5.1. Otrzymane w ten sposób próbki zbiorcze uznaje się za próbki reprezentatywne dla partii lub podpartii, z których zostały pobrane. Zgodność z najwyższymi dopuszczalnymi poziomami ustanowionymi w dyrektywie 2002/32/WE ustala się na podstawie poziomów oznaczonych w próbkach laboratoryjnych.

Do celów niniejszej części zastosowanie mają definicje określone w załączniku I do rozporządzenia wykonawczego Komisji (UE) 2021/808 (2).

Oprócz tych definicji do celów niniejszej części stosuje się następujące definicje:

»Metody przesiewowe« oznaczają metody wykorzystywane do wyboru próbek, w których poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczają najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania. Pozwalają one na względnie tanie i szybkie oznaczanie dużej liczby próbek, zwiększając w ten sposób szanse na wykrycie nowych przypadków wysokiego narażenia i ryzyka dla zdrowia konsumentów. Metody przesiewowe muszą opierać się na metodach bioanalitycznych lub metodach GC-MS. Wyniki uzyskane z próbek, które przekraczają wartość graniczną zastosowaną na potrzeby kontroli zgodności z najwyższym dopuszczalnym poziomem, należy zweryfikować, wykonując ponownie pełną analizę oryginalnej próbki laboratoryjnej z wykorzystaniem metody potwierdzającej.

»Metody potwierdzające” oznaczają metody, które dostarczają pełnych lub uzupełniających informacji pozwalających na jednoznaczną identyfikację i ilościowe oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub w razie potrzeby na poziomie reagowania. W metodach tych wykorzystuje się chromatografię gazową z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (GC-HRMS) lub chromatografię gazową z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS).

2. Zgodność partii lub podpartii z najwyższym dopuszczalnym poziomem

2.1. W odniesieniu do niedioksynopodobnych PCB

Partia lub podpartia są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem, jeżeli wynik analizy sumy PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180 (zwanych dalej niedioksynopodobnymi PCB) nie przekracza, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru, najwyższego dopuszczalnego poziomu ustanowionego w dyrektywie 2002/32/WE (3). Partia lub podpartia nie są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem ustanowionym w dyrektywie 2002/32/WE, jeżeli średnia dwóch wyników uzyskanych metodą granicy oznaczalności (4) z zastosowaniem analizy powtórnej (5), z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru przekracza ponad wszelką wątpliwość najwyższy dopuszczalny poziom, tj. do oceny zgodności wykorzystywane jest przeanalizowane stężenie po odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Niepewność rozszerzoną pomiaru oblicza się przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, który daje poziom ufności około 95 %. Partia lub podpartia są niezgodne z wymogami, jeśli średnia mierzonych wartości po odjęciu niepewności rozszerzonej średniej jest wyższa niż najwyższy dopuszczalny poziom.

Zasady wymienione w powyższych akapitach niniejszego punktu mają zastosowanie do wyniku analizy otrzymanego z próbki pobranej do celów kontroli urzędowej. W przypadku analizy do celów drugiej ekspertyzy lub do celów referencyjnych zastosowanie mają przepisy krajowe.

2.2. W odniesieniu do PCDD/F i dioksynopodobnych PCB

Partia lub podpartia jest zgodna z wymaganiami dotyczącymi najwyższego dopuszczalnego poziomu, jeżeli wynik pojedynczej analizy:

— przeprowadzonej metodą przesiewową przy wskaźniku ilości wyników fałszywie negatywnych poniżej 5 % wskazuje, że poziom nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w dyrektywie 2002/32/WE,

— przeprowadzonej metodą potwierdzającą nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w dyrektywie 2002/32/WE, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Dla badań przesiewowych należy ustalić wartość graniczną na potrzeby decyzji o zgodności próbki z odpowiednimi najwyższymi dopuszczalnymi poziomami ustanowionymi albo dla PCDD/F, albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

Partia lub podpartia nie są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem ustanowionym w dyrektywie 2002/32/WE, jeżeli średnia dwóch wyników analizy uzyskanych metodą granicy oznaczalności (6) z wykorzystaniem analizy powtórnej,

(7) przy zastosowaniu metody potwierdzającej, z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru, przekracza ponad wszelką wątpliwość najwyższy dopuszczalny poziom, tj. do oceny zgodności wykorzystywane jest przeanalizowane stężenie po odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Niepewność rozszerzoną pomiaru oblicza się przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, który daje poziom ufności około 95 %. Partia lub podpartia są niezgodne z wymogami, jeśli średnia mierzonych wartości po odjęciu niepewności rozszerzonej średniej jest wyższa niż najwyższy dopuszczalny poziom.

Należy zastosować sumę szacowanych niepewności rozszerzonych dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

Zasady wymienione w powyższych akapitach niniejszego punktu mają zastosowanie do wyniku analizy otrzymanego z próbki pobranej do celów kontroli urzędowej. W przypadku analizy do celów obrony praw lub do celów referencyjnych zastosowanie mają przepisy krajowe.

3. Wyniki przekraczające poziomy reagowania ustanowione w załączniku II do dyrektywy 2002/32/WE

Poziomy reagowania są narzędziem wyboru próbek w przypadkach wymagających zidentyfikowania źródła zanieczyszczeń i podjęcia działań, aby je zredukować lub zlikwidować. W metodach przesiewowych określa się odpowiednie wartości graniczne dla wyboru tych próbek. Jeśli zidentyfikowanie źródła i zredukowanie lub usunięcie zanieczyszczenia wymaga znacznego wysiłku, należy potwierdzić przekroczenie poziomu reagowania analizą powtórną przy zastosowaniu metody potwierdzającej i przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru (8).

ROZDZIAŁ II

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK I WYMAGANIA DOTYCZĄCE METOD ANALIZY STOSOWANYCH W URZĘDOWEJ KONTROLI POZIOMÓW DIOKSYN (PCDD/F) I DIOKSYNOPODOBNYCH PCB W PASZY

1. Zakres stosowania

Wymogi ustanowione w niniejszym rozdziale stosuje się w przypadku paszy analizowanej do celów urzędowych kontroli poziomów PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dioksynopodobnych PCB oraz w odniesieniu do przygotowywania próbek oraz wymogów analitycznych do innych celów regulacyjnych, co obejmuje kontrole wykonywane przez podmiot działający na rynku pasz w celu zapewnienia zgodności z przepisami rozporządzenia (WE) nr 183/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady (9).

Monitorowanie obecności PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w paszy można przeprowadzać przy wykorzystaniu dwóch różnych typów metod analitycznych:

a) Metody przesiewowe

Celem metod przesiewowych jest wybór próbek o poziomach PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczających najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania. Metody przesiewowe zapewniają względnie tanie i szybkie oznaczanie dużej liczby próbek, zwiększając w ten sposób szanse na wykrycie nowych przypadków wysokiego narażenia i ryzyka dla zdrowia konsumentów. Ich stosowanie ma na celu unikanie wyników fałszywie negatywnych. Mogą obejmować metody bioanalityczne i metody GC-MS.

Metody przesiewowe porównują wynik analizy z wartością graniczną, dając odpowiedź tak/nie odnośnie do ewentualnego przekroczenia najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach podejrzanych o to, że są niezgodne z wymogami dotyczącymi najwyższego dopuszczalnego poziomu, oznacza się lub potwierdza przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

Ponadto metody przesiewowe mogą dać wskazania odnośnie do poziomów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB obecnych w próbce. W przypadku stosowania bioanalitycznych metod przesiewowych wynik wyrażony jest w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ), a w przypadku stosowania fizykochemicznych metod GC-MS – jest on wyrażony w równoważnikach toksyczności (TEQ). Wyniki metod przesiewowych wyrażone liczbowo są odpowiednie do celów wykazywania zgodności, podejrzewanej niezgodności z wymogami lub przekroczenia poziomów reagowania; wskazują one również na zakres poziomów w przypadku, gdy następnie zastosowane zostaną metody potwierdzające. Nie są one odpowiednie do celów takich, jak ocena poziomów tła, oszacowanie pobrania, śledzenie tendencji poziomów w czasie oraz ponowna ocena poziomów reagowania i najwyższych dopuszczalnych poziomów.

b) Metody potwierdzające

Metody potwierdzające pozwalają na jednoznaczną identyfikację i kwantyfikację PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbce i dostarczają pełnych informacji na temat ilości poszczególnych kongenerów. Dlatego metody te pozwalają na kontrolę najwyższych dopuszczalnych poziomów i poziomów reagowania, w tym potwierdzanie wyników uzyskanych metodami przesiewowymi. Ponadto wyniki mogą być wykorzystywane do innych celów, takich jak oznaczanie niskich poziomów tła w monitorowaniu paszy, śledzenie tendencji w czasie, ocena narażenia oraz tworzenie bazy danych na potrzeby ewentualnej ponownej oceny poziomów reagowania i najwyższych dopuszczalnych poziomów. Są one także ważne dla ustanowienia profili kongenerów w celu zidentyfikowania źródła ewentualnego zanieczyszczenia. Metody te wykorzystują GC-HRMS. W celu potwierdzenia zgodności lub niezgodności z wymogami dotyczącymi najwyższego dopuszczalnego poziomu można również wykorzystywać GC-MS/MS.

2. Informacje podstawowe

W celu obliczenia stężeń wyrażonych jako stężenia TEQ należy pomnożyć stężenia poszczególnych substancji w danej próbce przez ich odpowiednie współczynniki równoważne toksyczności (TEF) (zob. rozdział I przypis 27), a następnie zsumować je, co da łączne stężenie związków dioksynopodobnych wyrażone jako TEQ.

Do celów niniejszej części A przyjęta swoista granica oznaczalności danego kongeneru jest to najniższa zawartość analitu, którą można zmierzyć z należytą pewnością statystyczną przy spełnieniu kryteriów identyfikacji opisanych w normach uznanych międzynarodowo, na przykład w normie EN 16215:2012 (Pasze – Oznaczanie zawartości dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w najnowszych wersjach metod EPA 1613 i 1668.

Granicę oznaczalności danego kongeneru można określić jako:

a) stężenie analitu w ekstrakcie próbki, które wywołuje odpowiedź instrumentu dla dwóch różnych jonów, monitorowaną przy stosunku sygnału do szumu (S/N) wynoszącym 3:1 dla mniej intensywnego sygnału danych surowych; lub

b) jeżeli z powodów technicznych obliczanie stosunku sygnału do szumu nie daje wiarygodnych wyników – najniższe stężenie na krzywej wzorcowej, które daje akceptowalne (≤ 30 %) i stałe (mierzone przynajmniej na początku i na końcu serii analitycznej próbek) odchylenie od średniego względnego współczynnika odpowiedzi obliczonego dla wszystkich punktów na krzywej wzorcowej w każdej serii próbek. Granica oznaczalności (LOQ) jest obliczana na podstawie najniższego stężenia na krzywej z uwzględnieniem odzysku wzorców wewnętrznych i wielkości próbki.

Bioanalityczne metody przesiewowe nie dają wyników na poziomie kongenerów, a jedynie wskazanie (10) poziomu TEQ wyrażonego w BEQ, aby uwzględnić fakt, że nie wszystkie związki obecne w ekstrakcie próbki, które wywołują odpowiedź w badaniu, spełniają wszystkie wymagania zasady TEQ.

Metody przesiewowe i potwierdzające mogą być stosowane tylko do kontroli niektórych matryc, jeżeli metody te są dostatecznie czułe, aby w sposób wiarygodny wykrywać substancje na poziomie reagowania lub najwyższym dopuszczalnym poziomie.

3. Wymagania dotyczące zapewniania jakości

3.1.

Należy wprowadzić niezbędne środki w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego na każdym etapie pobierania i analizy próbek.

3.2.

Próbki przechowuje się i transportuje w pojemnikach szklanych, aluminiowych, polipropylenowych lub polietylenowych nadających się do tego celu i niemających wpływu na poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach. Pojemnik na próbki należy oczyścić z pyłu papierowego.

3.3.

Przechowywanie i przewożenie odbywa się w sposób zachowujący integralność próbki paszy.

3.4.

W razie potrzeby każdą próbkę laboratoryjną należy drobno zmielić i dokładnie wymieszać w sposób gwarantujący pełną homogenizację (np. w sposób umożliwiający przesianie przez sito o oczku 1 mm). Jeżeli zawartość wilgoci jest zbyt wysoka, próbki muszą zostać osuszone przed mieleniem.

3.5.

Należy przeprowadzić kontrolę odczynników, aparatury i szkła laboratoryjnego pod kątem ewentualnego wpływu na wyniki oparte na TEQ lub BEQ.

3.6.

Należy przeprowadzić próbę ślepą, obejmującą przeprowadzenie pełnej procedury analitycznej, ale bez próbki.

3.7.

W przypadku metod bioanalitycznych należy upewnić się, że szkło laboratoryjne i rozpuszczalniki stosowane podczas analizy są wolne od związków przeszkadzających w wykrywaniu związków docelowych w zakresie roboczym. Szkło należy przemyć rozpuszczalnikami lub ogrzać do temperatur, w których z powierzchni usuwane są pozostałości PCDD/F, związków dioksynopodobnych i związków interferujących.

3.8.

Ilość próbki stosowanej do ekstrakcji musi być wystarczająca do spełnienia wymogów dotyczących wystarczająco niskiego zakresu roboczego, obejmującego stężenia na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub na poziomie reagowania.

3.9.

Konkretne procedury przygotowania próbki stosowane do badanych produktów muszą być zgodne z międzynarodowymi wytycznymi, tj. EN ISO 6498.

4. Wymagania dotyczące laboratoriów

4.1.

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (UE) 2017/625 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z wytyczną ISO/IEC 58, aby zapewnić, że przy przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. Należy stosować zasady opisane w wytycznych technicznych dotyczących szacowania niepewności pomiaru i granic oznaczalności w odniesieniu do analizy PCDD/F i PCB. (11)

4.2.

Biegłość laboratoriów należy udowadniać stałym udanym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach paszy i zakresach stężeń.

4.3.

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek muszą nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

5. Podstawowe wymagania dotyczące procedury analitycznej dla dioksyn (PCDD/F) i dioksynopodobnych PCB

5.1. Niski zakres roboczy i granica oznaczalności

W przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą osiągnąć wysokie poziomy rzędu femtogramów (10-15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych spośród tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10-9 g) jest już wystarczająca. W przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów podstawionych w pozycji non-orto) dolna granica zakresu roboczego musi osiągnąć niskie poziomy rzędu pikogramów (10-12 g). W przypadku wszystkich pozostałych kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10-9 g) jest już wystarczająca.

5.2. Wysoka selektywność (swoistość)

5.2.1.

Konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń badanych analitów. W przypadku metod GC-MS konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, takimi jako kongenery toksyczne (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) i pozostałe kongenery.

5.2.2.

Metody bioanalityczne muszą być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F lub dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie pozytywne lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie negatywne.

5.3. Wysoka dokładność (poprawność i precyzja, odzysk testu biologicznego)

5.3.1.

W przypadku metod GC-MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako poprawność (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona w procentach) i precyzja (RSDR względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

5.3.2.

W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk testu biologicznego. Odzysk testu biologicznego jest to poziom BEQ obliczony z krzywej wzorcowej TCDD lub PCB 126, skorygowany o wynik dla próbki ślepej, a następnie podzielony przez poziom TEQ oznaczony metodą potwierdzającą. Jego celem jest korekta takich czynników, jak strata PCDD/F i związków dioksynopodobnych podczas ekstrakcji i oczyszczania, związki współekstrahowane zwiększające lub zmniejszające odpowiedź (efekt agonistyczny lub antagonistyczny), jakość dopasowania krzywej lub różnice między wartościami TEF a wartościami względnego potencjału działania (REP). Odzysk testu biologicznego jest obliczany na podstawie odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie udziału.

5.4. Walidacja w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu oraz środki ogólnej kontroli jakości

5.4.1.

Laboratoria muszą wykazać wydajność metody w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu, np. 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu wraz z akceptowalną wartością współczynnika zmienności dla wielokrotnych powtórzeń analizy, podczas procedury walidacji oraz podczas rutynowej analizy.

5.4.2.

W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów odniesienia, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, prób wzbogaconych lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że wydajność analityczna jest zgodna z wymaganiami.

5.5. Granica oznaczalności

5.5.1.

W przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymogiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością graniczną. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu. Należy wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od procedury ślepej próby co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze współczynnika S/N lub ze ślepej próby.

5.5.2.

Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej powinna wynosić ok. jednej piątej najwyższego dopuszczalnego poziomu.

5.6. Kryteria analityczne

Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową, w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu należy spełnić poniższe kryteria dla wartości, odpowiednio, TEQ lub BEQ, niezależnie od tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ czy całkowita wartość BEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy oddzielnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB:

Bioanalityczna lub fizykochemiczna metoda przesiewowa

Metody potwierdzające

Wskaźnik ilości wyników fałszywie negatywnych (*1)

< 5 %

Poprawność

–20 % do +20 %

Powtarzalność (RSDr)

< 20 %

Precyzja pośrednia (RSDR)

< 25 %

< 15 %

5.7. Szczegółowe wymagania dotyczące metod przesiewowych

5.7.1.

W metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC-MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC-MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 6. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymagania ustanowione w pkt 7.

5.7.2.

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek muszą nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

5.7.3.

Weryfikacja wydajności metody przesiewowej jest wymagana podczas rutynowej analizy w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników negatywnych.

5.7.4.

Należy sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczności:

20 % ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową z dodanym 2,3,7,8-TCDD i bez, zgodnym z najwyższym dopuszczalnym poziomem lub poziomem reagowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje interferujące obecne w ekstrakcie próbki. Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej należy porównać do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy metodą potwierdzającą GC/HRMS. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

5.7.5.

Kontrola jakości próbek negatywnych

Około 2–10 % próbek negatywnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium, należy potwierdzić metodą GC/HRMS.

5.7.6.

Oznaczenie wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych z danych kontroli jakości

Należy oznaczyć wskaźnik ilości wyników fałszywie negatywnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Wskaźnik rzeczywistej ilości wyników fałszywie negatywnych nie może przekraczać 5 %. Po uzyskaniu co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/grupę matryc z kontroli jakości próbek negatywnych należy z tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych. Do tych 20 wyników, w celu oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych, można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas przypadków wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu. Próbki muszą obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

Chociaż badania przesiewowe powinny mieć na celu wykrywanie próbek przekraczających poziom reagowania, kryterium określania wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru metody potwierdzającej.

5.7.7.

Ewentualne pozytywne wyniki próbek z badania przesiewowego muszą zawsze zostać zweryfikowane za pomocą pełnej ponownej analizy oryginalnej próbki laboratoryjnej z zastosowaniem metody potwierdzającej. Próbki te mogą być też zastosowane do oceny wskaźnika wyników fałszywie pozytywnych. W przypadku metod przesiewowych wskaźnik wyników fałszywie pozytywnych to odsetek wyników potwierdzonych jako negatywne metodą potwierdzającą, które we wcześniejszych badaniach przesiewowych były uznane za potencjalnie pozytywne. Ocena korzyści metody przesiewowej opiera się na porównaniu próbek fałszywie pozytywnych z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Wskaźnik ten musi być na tyle niski, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

5.7.8.

Metody bioanalityczne w warunkach walidacji muszą dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ.

Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzanych w powtarzalnych warunkach wewnątrzlaboratoryjny RSDr byłby zwykle niższy niż w warunkach odtwarzalności (RSDR).

6. Szczegółowe wymagania dotyczące technik GC-MS w metodach przesiewowych lub potwierdzających

6.1. Dopuszczalne różnice między wynikami WHO-TEQ uzyskanymi metodą granicy oznaczalności i metodą zerową

Do celów potwierdzenia, że zostały przekroczone najwyższe dopuszczalne poziomy lub, w razie potrzeby, poziomy reagowania, różnica między wynikiem uzyskanym metodą granicy oznaczalności a wynikiem uzyskanym metodą zerową nie może przekraczać 20 %.

6.2. Kontrola poziomów odzysku

6.2.1.

Rozpoczynając analizę, np. przed ekstrakcją, należy dodać wzorce wewnętrzne PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wzorce wewnętrzne dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C w celu walidacji procedury analitycznej. Dodaje się co najmniej jeden kongener dla każdej grupy homologicznej, od tetra- do oktachlorowanego PCDD/F oraz co najmniej jeden kongener dla każdej grupy homologicznej dioksynopodobnych PCB (alternatywnie, co najmniej jeden kongener dla każdej funkcji monitorowania wybranego jonu w spektrometrii mas, służącej do monitorowania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod potwierdzających należy zastosować wszystkie 17 wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wszystkie 12 wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C.

6.2.2.

Dla tych kongenerów, dla których nie zastosowano analogów znakowanych izotopem węgla 13C, należy również oznaczyć względne współczynniki odpowiedzi przez zastosowanie odpowiednich roztworów kalibracyjnych.

6.2.3.

W przypadku paszy pochodzenia roślinnego i paszy pochodzenia zwierzęcego zawierającej mniej niż 10 % tłuszczu dodawanie wzorców wewnętrznych przed ekstrakcją jest obowiązkowe. W przypadku paszy pochodzenia zwierzęcego zawierającej więcej niż 10 % tłuszczu wzorce wewnętrzne należy dodać przed ekstrakcją tłuszczu albo po niej. Zależnie od etapu, na którym wprowadza się wzorce wewnętrzne, należy dokonać właściwej walidacji skuteczności ekstrakcji.

6.2.4.

Przed analizą GC-MS należy dodać 1 lub 2 wzorce odzysku (surogaty).

6.2.5.

Konieczna jest kontrola odzysku. Jeśli chodzi o metody potwierdzające, odzysk poszczególnych wzorców wewnętrznych musi mieścić się w zakresie od 60 do 120 %. Dopuszczalne są niższe lub wyższe wartości odzysku dla poszczególnych kongenerów, w szczególności dla niektórych hepta- i oktachlorowanych dibenzo-p-dioksyn i dibenzofuranów, jeżeli ich udział w wartości TEQ nie przekracza 10 % całkowitej wartości TEQ (na podstawie sumy PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod przesiewowych GC-MS odzysk powinien miesić się w zakresie od 30 do 140 %.

6.3. Usuwanie substancji interferujących

— Rozdzielenie PCDD/F od interferujących związków chlorowanych, takich jak niedioksynopodobne PCB czy polichlorowane difenyloetery, należy przeprowadzić przez zastosowanie odpowiednich technik chromatograficznych (najlepiej stosując kolumnę z florisilem, tlenkiem glinu lub węglem).

— Rozdzielanie izomerów metodą chromatografii gazowej musi wynosić < 25 % nakładania się pików pomiędzy 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

6.4. Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

Zakres krzywej wzorcowej musi obejmować odpowiednie zakresy najwyższych dopuszczalnych poziomów lub poziomów reagowania.

6.5. Szczegółowe kryteria dla metod potwierdzających

— Dla GC-HRMS:

Przy HRMS rozdzielczość powinna zazwyczaj być większa albo równa 10 000 dla całego zakresu masy przy 10 % dolinie.

Spełnienie dalszych kryteriów identyfikacji i potwierdzenia opisanych w normach uznanych międzynarodowo, na przykład w normie EN 16215:2012 (Pasze – Oznaczanie dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w najnowszych wersjach metod EPA 1613 i 1668.

— Dla GC-MS/MS:

Monitorowanie przynajmniej 2 określonych jonów macierzystych, z których każdy posiada jeden określony odpowiadający mu przejściowy jon potomny, dla wszystkich znakowanych i nieznakowanych analitów w zakresie analizy.

Najwyższa dopuszczalna tolerancja dla względnych intensywności jonów wynosząca ± 15 % dla wybranych przejściowych jonów potomnych w porównaniu z wartościami obliczonymi lub zmierzonymi (średnia z wzorców kalibracji), z zastosowaniem identycznych warunków MS/MS – w szczególności energii zderzenia i ciśnienia gazu przy zderzeniu – dla każdego przejścia analitu.

Rozdzielczość dla każdego kwadrupola określa się jako równą lub lepszą w stosunku do jednostkowej rozdzielczości masy (jednostkowa rozdzielczość masy: rozdzielczość wystarczająca do rozdzielenia dwóch pików oddalonych o jedną jednostkę masy) w celu zminimalizowania możliwych interferencji dotyczących danych analitów.

Spełnienie dalszych kryteriów opisanych w normach uznanych międzynarodowo, na przykład w normie EN 16215:2012 (Pasze – Oznaczanie dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w najnowszych wersjach metod EPA 1613 i 1668, z wyjątkiem obowiązku zastosowania GC-HRMS.

7. SZCZEGÓŁOWE WYMAGANIA DOTYCZĄCE METOD BIOANALITYCZNYCH

Metody bioanalityczne są to metody oparte na zasadach biologicznych, np. testy komórkowe, receptorowe lub immunologiczne. W niniejszym punkcie ustanowiono wymagania dla metod bioanalitycznych.

Metoda przesiewowa zasadniczo pozwala zaklasyfikować próbkę jako negatywną lub podejrzaną o bycie pozytywną. W tym celu obliczony poziom BEQ jest porównywany z wartością graniczną (zob. pkt 7.3). Próbki poniżej wartości granicznej są uznawane za negatywne, a próbki równe wartości granicznej lub ją przekraczające – za podejrzane o bycie pozytywnymi i wymagające analizy metodą potwierdzającą. W praktyce poziom BEQ odpowiadający 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu może posłużyć jako wartość graniczna, pod warunkiem że zapewnione są: wskaźnik liczby wyników fałszywie negatywnych poniżej 5 % i dopuszczalny wskaźnik wyników fałszywie pozytywnych. Przy odrębnych najwyższych dopuszczalnych poziomach dla PCDD/F i dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB sprawdzanie zgodności próbek bez frakcjonowania wymaga odpowiednich wartości granicznych testu biologicznego dla PCDD/F. Jako wartość graniczna do sprawdzenia próbek przekraczających poziomy reagowania wystarcza odpowiedni odsetek danego poziomu reagowania.

Jeśli orientacyjny poziom jest wyrażony w BEQ, wyniki próbek muszą być w zakresie roboczym i przekraczać poziom zgłaszania (zob. pkt 7.1.1 i 7.1.6).

7.1. Ocena odpowiedzi

7.1.1. Wymagania ogólne

— Podczas obliczania stężenia z krzywej wzorcowej TCDD wartości na górnej granicy krzywej wykazywać będą wysoką zmienność (wysoki współczynnik zmienności, CV). Zakres roboczy to obszar, w którym CV jest mniejszy niż 15 %. Dolna granica zakresu roboczego (poziom zgłaszania) musi zostać ustalona (co najmniej o współczynnik 3) powyżej ślepej próbki proceduralnej. Górna granica zakresu roboczego jest zwykle reprezentowana przez wartość EC70 (70 % najwyższego skutecznego stężenia), ale jest niższa, jeżeli CV jest wyższy niż 15 % w tym zakresie. Zakres roboczy musi być ustalony podczas walidacji. Wartości graniczne (zob. pkt 7.3) muszą mieścić się w zakresie roboczym.

— Roztwory wzorcowe i ekstrakty próbek należy zbadać trzykrotnie lub co najmniej dwukrotnie. Przy stosowaniu dwukrotnego badania roztwór wzorcowy lub ekstrakt kontrolny badany w 4–6 dołkach rozmieszczonych na płytce musi wywołać odpowiedź lub dać stężenie (możliwe tylko w zakresie roboczym) w oparciu o CV < 15 %.

7.1.2. Kalibracja

7.1.2.1. Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

— Poziomy w próbkach należy oszacować przez porównanie odpowiedzi badania z krzywą wzorcową TCDD (lub PCB 126 albo mieszaniny wzorcowej PCDD/PCDF/dioksynopodobnych PCB) w celu obliczenia poziomu BEQ w ekstrakcie, a następnie w próbce.

— Krzywe wzorcowe powinny zawierać 8–12 stężeń (co najmniej w dwukrotnym badaniu) z wystarczającą liczbą stężeń w dolnych zakresach krzywej (zakres roboczy). Szczególną uwagę należy zwrócić na jakość dopasowania krzywej w roboczym zakresie. Wartość R2 jako taka ma niewielkie lub żadne znaczenie przy szacowaniu dopasowania w regresji nieliniowej. Lepsze dopasowanie jest osiągane poprzez minimalizowanie różnicy między obliczanym a obserwowanym poziomem w zakresie roboczym krzywej, np. przez minimalizowanie sumy kwadratów reszt.

— Oszacowany poziom w ekstrakcie próbki jest następnie korygowany o poziom BEQ obliczany dla ślepej próbki matrycowej lub odczynnikowej (aby uwzględnić zanieczyszczenia z zastosowanych rozpuszczalników i chemikaliów) oraz odzysk (obliczany z poziomu BEQ odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie zbliżonym do wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania). Dla przeprowadzenia korekty odzysku odzysk musi zawsze mieścić się w wymaganym zakresie (zob. pkt 7.1.4). Próbki referencyjne stosowane do korekty odzysku muszą być zgodne z wymaganiami podanymi w pkt 7.2.

7.1.2.2. Kalibracja przy zastosowaniu próbek referencyjnych

Alternatywnie można zastosować krzywą wzorcową przygotowaną na co najmniej czterech próbkach referencyjnych (zob. pkt 7.2.4): można wykorzystać jedną ślepą próbkę matrycową plus trzy próbki referencyjne o wartości 0,5-, 1- i 2-krotnego najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, eliminując potrzebę korekty o próbkę ślepą i odzysk, jeżeli właściwości matrycy próbek referencyjnych odpowiadają właściwościom nieznanych próbek. W takim przypadku odpowiedź badania stanowiąca 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu (zob. pkt 7.3) można obliczyć bezpośrednio z tych próbek i zastosować jako wartość graniczną. Dla sprawdzenia próbek przekraczających poziomy reagowania jako wartość graniczna wystarcza odpowiedni odsetek tych poziomów reagowania.

7.1.3. Oddzielne oznaczanie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB

Ekstrakty można rozdzielać na frakcje zawierające PCDD/F i dioksynopodobne PCB, umożliwiając oddzielne oznaczanie poziomów TEQ dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB (wyrażonych w BEQ). Do oceny wyników dla frakcji zawierającej dioksynopodobne PCB najlepiej zastosować standardową krzywą wzorcową PCB 126.

7.1.4. Odzysk testu biologicznego

»Odzysk testu biologicznego« należy obliczyć dla odpowiednich próbkach referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów w granicach najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania i wyrazić jako odsetek poziomu BEQ w porównaniu z poziomem TEQ. Zależnie od typu badania i zastosowanych TEF (12) różnice między czynnikami TEF i REP dla dioksynopodobnych PCB mogą spowodować niski odzysk dla dioksynopodobnych PCB w porównaniu z PCDD/F. Dlatego, jeżeli przeprowadzane jest odrębne oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, odzysk testu biologicznego powinien wynosić: dla dioksynopodobnych PCB: 20–60 %, dla PCDD/F: 50–130 % (zakresy stosowane są do krzywej wzorcowej TCDD). Ponieważ udział dioksynopodobnych PCB w sumie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB może różnić się zależnie od różnych matryc i próbek, odzyski testu biologicznego dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB odzwierciedlają te zakresy i powinny wynosić od 30 do 130 %. Każda znaczna zmiana wartości TEF w przepisach unijnych w odniesieniu do PCDD/F i dioksynopodobnych PCB wymaga zmiany tych zakresów.

7.1.5. Kontrola poziomów odzysku na potrzeby oczyszczania

Podczas walidacji należy sprawdzić stratę związków podczas oczyszczania. Ślepą próbkę wzbogaconą mieszaniną różnych kongenerów należy przekazać do oczyszczania (co najmniej n = 3), a odzysk i zmienność sprawdzić metodą potwierdzającą. Odzysk powinien wynosić od 60 do 120 % szczególnie dla kongenerów mających ponad 10 % udział w poziomie TEQ w różnych mieszaninach.

7.1.6. Poziom zgłaszania

Przy zgłaszaniu poziomów BEQ należy określić poziom zgłaszania na odpowiednich próbkach matrycy, obejmujących typowe profile kongenerów, ale nie z krzywej wzorcowej wzorców ze względu na niską precyzję w dolnym zakresie krzywej. Należy uwzględnić wpływy z ekstrakcji i oczyszczania. Poziom zgłaszania należy ustalić co najmniej o współczynnik 3 powyżej ślepej próbki proceduralnej.

7.2. Stosowanie próbek referencyjnych

7.2.1.

Próbki referencyjne reprezentują matrycę próbki, profile kongenerów i zakresy stężeń dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w granicach najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

7.2.2.

Do każdej serii badań włącza się ślepą próbkę matrycową lub, jeżeli to niemożliwe, ślepą próbkę proceduralną oraz próbkę referencyjną na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub na poziomie reagowania. Próbki te muszą zostać ekstrahowane i zbadane w tym samym czasie w identycznych warunkach. Próbka referencyjna musi dawać wyraźnie podwyższoną odpowiedź w porównaniu z próbką ślepą, gwarantując w ten sposób przydatność badania. Próbki te można zastosować do korekty ślepej próby i korekty odzysku.

7.2.3.

Próbki referencyjne wybrane do przeprowadzenia korekty odzysku muszą być reprezentatywne dla próbek badanych, co oznacza, że profile kongenerów nie mogą prowadzić do niedoszacowania poziomów.

7.2.4.

Można włączyć dodatkowe próbki referencyjne zawierające np. 0,5- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, aby wykazać właściwą wydajność badania – w zakresie zainteresowania – do celów kontroli najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Próbki te można zastosować łącznie do obliczania poziomów BEQ w próbkach badanych (zob. pkt 7.1.2.2).

7.3. Oznaczenie wartości granicznej

Należy ustalić relację między wynikami bioanalitycznymi wyrażonymi w BEQ a wynikami metody potwierdzającej wyrażonymi w TEQ (np. w drodze eksperymentów kalibracji przy zastosowaniu dopasowanej matrycy, z użyciem próbek referencyjnych wzbogaconych o 0-, 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu przy 6 powtórzeniach na każdym poziomie (n = 24). Z tej relacji można oszacować współczynniki korekty (ślepa próba i odzysk), jednak należy je sprawdzić zgodnie z pkt 7.2.2.

Należy ustalić wartości graniczne dla decyzji o zgodności próbki z najwyższymi dopuszczalnymi poziomami lub dla celów kontroli poziomów reagowania, jeżeli ma to znaczenie, przy odpowiednich najwyższych dopuszczalnych poziomach lub poziomach reagowania ustanowionych dla PCDD/F i dla dioksynopodobnych PCB osobno albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB. Są one reprezentowane przez dolną granicę rozkładu wyników bioanalitycznych (skorygowaną o wynik badania próbki ślepej i odzysk), odpowiadającą decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej w oparciu o 95 % poziom ufności, zakładając wskaźnik liczby wyników fałszywie negatywnych na poziomie < 5 % oraz RSDR < 25 %. Decyzyjna wartość graniczna metody potwierdzającej to najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Wartość graniczną (w BEQ) można obliczyć według jednego ze sposobów podanych w pkt 7.3.1, 7.3.2 oraz 7.3.3. (zob. rysunek 1).

7.3.1.

Zastosowanie dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej

gdzie:

BEQDL

wartość BEQ odpowiadająca decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej będącej najwyższym dopuszczalnym poziomem, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru

sy,x

odchylenie standardowe reszt

t α,f = m-2

czynnik Studenta (α = 5 %, f = stopnie swobody, jednostronne)

m

całkowita liczba punktów kalibracji (indeks j)

n

liczba powtórzeń na każdym poziomie

xi

stężenie próbki (w TEQ) w punkcie kalibracji i określone metodą potwierdzającą

średnia stężeń (w TEQ) wszystkich próbek kalibracji

parametr sumy kwadratów, i = indeks punktu kalibracji i

7.3.2.

Obliczenie z wyników bioanalitycznych (skorygowanych o próbę ślepą i odzysk) wielokrotnych analiz próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej, jako dolna granica dystrybucji danych przy odpowiadającej średniej wartości BEQ:

gdzie:

SDR

odchylenie standardowe wyników testu biologicznego przy BEQDL, mierzone w warunkach odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej

7.3.3.

Obliczenie jako średniej wartości wyników bioanalitycznych (w BEQ, skorygowanych o próbę ślepą i odzysk) z wielokrotnej analizy próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, oparte na obserwacji, że ten poziom będzie mieścił się w okolicach wartości granicznej oznaczonej zgodnie z pkt 7.3.1 lub 7.3.2:

Obliczenie wartości granicznych w oparciu o 95 % poziom ufności przy założeniu wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych na poziomie < 5 % oraz RSDR < 25 %:

1. z dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej;

2. z wielokrotnych analiz próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej, jako dolna granica dystrybucji danych (reprezentowana na rysunku przez krzywą dzwonową) przy odpowiadającej średniej wartości BEQ.

Rysunek 1

7.3.4.

Ograniczenia wartości granicznych

Wartości graniczne oparte na BEQ obliczone z RSDR uzyskanego podczas walidacji przy zastosowaniu ograniczonej liczby próbek o różnych profilach matryc/kongenerów mogą przekraczać najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania oparte na TEQ ze względu na lepszą precyzję niż precyzja osiągana rutynowo, kiedy trzeba kontrolować nieznane spektrum możliwych profili kongenerów. W takich przypadkach wartości graniczne należy obliczać z RSDR = 25 % lub należy wybrać 2/3 wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

7.4. Parametry wydajności

7.4.1.

Ponieważ w metodach bioanalitycznych niemożliwe jest stosowanie wzorców wewnętrznych, należy przeprowadzić badania powtarzalności metod bioanalitycznych pozwalające na uzyskanie informacji o odchyleniu standardowym w obrębie jednej serii badań i między tymi seriami. Powtarzalność musi być na poziomie poniżej 20 %, a odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna – poniżej 25 %. Wyniki te powinny opierać się na obliczonych poziomach w BEQ po korekcie próby ślepej i odzysku.

7.4.2.

Jako część procesu walidacji należy wykazać, że badania pozwalają na odróżnienie między próbą ślepą a poziomem wartości granicznej, umożliwiając identyfikację próbek powyżej odpowiadającej wartości granicznej (zob. pkt 7.1.2).

7.4.3.

Należy zdefiniować docelowe związki, możliwe interferencje oraz najwyższe tolerowane poziomy sygnału próby ślepej.

7.4.4.

Odchylenie standardowe procentowe w odpowiedzi lub stężeniu obliczonym z odpowiedzi (możliwe tylko w zakresie roboczym) potrójnego oznaczenia ekstraktu próbki nie może przekraczać 15 %.

7.4.5.

Do oceny wydajności metody bioanalitycznej w stałym okresie należy zastosować nieskorygowane wyniki próbek referencyjnych wyrażone w BEQ (próbka ślepa i najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania).

7.4.6.

Wykresy kontroli jakości dla ślepej próbki proceduralnej i każdego typu próbki referencyjnej należy zarejestrować i sprawdzić, aby upewnić się, że wydajność analityczna jest zgodna z wymogami, w szczególności dla ślepych próbek proceduralnych pod względem wymaganej minimalnej różnicy w dolnej granicy zakresu roboczego oraz dla próbek referencyjnych w odniesieniu do odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej. Ślepe próbki proceduralne muszą być dobrze kontrolowane, aby uniknąć wyników fałszywie negatywnych podczas odejmowania.

7.4.7.

Należy zgromadzić wyniki z analizy metodami potwierdzającymi podejrzanych próbek oraz 2–10 % próbek negatywnych (co najmniej 20 próbek na matrycę) i zastosować je do oceny wydajności metody przesiewowej oraz związku między BEQ i TEQ. Tę bazę danych można zastosować do ponownej oceny wartości granicznych stosowanej do rutynowych próbek dla zwalidowanych matryc.

7.4.8.

Wydajność metody można także wykazać przez uczestnictwo w badaniach biegłości. Wyniki z próbek analizowanych w badaniach biegłości, obejmujących zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu, mogą zostać włączone do oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie negatywnych, jeżeli laboratorium jest w stanie wykazać wydajność metody. Próbki muszą obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

7.4.9.

Podczas incydentów można ponownie ocenić wartości graniczne odzwierciedlające konkretne profile matryc i kongenerów danego incydentu.

8. PRZEDSTAWIANIE WYNIKÓW

8.1. Metody potwierdzające

8.1.1.

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, przy czym podaje się wartości TEQ zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

8.1.2.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.1.3.

Należy udostępnić dane na temat poziomów odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2.5, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom (w tym przypadku wartości odzysku dla jednej z dwóch analiz powtórnych), a w pozostałych przypadkach na żądanie.

8.1.4.

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać ten parametr. W związku z powyższym wyniki analizy należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U – niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje poziom ufności około 95 %. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.1.5.

Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

8.2. Bioanalityczne metody przesiewowe

8.2.1.

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako negatywny lub podejrzany o bycie pozytywnym (»podejrzany«).

8.2.2.

Ponadto można podać orientacyjny wynik dla PCDD/F lub dla dioksynopodobnych PCB wyrażony w BEQ, a nie w TEQ.

8.2.3.

Próbki dające odpowiedź poniżej poziomu zgłaszania należy oznaczyć jako »poniżej poziomu zgłaszania«. Próbki dające odpowiedź powyżej zakresu roboczego wskazuje się jako »przekraczające zakres roboczy«, a poziom odpowiadający górnej granicy zakresu roboczego podaje się w BEQ.

8.2.4.

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

8.2.5.

W sprawozdaniu należy podać zastosowany rodzaj badania, podstawowe zasady badania i rodzaj kalibracji.

8.2.6.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.2.7.

W przypadku próbek podejrzanych o bycie pozytywnymi sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

8.2.8.

Wyniki pozytywne zgłasza się wyłącznie w wyniku analizy potwierdzającej.

8.3. Fizykochemiczne metody przesiewowe

8.3.1.

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako negatywny lub podejrzany o bycie pozytywnym (»podejrzany«).

8.3.2.

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

8.3.3.

Ponadto można podać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB oraz wartości TEQ przedstawione zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności. Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

8.3.4.

Należy udostępnić dane na temat poziomów odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2.5, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom (w tym przypadku wartości odzysku dla jednej z dwóch analiz powtórnych), a w pozostałych przypadkach na żądanie.

8.3.5.

W sprawozdaniu należy podać zastosowaną metodę GC-MS.

8.3.6.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.3.7.

W przypadku próbek podejrzanych o bycie pozytywnymi sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

8.3.8.

Niezgodność można stwierdzić dopiero po przeprowadzeniu analizy potwierdzającej.

ROZDZIAŁ III

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK I WYMAGANIA DOTYCZĄCE METOD ANALIZY STOSOWANYCH W URZĘDOWEJ KONTROLI POZIOMÓW NIEDIOKSYNOPODOBNYCH PCB W PASZY

1. Zakres stosowania

Wymagania ustanowione w niniejszym rozdziale stosuje się w przypadku paszy analizowanej do celów urzędowych kontroli poziomów niedioksynopodobnych PCB oraz w odniesieniu do przygotowywania próbek oraz wymogów analitycznych do innych celów regulacyjnych, co obejmuje kontrole wykonywane przez podmiot działający na rynku pasz w celu zapewnienia zgodności z przepisami rozporządzenia (WE) nr 183/2005.

2. Możliwe metody oznaczania

Chromatografia gazowa/detekcja wychwytu elektronów (GC-ECD), GC-LMRS, GC-MS/MS, GC-HRMS lub metody równoważne

3. Identyfikacja i potwierdzenie analitów będących przedmiotem zainteresowania

3.1.

Względny czas retencji w stosunku do wzorców wewnętrznych lub referencyjnych (akceptowane odchylenie +/– 0,25 %)

3.2.

Rozdzielenie metodą chromatografii gazowej niedioksynopodobnych PCB od substancji interferujących, przede wszystkich współwymywających PCB, w szczególności jeżeli poziomy próbek mieszczą się w zakresie granic ustanowionych w przepisach i jeżeli należy potwierdzić niezgodność (13).

3.3.

Wymagania dla technik GC-MS

Monitorowanie co najmniej następującej liczby jonów molekularnych lub jonów charakterystycznych w klastrze molekularnym:

a) dwóch jonów o specyficznej wartości dla HRMS;

b) trzech jonów o specyficznej wartości dla LRMS;

c) dwóch określonych jonów macierzystych, z których każdy posiada jeden określony odpowiadający mu przejściowy jon potomny dla MS-MS.

Najwyższa dopuszczalna tolerancja dla stosunku abundancji dla wybranych fragmentów mas:

Względne odchylenie stosunku abundancji wybranych fragmentów mas od teoretycznej abundancji lub wzorca kalibracji dla jonu docelowego (monitorowany jon o największej abundancji) i jonów pomocniczych: ± 15 %.

3.4.

Wymagania dla technik GC-ECD

Wymagane jest potwierdzenie wyników przekraczających najwyższy dopuszczalny poziom przy pomocy dwóch kolumn GC z fazami stacjonarnymi o różnej polarności.

4. Wykazanie wydajności metody

Walidacja wydajności metody odbywa się w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu (0,5- do 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu) przy akceptowanym współczynniku zmienności dla powtarzanej analizy (zob. wymagania dotyczące precyzji pośredniej w pkt 9).

5. Granica oznaczalności

Suma LOQ (14) niedioksynopodobnych PCB nie może być wyższa niż jedna trzecia najwyższego dopuszczalnego poziomu (15).

6. Kontrola jakości

Regularne analizy próbek ślepych, analiza próbek wzbogaconych, próbek do kontroli jakości, uczestnictwo w międzylaboratoryjnych badaniach odpowiednich matryc

7. Kontrola poziomów odzysku

7.1.

Stosowanie właściwych wzorców wewnętrznych o właściwościach fizycznych i chemicznych porównywalnych z właściwościami analitów będących przedmiotem zainteresowania

7.2.

Dodanie wzorców wewnętrznych:

Dodanie do produktów (przed ekstrakcją i oczyszczaniem)

7.3.

Wymagania dla metod z wykorzystaniem wszystkich sześciu kongenerów niedioksynopodobnych PCB znakowanych izotopowo:

a) korekta wyników względem poziomów odzysku wzorców wewnętrznych;

b) poziomy odzysku wzorców wewnętrznych znakowanych izotopowo muszą mieścić się między 60 a 120 %;

c) akceptuje się niższe lub wyższe poziomy odzysku dla poszczególnych kongenerów, których udział w sumie niedioksynopodobnych PCB wynosi poniżej 10 %.

7.4.

Wymagania dla metod niewykorzystujących wszystkich sześciu wzorców wewnętrznych znakowanych lub wykorzystujących inne wzorce wewnętrzne:

a) kontrola odzysku wzorców wewnętrznych dla każdej próbki;

b) poziomy odzysku wzorców wewnętrznych między 60 a 120 %;

c) korekta wyników względem poziomów odzysku wzorców wewnętrznych.

7.5.

Poziomy odzysku kongenerów nieznakowanych należy sprawdzić przez próbki wzbogacone lub próbki do kontroli jakości o stężeniach w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu. Poziomy odzysku tych kongenerów należy uznać za akceptowalne, jeżeli mieszczą się pomiędzy 60 a 120 %.

8. Wymagania dotyczące laboratoriów

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (UE) 2017/625 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z wytyczną ISO/IEC 58, aby zapewnić, że przy przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. Ponadto należy stosować zasady opisane w wytycznych technicznych dotyczących szacowania niepewności pomiaru i granic oznaczalności w odniesieniu do analizy PCB (16).

9. Parametry wydajności: kryteria dla sumy niedioksynopodobnych PCB na najwyższym dopuszczalnym poziomie

Spektrometria mas z rozcieńczeniem izotopowym (*2)

Inne techniki

Poprawność

–20 do +20 %

–30 do +30 %

Precyzja pośrednia (RSD %)

≤ 15 %

≤ 20 %

Różnica między obliczeniem uzyskanym metodą granicy oznaczalności a obliczeniem uzyskanym metodą zerową

≤ 20 %

≤ 20 %

10. Przedstawianie wyników

10.1.

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych niedioksynopodobnych PCB oraz sumę kongenerów tych PCB przedstawionych zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

10.2.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCB.

10.3.

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 7, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

10.4.

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki analizy należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U – niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje poziom ufności około 95 %.

10.5.

Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

B) NORMY EN

Do celów stosowania art. 34 ust. 2 lit. a) rozporządzenia (UE) 2017/625 istotne są następujące normy EN:

EN 17194: Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie deoksyniwalenolu, aflatoksyny B1, fumonizyn B1 i B2, toksyn T-2 i HT-2, zearalenonu i ochratoksyny A w materiałach i mieszankach paszowych metodą LC-MS/MS

EN 17270: Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie teobrominy w materiałach paszowych i mieszankach paszowych, włącznie ze składnikami pochodzącymi z kakao, metodą chromatografii cieczowej

EN 17504 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz. Oznaczanie gossypolu w nasionach bawełny i paszach metodą LC-MS/MS

EN 17362 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pentachlorofenolu (PCP) w materiałach paszowych i mieszankach paszowych metodą LC-MS/MS

EN 16279: Pasze – Oznaczanie zawartości fluorku metodą elektrody jonoselektywnej (ISE) po wcześniejszym traktowaniu kwasem chlorowodorowym

EN 17053: Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie pierwiastków śladowych, metali ciężkich i innych pierwiastków w paszy metodą ICP-MS (metoda wielopierwiastkowa)

EN 15550 Pasze – Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie kadmu i ołowiu metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z zastosowaniem kuwety grafitowej (GF-AAS) po mineralizacji ciśnieniowej

EN 16206 Pasze – Oznaczanie arsenu metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z generowaniem wodorków (HGAAS) po trawieniu ciśnieniowym z zastosowaniem mikrofal (trawienie 65 % kwasem azotowym(V) i 30 % nadtlenkiem wodoru)

EN 16277 Pasze – Oznaczanie rtęci metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z wykorzystaniem zimnych par (CVAAS) po trawieniu ciśnieniowym z zastosowaniem mikrofal (ekstrakcja z użyciem 65 % kwasu azotowego(V) i 30 % nadtlenku wodoru)

EN 16278 Pasze – Oznaczanie nieorganicznego arsenu metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej z generowaniem wodorków (HG-AAS) po trawieniu z wykorzystaniem mikrofal i rozdziale przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)

EN 17374 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz – Oznaczanie nieorganicznego arsenu w paszach z zastosowaniem anionowymiennej wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną HPLC-ICP-MS

”

(1) Tabela TEF (= współczynnik równoważny toksyczności) dla PCDD, PCDF i dioksynopodobnych PCB: WHO-TEF dla oceny zagrożenia dla ludzi, na podstawie konkluzji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) – spotkanie ekspertów Międzynarodowego Programu Bezpieczeństwa Chemicznego (IPCS), które odbyło się w Genewie w czerwcu 2005 r. (Martin van den Berg et al., »The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds« (Ponowna ocena współczynników równoważnych toksyczności dla ludzi i ssaków w odniesieniu do dioksyn i związków dioksynopodobnych, przeprowadzona w 2005 r. przez Światową Organizację Zdrowia), Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Kongener

Wartość TEF

Kongener

Wartość TEF

Dibenzo-p-dioksyny (»PCDD«) i dibenzo-p-furany (»PCDF«)

»Dioksynopodobne« PCB

Non-orto PCB + Mono-orto PCB

2,3,7,8-TCDD

1

1,2,3,7,8-PeCDD

1

Non-orto PCB

1,2,3,4,7,8-HxCDD

0,1

PCB 77

0,0001

1,2,3,6,7,8-HxCDD

0,1

PCB 81

0,0003

1,2,3,7,8,9-HxCDD

0,1

PCB 126

0,1

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

0,01

PCB 169

0,03

OCDD

0,0003

Mono-orto PCB

2,3,7,8-TCDF

0,1

PCB 105

0,00003

1,2,3,7,8-PeCDF

0,03

PCB 114

0,00003

2,3,4,7,8-PeCDF

0,3

PCB 118

0,00003

1,2,3,4,7,8-HxCDF

0,1

PCB 123

0,00003

1,2,3,6,7,8-HxCDF

0,1

PCB 156

0,00003

1,2,3,7,8,9-HxCDF

0,1

PCB 157

0,00003

2,3,4,6,7,8-HxCDF

0,1

PCB 167

0,00003

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF

0,01

PCB 189

0,00003

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF

0,01

OCDF

0,0003

Zastosowane skróty: »T« = tetra (cztero); »P« = penta (pięcio); »Hx« = heksa (sześcio); »Hp« = hepta (siedmio); »O« = okta (ośmio); »CDD« = chlorodibenzodioksyna; »CDF« = chlorodibenzofuran; »CB« = chlorobifenyl.

(2) Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/808 z dnia 22 marca 2021 r. w sprawie wydajności metod analitycznych w odniesieniu do pozostałości substancji farmakologicznie czynnych stosowanych u zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność, oraz interpretacji wyników, jak również w sprawie metod stosowanych do pobierania próbek oraz uchylające decyzje 2002/657/WE i 98/179/WE (Dz.U. L 180 z 21.5.2021, s. 84).

(3) W stosownych przypadkach należy przestrzegać zasad opisanych w »Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry« (Wytyczne dotyczące niepewności pomiaru dla laboratoriów wykonujących analizę PCDD/F i PCB z zastosowaniem spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym) (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf).

(4) Koncepcja »metody granicy oznaczalności« (ang. upper-bound) zakłada przyjęcie wartości równej granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów. Koncepcja »metody zerowej« (ang. lower-bound) zakłada przyjęcie wartości równej zero dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów. Koncepcja »metody połowy granicy oznaczalności« (ang. medium-bound) zakłada przyjęcie wartości równej połowie granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów.

(5) Analiza powtórna: odrębna analiza danych analitów przy użyciu drugiej podwielokrotnej części tej samej zhomogenizowanej próbki. Generalnie zastosowanie mają wymagania dotyczące analizy powtórnej określone w załączniku II rozdział C pkt 3. Jednak w przypadku metod przy użyciu wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem węgla 13C dla odpowiednich analitów analiza powtórna jest konieczna jedynie wówczas, gdy w pierwszym oznaczeniu uzyskano wynik niezgodny z wymogami. Analiza powtórna jest konieczna do wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Jeżeli analiza przeprowadzana jest w ramach przypadku wystąpienia zanieczyszczenia, można zrezygnować z potwierdzenia wyników w drodze analizy powtórnej, jeżeli próbki wybrane do analizy można powiązać z przypadkiem wystąpienia zanieczyszczenia na podstawie identyfikowalności produktu, a stwierdzony poziom jest znacznie wyższy od najwyższego dopuszczalnego poziomu.

(6) Koncepcja »metody granicy oznaczalności« zakłada przyjęcie wartości równej granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w równoważniku toksyczności (TEQ). Koncepcja »metody zerowej« zakłada przyjęcie wartości równej zero dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w TEQ. Koncepcja »metody połowy granicy oznaczalności« zakłada przyjęcie wartości równej połowie granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w TEQ.

(7) Generalnie zastosowanie mają wymagania dotyczące analizy powtórnej określone w załączniku II rozdział C pkt 3. Jednak w przypadku metod potwierdzających przy użyciu wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem węgla 13C dla odpowiednich analitów powtórna analiza jest konieczna jedynie wówczas, gdy w pierwszym oznaczeniu uzyskano wynik niezgodny z wymogami. Analiza powtórna jest konieczna do wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Jeżeli analiza przeprowadzana jest w ramach przypadku wystąpienia zanieczyszczenia, można zrezygnować z potwierdzenia wyników w drodze analizy powtórnej, jeżeli próbki wybrane do analizy można powiązać z przypadkiem wystąpienia zanieczyszczenia na podstawie identyfikowalności produktu, a stwierdzony poziom jest znacznie wyższy od najwyższego dopuszczalnego poziomu.

(8) Identyczne wyjaśnienie i wymagania dla analizy powtórnej na potrzeby kontroli poziomów reagowania jak w przypisie 33 powyżej w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów.

(9) Rozporządzenie (WE) nr 183/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 12 stycznia 2005 r. ustanawiające wymagania dotyczące higieny pasz (Dz.U. L 35 z 8.2.2005, s. 1).

(10) Metody bioanalityczne nie są swoiste dla kongenerów objętych schematem TEF. W ekstrakcie próbki mogą być obecne inne związki strukturalnie powiązane ze związkami aktywującymi receptor AhR, które przyczyniają się do ogólnej odpowiedzi. Dlatego wyniki uzyskane metodami bioanalitycznymi nie mogą być traktowane jako szacunki, ale raczej jako wskazanie poziomu TEQ w próbce.

(11) »Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry« (Wytyczne dotyczące niepewności pomiaru dla laboratoriów wykonujących analizę PCDD/F i PCB z zastosowaniem spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym) (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf), »Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food« (Wytyczne dotyczące szacowania LOD i LOQ na potrzeby pomiarów w dziedzinie zanieczyszczeń w paszy i żywności) (https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/cs_contaminants_sampling_analysis-report_2004_en.pdf).

(*1) W odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów.

(12) Aktualne wymogi są oparte na TEF opublikowanych w: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

(13) Kongenery, które są często współwymywane, to np. PCB 28/31, PCB 52/69 oraz PCB 138/163/164. W przypadku GC-MS należy rozważyć także ewentualne interferencje z fragmentów wyżej chlorowanych kongenerów.

(14) W stosownych przypadkach korzysta się z zasad opisanych w dokumencie »Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food« [https://data.europa.eu/doi/10.2787/8931].

(15) Zaleca się, aby w próbce znajdował się niższy poziom odczynnika próbki ślepej względem poziomu zanieczyszczenia. Laboratorium odpowiada za kontrolowanie zróżnicowania poziomów próbki ślepej, w szczególności jeżeli poziomy próbki ślepej są odejmowane.

(16) Zob. przypis 37.

(*2) Wymagane wykorzystanie wszystkich sześciu analogów znakowanych izotopem węgla 13C jako wzorców wewnętrznych.